抗人卵巢癌-抗人CD3单链双特异性抗体体外介导的细胞毒作用及其机制

目的了解抗人卵巢癌-抗人CD3（BHL—I）单链双特异性抗体（scBsAb）体外介导的外周血淋巴细胞（PBL）对靶细胞SKOV3的细胞毒作用及可能的机制。方法二苯基溴化四氮唑蓝（MTr）法检测BHL-I体外介导PBL对SKOV3细胞的杀伤作用；逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测BHL—I介导的细胞毒作用过程中效应细胞PBL对穿孔素（perforin）、颗粒酶（GrB）mRNA表达的影响；酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子-α（hTNF—α）和人干扰素-γ（hIFN-γ）含量的变化。结果BHL-I体外介导PBL对SKOV3细胞的细胞毒作用显著高于对MCF-7细胞的作用（P〈0.01），并且在效靶比为12．5：1、作用时间为36h、BHL-I浓度为25μg/ml时，PBL对靶细胞的细胞毒作用最为显著；BHL—I体外介导的细胞毒作用中，PBL表达perforin、GrBmRNA及混合细胞培养上清液中hTNF—α和hIFN-γ的含量均显著升高，并且白介素2（IL-2）的存在有利于这些因子的表达。结论BHL—I介导PBL对靶细胞的细胞毒作用具有一定的特异性，并且IL-2能增强BHL—I介导PBL的细胞毒作用。     

双功能抗体抗CD3/抗CD19介导T细胞对靶细胞的杀伤作用

背景与目的:双功能抗体有2个抗原结合臂,一方面具有肿瘤相关抗原,另一方面具有和免疫效应细胞表面分子标记结合的能力,并能有效地使效应细胞靶向杀火肿瘤细胞的作用.本实验探讨抗CD3/抗CD19双功能抗体介导T细胞杀伤靶细胞的作用.方法:利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性榆测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞作为效应细胞.首先以Raji细胞为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度分组,以PBS、抗CD3scFv+、抗CD3scFv抗体及非相关抗体抗CD3/抗PGP为对照,另设CD19-K562细胞为非相关靶细胞组,比较双功能抗体介导特异性体外杀伤活性.取上述杀伤实验效靶比25:1,抗体浓度500 ng/mL各组,ELISA法比较激活的T细胞分泌IL-2的量,Real-time PcR法检测T细胞因子IL-3、IFN-γ、TNF-α激活后的表达变化.结果:体外介导T细胞杀伤靶细胞Raji的效果比对照组明显增强(P＜0.05),激活T细胞分泌IL-2、IL-3、IFN-γ及TNF-α的表达均明显高于对照组.结论:双功能抗体抗CD3/抗CD19在体外介导T细胞对靶细胞具有较强的杀伤作用.     

卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magnetic activated cell sorting，MACS)分离纯化正常人外周血CD3^ 细胞，体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响；MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力；利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用，且存在时间依赖性，在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68．38％，显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18．31％)；而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61．02％和14．79％，有显著的抗原特异性(P=0．0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。     

格尔德霉素对人卵巢癌细胞SKOV3增殖和凋亡的影响及其机制探讨

目的:研究格尔德霉素(geldanamycin,GA)对人卵巢癌SKOV3细胞的体外抑制作用,探讨GA抑制SKOV3细胞增殖及诱导其凋亡的可能机制。方法:MTT法检测GA单独或联合顺铂(cisplatin)对SKOV3细胞的增殖抑制作用;FCM法检测GA作用后SKOV3细胞周期及凋亡率的变化;分别应用免疫细胞化学法(immunocytochemistory,ICC)和FCM法检测GA处理SKOV3细胞48h后细胞内Akt、Raf-1蛋白的表达变化。结果:GA对SKOV3细胞的体外增殖可产生明显的抑制作用(P<0.05),该作用随着GA浓度的增高和作用时间的延长而增强。而且,GA可增强顺铂对SKOV3细胞的增殖抑制作用,在一定浓度范围内随着GA浓度的增高,两药联合应用对SKOV3细胞的增殖抑制作用越强。经0～2000nmol/L GA作用SKOV3细胞48h后,G2/M期细胞逐渐增多,细胞凋亡率也显著升高(P<0.05)。ICC和FCM法检测结果均表明,经0～2000nmol/L GA处理48h后,SKOV3细胞中Akt、Raf-1蛋白的表达水平随着药物浓度增高而逐渐降低(P<0.05)。结论:GA能够对卵巢癌SKOV3细胞产生明显的体外增殖抑制作用,并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调卵巢癌细胞中Akt和Raf-1蛋白表达相关。     

