抗A型肉毒类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其初步应用

以A型类毒素免疫BALB/C小鼠,取其脾脏与SP_2/O骨髓瘤细胞融合,获得8个阳性克隆,经克隆化和用ELISA法筛选、鉴定,得到两株(H_6,E_1)分泌型特异McAb的杂交瘤细胞系。5次克隆化后阳性率均达100％,并制备了培养上清液及免疫腹水。     

产生抗单纯疱疹病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用HSV-1 SM44株免疫C×S/1小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O融合,经HAT选择培养,细胞融合率为100％。ELISA筛选后获得53孔产生抗HSV抗体的杂交瘤阳性孔。对1A12,2A8,1G8,1D10,2C5 5株细胞系用有限稀释法做2～5次克隆化,阳性克隆率均达到100％。杂交瘤细胞系经连续传代培养4个月,仍能稳定产生单克隆抗体,冻存的细胞系经复苏后亦能稳定产生抗体。应用ELISA及IF试验证明,5种单克隆抗体均与HSV-1和HSV-2标准株呈特异性反应。ELISA测定,杂交瘤培养上清抗体效价为10~(-2)～10~(-3),制备免疫腹水效价为10~(-4)～10~(-7)。5种单克隆抗体与EBV,CMV,JEV和HFRSV无交叉反应。     

利用噬菌体肽库筛选脂多糖的模拟表位

目的：利用噬菌体肽库获得脂多糖的模拟表位。方法：用脂多糖免疫大耳白兔获得抗血清，从中纯化抗脂多糖的多克隆抗体。以纯化的抗体IgG为筛选靶分子，对噬菌体随机十二肽库进行亲和筛选。经3轮筛选后，随机挑取25个克隆测序，并进行噬菌体ELISA结合实验及脂多糖竞争抑制实验，以确定阳性克隆。结果：获得12种序列，ELISA实验结果显示其中6个为阳性克隆，且经脂多糖竞争抑制实验进一步证实。结论：获得了6个脂多糖的模拟表位，为脂多糖抗原表位的研究及疫苗研究提供了线索。     

产毒大肠杆菌不耐热肠毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步应用

用亲和层析纯化的产毒大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)免疫BALB/C小鼠,将小鼠脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞(1:8)在PEG(MW1000)作用下融合,采用ELISA筛选抗-LT抗体阳性孔,细胞融合率为50％,抗体阳性率为4.5％,经3～5次克隆后筛选出2株分泌抗-LT杂交瘤细胞株(2D_、2E_5),用ELISA测定杂交瘤细胞培养上清及腹水的效价,后者约为前者的100倍,高达90万～110万。通过平板免疫溶血试验和ELISA双抗夹心法分别对2株杂交瘤分泌的抗LT单克隆抗体(McAb)的特异性进行了试验,结果表     

抗人Toll样受体4合成肽单克隆抗体的制备与鉴定

在对Toll样受体4（TLR4）B细胞优势表位预测的基础上，合成该B细胞表位多肽，并以此为抗原免疫BABL／C小鼠，经鼠－鼠杂交，ELISA筛选，有限稀释克隆化，得到一株分泌抗TLR4合成肽的杂交瘤细胞株B4，腹水效价为1：100000。其免疫球蛋白为IgG2,k型。ELISA鉴定表明该抗体能识别TLR4^ 性细胞，Western blot分析显示在分子量约90kD处呈现单一免疫色带。     

沙门菌属pad蛋白的原核表达及抗原性的鉴定

目的在大肠杆菌中表达沙门菌属pad蛋白,纯化后制备兔抗pad抗体。方法利用PCR方法从肠炎沙门茵中扩增出pad基因,构建pET一32a（＋）一pad重组表达质粒;将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性克隆,测序鉴定后,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间以诱导重组蛋白的表达;以纯化的pad蛋白免疫家兔,制备抗pad多克隆抗体并进行鉴定。结果与结论成功扩增得到pad基因,经双酶切和测序证实重组表达质粒构建成功,经过诱导条件的优化,在大肠杆菌中表达出相对分子质量为41×10。的目的蛋白;纯化的重组蛋白免疫家兔后,能够有效地刺激家兔产生特异性抗体,经琼脂糖双向扩散测定抗血清效价达到1：32以上。为进一步研制沙门茵属体外快速检测试剂打下了基础。     

地高辛特异性单克隆抗体制备的研究(摘要)

研究了应用淋巴细胞杂交瘤技术制备地高辛特异性单克隆抗体(MAb),并对抗体特性进行了分析,以探讨该抗体用于监测地高辛血药浓度及治疗严重中毒的可能性。作者用过碘酸钠法将地高辛分别偶联于牛血清白蛋白(Dig—BSA)和卵白蛋白(Dig—OVA);用Dig—OVA加Freund完全佐剂腹腔注射,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠获取牌细胞与SP2/O骨髓细胞。以ELISA间接法筛选地高辛特异性抗体分泌阳性的杂交瘤克隆,并用有限稀释法进行克隆化。所获杂交瘤细胞系经扩大培养、液氮冻存、注入BALB/c小鼠腹腔制备MAb腹水,并测定MAb的特异性、MAb与地高辛、洋地黄毒甙、毛花强心丙、毒毛旋花子甙K和     

