Template synthesis of DNA nanotube:-New gene and drug delivery vehicle

利用氧化铝多孔膜作为模板合成了DNA纳米管,DNA纳米管由单链DNA片段杂交在氧化铝多孔膜内以DNA双链杂交组成；药物分子和DNA片段相连后,可把药物分子包覆于DNA纳米管中.加热时,双链DNA纳米管分解,释放出单链DNA分子,以此可实现基因和药物分子的可控输送和释放.     

DNA印迹试验

DNA印迹是一种将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上用探针与靶DNA进行杂交的技术,又称Southem杂交。利用一种或多种限制内切酶酶切消化的基因组DNA,或经PCR获得扩增片段,经琼脂糖凝胶电泳,所得的DNA片段按分子大小分离,DNA片段经琼脂糖凝胶、变性,并将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上(多为硝酸纤维素膜,NC或尼龙膜),     

Tissue tropism of the TTV in experimentally infected rhesus monkeys

目的：了解TT病毒的嗜肝性。方法：5只实验感染病毒的恒河猴血病期间,采集各种组织,抽提各组织DNA,分别用病毒双链探针或单链负义探针,与吸附在纤维膜上的组织DNA进行斑点杂交。结果：双链探针与肝、骨髓、脾、胃、小肠和大肠杂交阳性,表明各该组织中都有无包膜DNA病毒的存在。单链负义探针与各该组织DNA杂交,仅肝、骨髓和小肠为阳性,表示存在可能作为病毒复制中间体的正义单链DNA。结论：肝、骨髓和小肠可能是病毒的复制场所,故TT病毒可能具有嗜肝性。     

用生物素化补骨脂素标记核酸探针的方法研究

补骨脂素在长波紫外光照射下与核酸分子的碱基发生共价结合。本实验对生物素化补骨脂素标记核酸的条件和效果进行了研究,发现该试剂不仅能标记双链DNA、单链DNA,更重要的是可以直接标记RNA及寡核苷酸。探针显色灵敏度可达1pg,杂交灵敏度可达2～5pg。     

DNA适体筛选中双链DNA拆分方法研究

目的研究能够用于DNA适体筛选的双链DNA拆分方法。方法采用琼脂糖凝胶电泳,观察和比较λ核酸外切酶法、不对称PCR法、磁珠法以及琼脂糖凝胶法的拆分效果。结果琼脂糖凝胶电泳显示,λ核酸外切酶法不能充分拆分双链DNA形成单链DNA;不对称PCR法产生的非特异性单链DNA较多;磁珠法拆分双链DNA获得单链DNA的量较低,且成本较高;琼脂糖凝胶法拆分双链DNA较为充分,单链DNA纯度较高。结论琼脂糖凝胶法可用于DNA适体筛选中双链DNA的拆分。     

基于DNA折纸的DNA复制的单分子检测和表征

目的探索DNA复制的单分子检测和表征途径。方法单链DNA模板链的两端通过碱基互补配对固定在DNA折纸纳米
结构上,利用原子力显微镜（AFM）在单个DNA分子水平上对复制过程中的DNA分子的不同阶段进行检测和表征,其中包括：
复制前后的形貌,复制过程中大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow Fragment片段（KF）的分布,以及复制后Biotin-Streptavidin（BA）
分子识别反应在单个DNA链上所引起的进一步形貌变化。同时,采用常规的琼脂糖凝胶电泳方法分析DNA复制前后的变化
情况。结果（1）DNA模板链成功连结在三角折纸的特定位点,连接效率达到50%以上;（2）DNA复制过程中,KF结合在DNA
模板链上,复制后KF从DNA链脱离;（3）复制前后DNA链高度变化明显,DNA链高度增加了约0.7 nm;（4）复制后,当加入
Streptavidin时,其结合于含有Biotin标记的新合成DNA链位置处,形成BA复合物,平均高度达到约4.9 nm;（5）琼脂糖凝胶电
泳结果也显示单链DNA变为双链,以及双链DNA分子上结合的BA复合物。结论通过将AFM与DNA折纸技术相结合,可实
现单分子水平上的DNA复制的检测和表征,此方法将有助于研究DNA聚合酶的作用机制以及不同因素对DNA复制的影响。
     