树突状细胞体外诱导抗卵巢癌免疫反应

目的 研究卵巢癌患者外周血树突状细胞(DC)在体外能否诱导出抗卵巢癌免疫反应。方法 自卵巢癌患者外周血中分离出DC;以人卵巢癌细胞系SKOV3细胞肿瘤抗原粗提物激活DC;以粒/巨噬细胞集落刺激因子及白介素—4联合刺激DC;DC诱导自体混合T淋巴细胞增殖、分化为细胞毒性T细胞(CTL);检测CTL对SKOV3细胞、CAOV3细胞、HepG2细胞及HOS—8603细胞的细胞毒作用。结果 卵巢癌患者DC体外能够诱导自体混合T淋巴细胞增殖、分化为CTL,CTL对SKOV3细胞及CAOV3细胞均有较强杀伤力(89％±12％及62％±9％),而对HepG2细胞和HOS—8603细胞仅有微弱杀伤力(12％±4％和10％±5％)。结论 卵巢癌患者外周血DC在体外能够诱导高效而特异抗卵巢癌免疫。     

可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白诱导非特异性抗肿瘤免疫

目的:观察可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白对体外非特异性抗肿瘤免疫的影响。方法:以含sCD80-Lin- ker-sCD40L、sCD80、sCD40L编码基因的重组腺病毒载体或对照病毒载体转染人卵巢癌细胞SKOV3,ELISA检测上清中可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白及sCD80、sCD40L蛋白的表达。由卵巢癌患者外周血单个核细胞培养树突状细胞(dendritic cells,DCs),将DCs和自体T细胞共同培养并加入不同上清诱导48h;用异基因混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)检测诱导的DCs刺激淋巴细胞增殖能力;以诱导的T细胞为效应细胞,SKOV3细胞或K562细胞为非特异性靶细胞,通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogemse,LDH)释放实验检测杀伤活性。结果:ELISA检测证实病毒转染SKOV3细胞上清中sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白、sCD80蛋白和sCD40L蛋白表达量分别为2.791 ng/ml、1.956 ng/ml和1.407 ng/ml。MLR证实,与对照相比,融合蛋白上清诱导的DCs[刺激-反应细胞比例1:100,(0.382±0.053)vs(0.167±0.028),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:50,(0.636±0.164)vs(0.311±0.067),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:10,(1.245±0.271)vs(0.423±0.156),P<0.01]和sCD40L上清诱导的DCs[刺激-反应细胞比例1:100,(0.341±0.062)vs(0.167±0.028),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:50,(0.567±0.106)vs(0.311±0.067),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:10,(1.098±0.263)vs(0.423±0.156),P<0.01]刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖能力明显增强。LDH释放实验提示,sCD40L上清诱导的T淋巴细胞对靶细胞非特异性杀伤活性显著强于对照SKOV3组[(42.28±6.27)vs(22.49±3.56),P<0.01]和K562组(47.94±6.72)vs (26.33±2.89),P<0.01],而融合蛋白上清诱导的T淋巴细胞对靶细胞非特异性杀伤活性显著强于sCD40L上清诱导的T淋巴细胞[sKOV3组为(58.97±8.92)vs(42.28±6.27),P<0.05;K562组为(66.55±9.43)vs(47.94±6.72),P<0.05]。结论:可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白能有效诱导体外非特异性抗肿瘤免疫,对肿瘤免疫治疗具有潜在应用价值。     