SEREX方法鉴定CTCL细胞肿瘤抗原

目的 分离纯化皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞系SeAx细胞膜蛋白并制备多克隆抗体.利用SEREX法从SeAx cDNA噬菌体表达文库中筛选肿瘤抗原.方法 培养SeAx细胞至2×1010个,用组织匀浆器匀浆后差速离心法分离细胞各组分,富集细胞膜抗原.用细胞器特异性抗体对纯化步骤中的各组分进行检测.用膜蛋白组分免疫家兔4次,每次免疫后用ELISA法测定血清抗体滴度.4次免疫后用Western blot方法测定多抗与SeAx细胞各组分蛋白反应的特异性.重组噬菌体感染大肠杆菌,将表达的重组蛋白转印到硝酸纤维素膜上,与SeAx细胞膜蛋白免疫的兔血清进行反应,阳性的克隆测定核苷酸序列,通过数据库搜索比较确定基因.结果 用差速离心法得到SeAx细胞膜蛋白,免疫家兔4次后获得了效价为1×10-5的多克隆抗体.共筛选了1×106个噬菌体克隆,得到25个阳性克隆,经核苷酸序列测定和数据库分析,其中4个cDNA片段为膜蛋白成分,分别为integrin alpha 4,ligatin,matrix metalloproteinase 24和MHC-I molecule HLA-A.结论 分离并纯化了CTCL细胞系SeAx细胞膜蛋白,成功制备了多克隆抗体,用SEREX方法从SeAx mRNA建立的cDNA噬菌体表达文库中筛选到4个肿瘤细胞膜蛋白基因,它们可以引起机体产生体液免疫反应,并可能成为潜在的免疫治疗靶点.     

人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)表达及抗体制备

目的 重组表达及纯化人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(betaine-homocysteine methyltransferase, BHMT)蛋白,制备BHMT多克隆抗体并对其性质进行研究.方法 TRizol法提取人HepG2细胞总RNA,RT-PCR获得BHMT基因,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建重组表达载体pET-28a-BHMT,经0.5 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物通过Ni柱亲和纯化获得重组蛋白;以重组BHMT蛋白免疫兔,获得兔多克隆抗体,并对抗体进行纯化,应用Western印迹方法分析其识别人天然BHMT蛋白的能力.结果 经测序证明,RT-PCR得到的人BHMT基因与GenBank中人的BHMT基因完全一致;构建的BHMT原核表达载体可稳定地表达可溶性人BHMT蛋白;重组BHMT蛋白免疫兔后,兔血清抗体纯化获得高纯度BHMT抗体,此抗体可以特异性地识别人肝癌组织中的天然BHMT蛋白.结论 成功重组表达并纯化人BHMT蛋白,所获得的BHMT多克隆抗体可以应用于人BHMT蛋白的检测,为研究BHMT在高同型半胱氨酸血症中的作用机制奠定基础.     

银屑病皮肤白细胞介素8的免疫组织化学研究

应用抗白细胞介素8(IL—8)的单克隆和多克隆抗体对IL—8在银屑病皮肤的定位与分布进行了免疫组织化学研究.进行期寻常型银屑病患者和健康对照各7例,分别切取病损处及其周围未受累皮肤和正常人皮肤进行冰冻切片.用IL—8抗血清和两种IL—8单抗(5A4、2G2)以ABC免疫组化技术染色观察结果.发现IL—8抗血清和单抗5A4能使正常人表皮着色,且基底细胞层明显深染.5A4、2G2在银屑病皮损表皮的基底以上层呈现阳性,而未受累皮肤的染色结果无明显规律性,银屑病皮损表皮与正常人皮肤IL—8的分布差异表明IL—8在该病的病理生理过程中可能发挥重要作用.     

抗乙肝病毒前S(2)蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用

用聚合人血清白蛋白亲和层析柱纯化的含前S(2)-HBsAg,脾内接种Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0-Ag骨髓瘤细胞融和,以4种酶联法进行筛选,并经多次有限稀释亚克隆培养,最终选出3株分泌抗前S(2)单克隆抗体的细胞株。经多次传代,结果稳定。接种Balb/c小鼠腹腔后,腹水均为抗前S(2)阳性,效阶达8万。免疫球蛋白为鼠IgG1型。用其初步纯化的IgG酶标记物,以双抗体夹心法检测了乙肝病人血清中前S(2)蛋白,结果较满意,认为可在临床上推广使用。     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