地高辛甙元标记DNA探针的试剂研究

利用补骨脂素(Psoralen)在可见光照射下可与DNA双链结合的性质,Sheldon提出在DNA探针的末端连结一段双链DNA,用连有生物素的补骨脂素与其光反应则可在DNA探针的末端标记生物素。据报道其检测灵敏度可达1×10~4拷贝。我们在研究补骨脂素与双涟DNA光反应时发现,补骨脂素不仅可与双链DNA交联而且也可与单链DNA结合,与补骨脂     

高双链含量DNA的选择及其临床应用

目的:用32P-DNA探针优化选择高双链含量DNA,用于检测抗双链DNA抗体。方法:分子杂交技术比较四种DNA双链含量;ELISA法检测系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者血清抗双链DNA含量。结果:大肠埃希菌W1485DNA与SigmaDNA的双链含量相接近,可以用作抗原,成功检测SLE患者血清抗双链DNA抗体。结论:大肠埃希菌W1485DNA为临床应用提供了高质量低成本的双链DNA试剂。     

牛雄性DNA特异的限制性片段研究

牛基因组DNA经PstI酶解后,以与性别有关的雌性蛇的小卫星DNA组份一BKm序列(p184)为探针进行分子杂交,回收4.4kb牛雄性DNA片段,以pUC_(19)为载体亚克隆,重组质粒经菌落原位杂交和Southern blot分子杂交鉴定。将此雄性DNA片段检测牛基因组DNA,观察到由于性别的不同而出现不一样的杂交模式。实验结果表明,用来自牛雄性DNA特异的限制性片段的重组质粒作探针,Southern blot分子杂交方法可以鉴定牛的性别。     

华东地区病毒生化基础实验讲习班在合肥举行

<正> 华东地区病毒生化基础实验讲习班于6月11日至22日在合肥举行。这期讲习班是由中国生物化学会主办的。中国科学院上海生物化学研究所六室分子病毒学研究组孙玉昆副教授和巫爱珍、戴仁鸣、沈学仁等四同志承担了这期讲习班的全部教学工作。他们先后讲解了关于分子病毒学研究进展、蛋白体外翻译、互补DNA的合成以及分子杂交等五个专题,又带领学员做了关于病毒的纯化、核酸碱基分析、单链双链RNA的分     

ASSOCIATION OF PSL (p55),A S-PHASE-RELATED NUCLEAR ANTIGEN,WITH CHROMATIN IN HeLa CELLS

PSL is a S-phase-related 55 kDa antigen which has been previously located inchromatin areas of the nucleus by electron microscopic studies. In the present report, weshow that it is released from purified HeLa cell nuclei by micrococcal nuclease treatment,which relieves chromatin under the form of nucleosome. However, the antigen is not associ-ated with nucleosomes but is part of a structure that sediments through 5-20% sucrosegradient. Moreover, PSL is completely retained on single-stranded DNA (ss-DNA) affini-ty columns and binds more efficiently HeLa cell ss-DNA than double stranded DNA.Although no direct evidence could be obtained, these data suggest that PSL might bea ss-DNA-binding or a RNA-binding protein.     

A study on the integration of adeno－associated virus inverted terminal repeat fold structure in eukaryotic chromosome in vitr

Ａｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｉｎｖｅｒｔｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔｆｏｌｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｉｎｖｉｔｒｏＧｕｏＢａｏｙｕ（郭葆玉）；Ｈｕ...     