CIK细胞联合顺铂对卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP的杀伤作用

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞联合顺铂对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CD-DP小鼠腹腔移植模型的体内外杀伤作用。方法：取正常人的外周血单个核细胞（PBMC）,加入IFN-γ、IL-2、CD3McAb和IL-1,体外诱导成CIK细胞。用MTT法测定CIK细胞、顺铂及两者联合对人卵巢癌细胞株SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性。在SCID小鼠腹腔内接种卵巢癌SKOV3/CDDP细胞,观察CIK细胞对荷瘤鼠的体内抑瘤作用,并用RIA法检测各组血清中CA125的含量。结果：顺铂对SKOV3/CDDP细胞的IC50为315.5μg/ml,较其对SKOV3细胞的IC50（85μg/ml）增加了4倍;CIK细胞对SKOV3与SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性均在48h最高,且随效靶比的增高而增强,其对SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性明显高于SKOV3（P〈0.05）。仅25μg/ml的顺铂即可使效靶比为12.5∶1组中的联合杀伤率比单纯顺铂组增加5.8倍,比单纯加CIK（相同效靶比）细胞杀伤率增加2.3倍,且随效靶细胞比值和顺铂浓度的升高呈依赖性增加。与对照组相比,CIK组与CIK＋顺铂组均能显著抑制癌性结节的生长,抑瘤率达100%,且3组SCID鼠血中CA125值有显著性差异（P〈0.05）。结论：正常人CIK细胞联合顺铂对清除晚期卵巢癌表达耐药蛋白的腹腔种植转移病灶可能会有较好的效果,并有希望成为前景良好的综合治疗方案。     

双特异性单抗GP95×CD3介导T细胞对人肝癌的杀伤作用

为了解双特异性单克隆抗体(BiMcAb)能否在体外介导人T细胞对肝癌的免疫杀伤效应,本文通过杂交-杂交瘤方法将分泌抗原发性肝癌单抗杂交瘤(αGP95 )与抗人T细胞CD3单抗杂交(αCD3)融合后获得双功能单抗(CP95 × CD3),后者既能与T细胞CD3结合又能与肝癌细胞表面相关抗原结合.用人外周血淋巴细胞(PBL)作为效应细胞(E),以国人原发性肝癌细胞株7721作为靶细胞(T).杀伤试验采用~51Cr释放试验.研究共分5组:G1:7721 GP95 × CD3,G2:7721十PBL,G3:7721 PBL GP95×CD3,C4:7721 PBL GP115×CD3(抗人结肠癌双功能单抗作对照),G5:7721 PBL αGP95 αCD-3.结果:G1 组因无效应细胞存在,即为自然释放率.     

c-erbB-2反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV_3细胞增殖的抑制作用

目的探讨c-erbB-2基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法实验分空白对照组、正常对照组、c-erbB-2正义对照组及c-erbB-2反义治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定,以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果反义治疗组与正义对照组比较:转染72hOD值分别为0.201与1.298(P<0.01);克隆形成率分别为26.5%与76.5%(P<0.05);凋亡率分别为21.3%与7.5%(P<0.05),同时明显地下调c-erbB-2蛋白质的表达水平(P<0.05)。结论在卵巢癌的基因治疗中,c-erbB-2反义寡核苷酸能明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖。     

抗人P185 erbB2 scFv-Fc-IL-2调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞

将抗人P185erbB2scFvFcIL2融合蛋白（HFI）作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞（PBMC）,通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制,为HFI临床应用提供实验依据。〖HT5W〗方法： 〖HT5"SS〗MTT法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术观察细胞表面分子的表达水平;生物活性法检测细胞膜相关TNF杀伤活性;RTPCR检测细胞穿孔素表达水平。〖HT5W〗结果： 〖HT5"SS〗HFI处理后,未观察到对SKOV3细胞增殖活性的直接抑制作用;SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM1、Fas表达率分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%（P<0.01);人PBMC的增殖活性增强,CD3+CD8+T细胞和CD3CD16+CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%（P<0.01);CD25、LFA1、FasL表达水平分别由399%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06% 16.19%（P<0.01);穿孔素基因、膜相关TNF均表达增强,LAK样、NK样杀伤活性在各效靶比时均明显增高（P<0.01)。〖HT5W〗结论： 〖HT5"SS〗HFI提高SKOV3细胞杀伤相关分子ICAM1、Fas表达水平,并且对人PBMC有明显的增殖活化作用,通过激活LFA1/ICAM1、Fas/FasL途径提高杀伤介质穿孔素和膜相关TNF的释放,增强LAK样、NK样杀伤活性。     