人源抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中的表达

目的 :构建人源抗_HAV全分子抗体的CHO细胞表达体系。方法 :将抗_HAV抗体轻链全分子 (信号肽与VL_CL)基因克隆至表达载体pCI_neo中 ;将重链信号肽、重链 (γ)VH_CH1 和Fc基因进行重组形成重链全分子基因 ,再将其克隆到真核表达载体pCdhfr1中。将轻、重链全分子表达载体共转染CHO dhfr_细胞 ,用G_4 18和甲氨蝶呤(MTX)筛选细胞克隆 ,ELISA法检测细胞培养上清中的抗_HAV活性 ,增加MTX浓度进行加压筛选。用蛋白L亲和层析柱从培养上清中纯化重组抗体。结果 :构建的真核表达载体可实现抗_HAV全分子抗体在CHO细胞中的分泌表达 ,纯化的重组抗体在还原SDS_PAGE中表现为相对分子质量约 2 5 0 0 0、5 0 0 0 0两条带 ;Western印迹表明 ,重组抗体全分子和重链分子均可和羊抗人Fc抗体发生特异性免疫反应。结论 :抗_HAV全分子抗体在CHO细胞中表达 ,为基因工程生产具有完整功能的全分子抗体奠定了基础     

抗PEA受体结合区单克隆抗体的制备及鉴定

目的探讨绿脓杆菌外毒素A(PEA)中和性单克隆抗体在预防和治疗绿脓杆菌感染中的免疫保护作用.方法以重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法筛选细胞培养上清,采用有限稀释法对阳性孔进行克隆,3次克隆后获得4株能稳定分泌抗PEA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4,1D4,2E12和3C6.结果细胞培养上清ELISA效价为4000～8000,腹水ELISA效价可达25600～51200,其中3C6抗体在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价,其亲和常数为8.93×108.结论获得的单克隆抗体可在抗烧伤绿脓杆菌感染中发挥重要作用.     

小鼠源性ABIN1蛋白的抗体制备及功能验证

目的制备小鼠源性A20结合核因子κB活化抑制蛋白1（A20 binding inhibitor of NF-κB activation 1,mABIN1）的多克隆抗体并进行功能验证,利用该抗血清对大鼠脑区ABIN1的分布进行验证。方法利用mABIN1片段与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）耦联得到的肽段为免疫原,免疫新西兰大耳白兔3次,共35 d,获得抗血清,分别用ELISA、蛋白免疫（Western）印迹和免疫组织荧光化学法对抗体的特异性进行验证;使用上述验证所得的特异性抗血清,通过Western印迹检测ABIN1在大鼠各脑区的分布;对所得到的特异性抗血清进行纯化。Western印迹证明,纯化后的抗体杂带较纯化前明显降低,但效价也有所下降。结果与结论成功制备了兔抗小鼠ABIN1抗血清并对抗血清进行纯化,经该抗血清首次验证ABIN1在大鼠嗅球、皮质、海马、纹状体、伏隔核、丘脑、下丘脑、小脑、脑干及脊髓等中枢神经系统不同部位均有广泛分布,为在动物体内进行ABIN1生物学功能研究提供了有利工具。     

功能未知基因LOC410296的表达载体构建及小鼠抗血清制备

目的：为深入研究功能未知基因LOC401296,首先获取其全长序列,实现LOC401296分子的真核和原核表达,并制备针对 LOC401296蛋白的抗血清。方法采用 PCR 方法克隆 LOC401296编码区全长序列,利用pET28B和pCMV-Myc质粒构建LOC401296原核表达和真核表达载体,用异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导目的蛋白原核表达,目的蛋白经纯化、复性后免疫小鼠制备抗血清。结果 PCR克隆得到LOC401296编码区全长序列,成功构建LOC401296原核及真核表达载体,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌体内表达,用纯化蛋白免疫小鼠获得抗人LOC401296蛋白血清, ELISA检测抗血清效价达1∶64000,Western印迹证实LOC401296真核表达载体成功表达且抗血清特异性良好。结论获得LOC401296基因编码区全长序列,成功构建了LOC401296基因表达载体,分别在大肠杆菌和真核细胞内实现LOC401296蛋白原核表达和真核表达,获得小鼠抗人LOC401296蛋白抗血清,为LOC401296基因功能研究奠定了基础。     

OGDC-E2和BCOADA-E2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义

目的通过重组表达抗原OGDC-E2和BCOADC-E2的二联体融合蛋白(B0),并用于检测自身抗体及临床意义。方法重组表达的融合蛋白(B0),通过Ni-NTA亲和柱纯化,经过免疫印迹法(IBT)和酶链免疫吸附(ELISA)法检测56份PBC患者血清,以48份自身免疫病患者、50份其他肝病患者、70例正常人血清为对照组。结果56例确诊的PBC患者中,42例阳性,阳性率为75.0%。而健康体检者和疾病对照组血清中的M2抗体均为阴性。结论通过用重组表达的二连体B0检测PBC患者血清中的M2抗体,具有一定的特异性及敏感性,为临床进一步研究PBC,辅助诊断提供一些辅助参考。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原,利用抗原抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原,与正常肝细胞无交叉反应。结论此法制备单链抗体方法简便,周期短,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。