基于碳纳米管修饰的无酶型新型甲胎蛋白安培免疫传感器研究

目的构建新型甲胎蛋白安培免疫传感器。方法首先在玻碳电极(GCE)表面修饰一层羧基化碳纳米管(CNTs),然后利用带负电荷的DNA分子和带正电荷的硫堇之间的静电作用,层层自组装修饰硫堇以增强检测信号,然后利用硫堇的氨基固定纳米金,以便固定抗体,最后利用牛血清白蛋白封闭未结合位点。结果修饰的碳纳米管能够显著地提高电极的导电性,利用层层组装技术修饰了5层硫堇。在优化的条件下(pH7.0,温浴时间25min),制作的甲胎蛋白免疫传感器线性范围在0.5～25ng/ml内,检测限0.02ng/ml。结论成功利用层层自组装技术构建新型基于碳纳米管修饰的无酶型甲胎蛋白安培免疫传感器,该传感器灵敏度高,特异性好,有望成为原发性肝癌早期诊断的新方法。     

丙肝病毒核心抗原荧光定量型生物条形码检测体系的建立与评价

目的建立丙肝病毒核心抗原（HCVcAg）的荧光定量型生物条形码检测体系,并对检测体系进行方法学评价。方法制备标记有HCVcAg多抗及特异DNA链的金纳米颗粒探针（NP探针）和标记有HCVcAg单抗的磁性微球探针（MMP探针）,形成MMP探针-HCVcAg-NP探针复合物,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过荧光定量PCR方法鉴定这些释放的DNA链可确定丙肝病毒的存在。结果建立了HCVcAg的荧光定量型生物条形码检测体系,检测灵敏度可达100fg/ml,是相应的HCVcAg ELISA检测方法的104倍。结论本研究为发展高灵敏度丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒奠定了基础。     

Chitosan-DNA microparticles as mucosal delivery system: synthesis, characterization and release in vitro

Background Mucosal immunity is important to defense against dental caries. To enhance mucosal immunity,a DNA vaccine mucosal delivery system was prepared by encapsulating anticaries DNA vaccine (plasmid pGJA-P/VAX) in chitosan under optimal conditions and the characteristics of the microparticles was investigated.Furthermore, the release properties and protective action of microparticles for plasmid were studied in vitro.Methods Plasmid loaded chitosanmicroparticles were prepared byconcentration of DNA, sodium sulfate, and the chitosan/DNA ratios incomplex coacervation. Three factors,complexes [ better expressed as N/P ratio: the number of poly nitrogen (N) per DNA phosphate (P) ] influencing preparation were optimized by orthogonal test. The characteristics of microparticles were evaluated by scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). DNA release rate of microparticles in similar gastro fluid (SGF) or similar intestinal fluid (SIF) at 37~C was determined by ultraviolet spectrophotometry.Results High encapsulation efficiency (96.8%) was obtained with chitosan microparticles made under optimal conditions of 50 mmol/L Na2SO4,200μg/ml DNA and N/P ratio of 4. The size of particles was about 4 to 6μm. The encapsulation process did not destroy the integrity of DNA. When incubated with SIL, after a release of about 10% in the first 60 minutes, no further DNA was released during the following 180 minutes.When incubated with SGL, the microparticles released a small burst (about 11% ) in the first 60 minutes, and then slowly released at a constant, but different rate.Conclusions These chitosan microparticles showed suitable characteristics in vitro for mucosal vaccination and are therefore a promising cartier system for DNA vaccine mucosal delivery.     

慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的检测及临床意义

目的 探讨自身抗体阳性慢性乙肝（CHB）患者外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞（Treg）的特点.方法 自身抗体阳性的CHB患者20例、自身抗体阴性的CHB 20例、自身免疫性肝炎15例.用斑点免疫层析法检测其抗单链DNA抗体（ss-DNA）、抗双链DNA抗体（ds-DNA）、抗核抗体（ANA）、可提取核抗原抗体谱（ENA）、抗线粒体IgM抗体（AMA）.流式细胞术检测外周血中的CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞比例,并与20例正常人对照组的上述指标进行比较.结果 自身抗体阳性CHB组CD4＋CD25＋T细胞较正常人无减低（P＞0.05）,但CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞显著降低（P＜0.05）;与自身抗体阳性CHB比较,自身抗体阴性CHB组CD4＋CD25＋T细胞和CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞均显著升高（P＜0.05）,而自身免疫性肝炎情况则相反.结论 自身抗体阳性CHB患者Treg细胞功能较正常人显著降低,而且比自身抗体阴性CHB患者的Treg细胞数量及功能均偏低.这可能是自身抗体阳性CHB病情较重、反复发作的原因之一.     