Proportion of CD4+CD25+ regulatory T cell is increased in the patients with ovarian carcinoma

Objective: To study the frequency of the CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells (Tregs) in the patients with ovarian carcinoma and its possible mechanism. Methods: The percentages of CD4⁺CD25⁺ Tregs in the peripheral blood lymphocytes (PBLs), tumor infiltrating lymphocytes (TILs) and tumor associated lymphocytes (TALs) from 13 patients with ovarian carcinoma and in the PBLs from 14 healthy women were determined by flow cytometry. The expression of CD69 on CD4⁺PBLs from the patients was detected. PBLs from healthy women were cultured in complete RPMI 1640 containing the supernatant from SKOV3 cell line with or without PHA (phytohemagglutinin) stimulation for 72 hours, then the percentage of CD4⁺CD25⁺ T cells was detected. Results: CD4⁺CD25⁺ Tregs in the PBLs from patients with ovarian carcinoma were significantly increased compared with those from the control. The percentage of CD4⁺CD25⁺ Tregs in TILs was higher than that in PBLs and TALs from the patients, but not significantly. The expression of CD69 on CD4⁺PBLs from the patients was negative. The percentages of CD4⁺CD25⁺ T cells in PBLs cultured with SKOV3 supernatant elevated significantly compared with those without supernatant whether PHA was added or not (P = 0.001 and 0.001, respectively). Conclusion: There is an increasing of the proportion of CD4⁺CD25⁺ Tregs in PBLs, TILs and TALs of the patients with ovarian carcinoma, which probably results from up-regulation of soluble factor secreted by ovarian carcinoma cells.     

IL-12转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及其机制

背景与目的:卵巢恶性肿瘤发病率、复发率、转移率均较高,有研究表明IL-12具有明显的抗肿瘤作用.本研究探讨白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)对人卵巢癌SKOV3细胞生长抑制作用机制及其对裸鼠皮下种植瘤成瘤能力的影响.方法:应用脂质体转染技术将含有小鼠IL-12全长基因的质粒转染到SKOV3细胞(SKOV3/IL-12组),同时以空白质粒载体转染SKOV3细胞(SKOV3/neo组)和未转染SKOV3细胞作为对照.ELISA法检测3组细胞上清中IL-12表达.MTT法检测3组SKOV3细胞的抑制率和细胞倍增时间.建立裸鼠皮下卵巢癌种植模型,分别接种SKOV3/IL-12、SKOV3/neo、SKOV3细胞,观察肿瘤生长情况.ELISA法检测裸鼠血清中IL-12及γ-干扰素(gamma interferon,IFN-γ)的表达,免疫组化法检测裸鼠种植瘤中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、微血管密度(microvessel density,MVD)及干扰素诱生蛋白-10(IFN-gamma-inducible protein 10,IP-10)的表达.结果:转染48、60 h后细胞上清中IL-12蛋白表达量,SKOV3/IL-12组[(473.0±38.0)pg/ml、(522.0±32.0)pg/ml]高于SKOV3/neo组[(16.0±1.3)pg/ml、(18.0±1.6)pg/ml]及SKOV3组[(16.0±1.2)pg/ml、(17.0±1.4)pg/ml](P＜0.01).SKOV3/IL-12组细胞增殖抑制率为63.7%,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),SKVO3/IL-12组细胞倍增时间(45.8±2.7)h明显长于SKOV3/neo细胞组(27.6±2.2)h和SKOV3组(28.2±2.1)h(P＜0.01).裸鼠皮下卵巢癌种植模型中,SKOV3/IL-12组裸鼠成瘤率(5/8)低于对照组(8/8)(P＜0.01);平均成瘤时间[(15.0±5.0)天]长于SKOV3/neo组[(7.9±3.2)天]和SKOV3组[(7.8±2.4)天](P＜0.01);SKOV3/IL-12组种植瘤体积、重量和裸鼠体重低于SKOV3/neo组和SKOV3组(P＜0.01),种植瘤生长速度缓慢,抑瘤率达61.3%.SKOV3/IL-12组裸鼠血清中IL-12、IFN-γ表达量高于SKOV3/neo组和SKOV3组(P＜0.01).SKOV3/IL-12组裸鼠种植瘤中IP-10阳性率(100%)高于对照组(P＜0.01),VEGF阳性率(62.5%)及MVD低于对照组(P＜0.01).结论:转染IL-12能有效地抑制SKOV3细胞生长;转染IL-12的SKOV3/IL-12细胞在裸鼠皮下的成瘤能力降低;IL-12可通过诱导IFN-γ诱生IP-10抑制肿瘤血管形成而实现其抗卵巢癌的作用.     

Lymphokine-activated killer activity of tumor-associated and peripheral blood lymphocytes isolated from patients with ascites ovarian tumors

Peripheral blood lymphocytes (PBLs) and tumor-associated lymphocytes (TALs) were isolated from 36 patients with advanced ovarian adenocarcinoma and peritoneal effusions for study of lymphokine-activated killer activity. PBLs and TALs cultured in vitro for 3-5 days in the presence of interleukin-2 (IL-2, supernatant of the MLA 144 gibbon cell line, or human recombinant IL-2) expressed higher levels of cytotoxicity as compared to cells cultured in medium alone, against natural killer (NK)-susceptible (K562) or NK-resistant targets (Daudi and the human ovarian carcinoma cell line SW626). When ovarian tumor cells, freshly isolated from carcinomatous ascites or surgical specimens, were used as target cells in the cytotoxicity assay, 8 of 14 PBLs and 5 of 7 TAL preparations lysed the autologous tumor after treatment with IL-2, while no spontaneous reactivity was observed in any of the 14 patients tested. Although levels of lysis were usually relatively low, these data demonstrate that PBLs and TALs from ovarian cancer patients (TALs usually exhibiting low NK activity) when stimulated in vitro by IL-2 acquire some cytotoxic potential against the autologous tumor.     

Anti Tumoral Properties of Punica granatum (Pomegranate) Seed Extract in Different Human Cancer Cells

Background: Punica granatum (PG) has been demonstrated to possess antitumor effects on various types of cancer cells. In this study, we determined antiproliferative properties of a seed extract of PG (PSE) from Iran in different human cancer cells. Materials and Methods: A methanolic extract of pomegranate seeds was prepared. Total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC) were assessed by colorimetric assays. Antioxidant activity was determined with reference to DPPH radical scavenging activity. The cytotoxicity of different doses of PSE (0, 5, 20, 100, 250, 500, 1000 g/ml) was evaluated by MTT assays with A549 (lung non small cell carcinoma), MCF-7 (breast adenocarcinoma), SKOV3 (ovarian cancer cells), and PC-3 (prostate adenocarcinoma) cells. Results: Significant (P<0.01) or very significant (P<0.0001) differences were observed in comparison to negative controls at all tested doses (5-1000 g/ml). In all studied cancer cells, PSE reduced the cell viability to values below 23%, even at the lowest doses. In all cases, IC50 was determined at doses below 5 g/ml. In this regard, SKOV3 ovarian cancer cells were the most responsive to antiproliferative effects of PSE with a maximum mean growth inhibition of 86.8% vs. 82.8%, 81.4% and 80.0% in MCF-7, PC-3 and A549 cells, respectively. Conclusions: Low doses of PSE exert potent antiproliferative effects on different human cancer cells SKOV3 ovarian cancer cells as most and A549 cells ar least responsive regarding cytotoxic effects. However, the mechanisms of action need to be addressed.     