在体骨髓原位造血细胞间纳米通道的扫描电子显微镜(SEM)证据

 目的  探讨在体骨髓细胞之间是否存在细胞间纳米通道(intercellular nanotubes)。方法  利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)在体原位观察C57BL/6小鼠骨髓中细胞间纳米通道的分布、形态以及可能的形成机制。结果  骨髓造血细胞之间存在纳米通道结构。SEM显示该结构在骨髓组织中散在分布,位于骨髓内血窦内、外侧。骨髓造血细胞间纳米通道的管径粗细不均,平均长度为5.85 μm (1.58~18.54 μm),平均直径为364 nm (202~541 nm),还可见一些小颗粒状物质黏附在纳米通道表面。此外,小鼠骨髓造血细胞可能通过伸出突起的形式形成细胞间纳米通道。结论  本研究首次为小鼠骨髓造血细胞之间存在细胞间纳米通道提供了形态学证据。     

纯钛表面二氧化钛纳米管对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

目的:探讨纯钛表面二氧化钛(TiO2)纳米管改性后对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖?成骨分化能力的影响?评价TiO2纳米管改性作为种植体表面改性方法的作用?方法:将实验组钛片进行阳极氧化TiO2纳米管处理,对照组仅进行抛光处理?将hPDLSCs与两组钛材分别复合培养,检测其增殖及成骨相关蛋白的表达水平?结果:成功在钛材表面制备了多孔?有序?管径约为100 nm的TiO2纳米管;实验组hPDLSCs较对照组1 d的增殖活性及4 d的ALP活性没有明显差异;而4?7 d实验组细胞的增殖活性低于对照组;而7 d?14 d及21 d实验组细胞ALP活性高于对照组;21 d时,实验组 Col-I?OCN?Runx-2的基因表达水平明显高于对照组?结论:通过阳极氧化可在钛材表面制备多孔有序的TiO2纳米管层;且TiO2纳米管能有效促进hPDLSCs在钛表面的骨向分化?     

人巨细胞病毒负荷量对细胞病变的影响

目的探讨感染后人巨细胞病毒负荷量与细胞病变的关系。方法采用不同滴定度的人巨细胞病毒感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立人巨细胞病毒梯度感染细胞模型,荧光定量PCR法测定感染细胞内及其维持液病毒DNA量,光镜观察致细胞病变作用,电镜检查其超微结构的改变。结果人巨细胞病毒感染后,细胞内与其维持液病毒DNA量成正相关(r=0.83,P<0.01)。当细胞内病毒DNA量>105GE/106HEL时,病毒开始自细胞内释放;当维持液病毒DNA量>103GE/ml时,细胞出现病变。结论人巨细胞病毒感染后,受染细胞排放病毒致细胞外,且细胞内外病毒负荷量成正相关。细胞病变的发生情况与细胞内及其周围环境的病毒负荷量均密切相关。     

聚甲基丙烯酸甲酯接枝多壁碳纳米管的制备及表征

采用原位聚合的方法,分别在本体及超临界CO2介质中将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)接枝到多壁碳纳米管(MWNTs)表面,通过GPC、拉曼光谱、TGA等手段对样品进行表征。聚合产物的GPC结果表明,体系中的PMMA存在游离和接枝两种状态;拉曼光谱中峰的红移以及D峰与G峰强度比值的增加证明PMMA与MWNTs之间存在化学键作用;TGA结果表明PMMA在本体和超临界CO2中的接枝率分别为39％和27％。