多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因抑制卵巢癌细胞生长的体外研究

背景与目的目前基因治疗领域的关键技术问题是如何提高基因载体的转导效率和靶向性。近年来以一种新的多聚阳离子化合物—多聚乙烯基亚胺(polyethylenimine,PEI)作为载体为基因转移提供了一条有效的新思路。本研究应用PEI介导卵巢特异性启动子OSP-1调控下的自杀基因HSV-tk体外处理人卵巢癌细胞SKOV3,观察其抗瘤效应和靶向性。方法(1)将pGL3-Luc质粒分别介导多聚乙烯基亚胺PEI、脂质体DOTAP和裸DNA转染人卵巢癌细胞SKOV3,检测荧光素酶表达RLU(relativeluciferaseunit);(2)利用PEI将卵巢特异性启动子调控下的真核表达质粒pOSP1-HSVtk导入人卵巢癌细胞SKOV3、人肝癌细胞SMMC7721,应用MTT法测定更昔洛韦(ganciclovir,GCV)对两种肿瘤细胞的毒性;高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测GCV在SKOV3的细胞内代谢;流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶原位标记(TdT-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡。结果(1)PEI组的荧光素酶表达活性最高(187.35±6.48),与另两组相比(45.74±5.98,0.03±0.00),有显著性差异(P<0.01);(2)GCV对SKOV3细胞呈现明显的细胞毒性,对SMMC7721细胞没有产生细胞毒性;HPLC检测显示随着作用时间的延长,细胞内GCV水平逐渐下降;流式细胞仪显示转染pOSP1-HSVtk质粒的SKOV3细胞经GCV作用24、48、72h后,凋亡率分别为(8.42±0.76)%、(18.50±1.78)%、(34.80±3.46)%,呈明显的增高趋势;TUNEL检测SKOV3细胞可见大量凋亡细胞。结论多聚乙烯基亚胺介导卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌有特异的体外杀伤作用,有助于提高基因治疗的有效性和靶向性。     

自噬基因Beclin1与上皮性卵巢癌发生、发展的相关性研究

背景与目的:有研究表明自噬的抑制与肿瘤的发生有关,沉默自噬基因Beclin1可导致多种恶性肿瘤的发生.本研究探讨Beclin1基因在上皮性卵巢癌发生、发展中的作用,并分析其过表达对人卵巢癌细胞株SKOV3体外生长的影响.方法:用免疫组化检测25例正常卵巢组织、25例良性上皮性卵巢肿瘤、19例交界性上皮性卵巢肿瘤及69例上皮性卵巢癌组织的Beclin1表达;构建真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,脂质体法分别将质粒pcDNA3.1/Beclin1、pcDNA3.1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,用MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,并用流式细胞仪检测凋亡情况.结果:正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织中Beclin1表达的积分光密度(integrated optical density,IOD)值均较高,两者之间的差异无显著性(P＞0.05);交界性卵巢肿瘤组织中Beclin1的表达降低,而在上皮性卵巢癌中Beclin1表达的IOD值最低,与正常卵巢组织比较差异有显著性(P＜0.05).ocDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后细胞生长抑制率为(68.75±5.10)%,而pcDNA3.1转染组为(10.91±4.20)%,两者之间差异有显著性(P＜0.05).pcDNA3.1/Beclin1转染后72 h SKOV3细胞的凋亡率为19.07%,高于pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P＜0.05).结论:Beclin1在上皮性卵巢癌中的表达下调,可能与上皮性卵巢癌的发生、发展有关;自噬基因Beclin1的过表达可抑制人卵巢癌细胞SKOV3的增殖,并诱导其凋亡.     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞 SKOV3的抑制作用

背景与目的:在大多数肿瘤组织中都发现了 survivin的异常高表达,这说明 survivin在肿瘤发生中具有重要作用.本研究探讨 survivin反义寡核苷酸 (survivin ASODN)对人卵巢癌细胞 SKOV3的抑制作用及其机制.方法:脂质体介导 survivin反义寡核苷酸转染 SKOV3,用 MTT法检测细胞抑制率. Western blot法检测相关基因蛋白表达,应用流式细胞术、梯形 DNA片段分析及 DAPI染色光镜观察细胞凋亡情况.激酶活性检测方法测定半胱氨蛋白水解酶 3( caspase-3)活性的变化.结果:脂质体介导 survivin反义寡核苷酸转染后, SKOV3细胞的生长受到明显抑制, 1 000 ng/ml ASODN转染组的细胞抑制率为( 60.30± 2.95)%,明显高于对照组( P< 0.05).凋亡细胞比率由转染前的 0.65%增加至 32.10% ,SKOV3细胞内 survivin基因蛋白表达下调 26.3%, caspase-3活性为 0.998± 0.001,较对照组显著增高( P< 0.01).结论: Survivin ASODN可通过诱导细胞凋亡抑制细胞生长, 具有明显的抗癌作用.