人骨髓间充质干细胞在mdx鼠体内的动态分布

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)在mdx鼠体内的动态分布特点。方法用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记hBM-MSCs,将1×107个干细胞(0·3ml)经尾静脉注入免疫抑制的mdx鼠(8~10周龄)体内。于移植后48h、2、4、8、12、16、20、24周处死鼠,用免疫荧光法检测各组织器官的BrdU阳性细胞核数、骨骼肌人细胞核(Hu)及人抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达,RT-PCR检测人Dys mRNA的表达。结果移植后4周内,BrdU阳性细胞核可见于多数组织、器官,其中以骨髓、肝、肺较多;肝、肺BrdU阳性细胞核数4周后逐渐下降;移植后48h骨髓BrdU阳性细胞核数较多,2周最多,16周后仍维持较高水平;4周后骨骼肌的BrdU阳性细胞核数逐渐增加。移植后2周骨骼肌检测到少量人特异性抗核抗体(anti-Hu)阳性细胞核,4周后在骨骼肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后有Dys mRNA的表达;随着移植时间的延长,anti-Hu抗体阳性细胞核数和Dys阳性细胞比例逐渐增高,DysmR-NA的表达逐渐增强。结论hBM-MSCs移植mdx鼠后早期(2~4周)主要分布在骨髓、肝、肺,后期(4周后)主要分布在骨髓、骨骼肌。     

骨髓间充质干细胞移植与成肌分化

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem ceils，MSC)，是中胚层发育的早期细胞，具有向其他胚层分化的潜能。因其来源容易，且易于体外培养扩增及外源基因的转染和表达，移植排斥反应较弱，是很有前途的细胞工程和基因工程载体细胞之一。本文就骨髓间充质干细胞成肌分化和细胞移植治疗心血管疾病及肌病的现状及应用前景做一综述。     

人骨髓间充质干细胞能部分修补mdx鼠膈肌肌膜

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(bBM-MSC)移植mdx鼠后是否能修补膈肌肌膜.方法 用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记hBM-MSC,将1×10~7个干细胞(0.3mL)经尾静脉注入免疫抑制的mdx鼠(8～10周龄)体内.于移植后2、4、8、12、16、20及24用处死mdx鼠,用免疫组化法检测膈肌的病理变化、BrdU阳性细胞核数及人细胞核(Hu)与人抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达,RT-PCK检测人Dys mRNA的表达.结果 移植mdx鼠膈肌核中心移位纤维比例较未移植mdx鼠显著减少(P<0.05) .移植后2周膈肌可检测到少量BrdU阳性细胞核,8周后膈肌的BrdU阳性细胞核数逐渐增加.移植后2周膈肌检测到少量人特异性抗核(anti-Ha)抗体阳性细胞核,4周后在膈肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后有Dys mRNA的表达;随着移植时间的延长,anti-Hu抗体阳性细胞核数和Dys阳性细胞比例逐渐增高,Dys mRNA的表达逐渐增强.结论 hBM-MSCs可在mdx鼠膈肌分化为肌细胞,能减轻膈肌的病理,部分修补膈肌肌膜.     

骨髓间充质干细胞移植治疗Duchenne肌营养不良模型鼠的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)移植治疗Duchenne肌营养不良模型鼠的可能性。方法 分离培养正常小鼠MSC局部肌肉注射移植入Duchenne肌营养不良模型鼠mdx鼠，数周后观察dystrophin蛋白表达变化。结果 MSC移植后mdx鼠dystrophin蛋白阳性表达肌纤维增加明显。结论 在mdx鼠体内MSC可分化为骨骼肌细胞。局部细胞移植治疗mdx鼠有一定效果。     

骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗对Duchenne肌营养不良(DMD)模型鼠mdx鼠病态肌肉的影响.方法 分离培养正常小鼠MSCs,局部肌肉注射移植入DMD型模型鼠mdx鼠肌肉,16周后观察mdx鼠肌肉肌力、肌肉病理学改变及dystrophin蛋白表达变化.结果 MSCs移植16周后mdx鼠肌纤维dystrophin蛋白表达增加,肌力好转,核中移明显改善.结论 MSCs移植可缓解mdx鼠肌肉病理改变,但移植效率的提高需要进一步研究.     

骨髓间充质干细胞移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症344例临床疗效分析

目的 探讨自体骨髓间充质干细胞(MSCs)及脐带间充质干细胞移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症的临床疗效.方法 2007年6月～2008年6月该科室应用自体MSCs移植对344例杜氏型肌营养不良症患者进行治疗,采用治疗前后对照方法进行研究.骨髓间充质干细胞制备:对344例患者皮下注射粒细胞集落刺激因子,剂量为每日每公斤体重5～10μg,动员骨髓干细胞,共4 d,4 d后采集骨髓,将采集的骨髓通过Percoll梯度离心,提取单个核细胞(MNC),总量为(5.72±1.89)X108,CD34+细胞(2.67±1.22)%,CD133+细胞(1.79±0.73)%.培养骨髓单个核细胞7～10d,最终得到骨髓间充质干细胞含量为(1.90±0.96)X10s.应用四肢肌肉内注射的方式进行干细胞移植.移植后3、6、9、12个月观察患者酶学、肌电图、肌肉MRI变化,评价干细胞移植前后日常生活活动能力(ADL)、临床分级.结果 344例患者中292名患者四肢肌肉力量均有所改善.总有效率为85.00%,好转患者中199名患者四肢力量明显好转,明显好转率为58.00%;93名患者四肢肌力较前略好转,好转率为37.00%.结论 自体骨髓干细胞移植可使杜氏型肌营养不良症患者肌力得到改善,生活质量得到提高.     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

OBJECTIVE: To induce the differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into myogenic cells in vitro, and to investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene in AdTrackCMV-hVEGF165- transfected MSCs. METHODS: Twenty rabbits were divided equally into control group and experimental group, and MSCs were isolated and purified from their bone marrow by Percoll (1.073 g/ml) followed by cell culture in low-glucose DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. 5-azacytidine (5-Aza) was added into the cell culture of the experimental group on the third day. The expression of troponin I in MSCs was assayed by immunohistochemistry on the 28th day. AdTrackCMV- hVEGF165 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into the MSCs, and subsequent VEGF expression was detected by Northern blotting and Western blotting while enzyme-linked immunosorbent assay (ILISA) was employed to examine the VEGF concentration in the supernatant of the culture medium. RESULTS: Following successful isolation and culture of the MSCs from rabbit bone marrow, 5-Aza-induced differentiation of the cells into myogenic cells was demonstrated by their positive staining for cardiac troponin I (cTnI). Northern blotting showed that the expression of VEGF 165 mRNA was much higher in the VEGF165 gene-transfected cells than in the control cells. Western blotting showed VEGF expression in the transfected cells. The concentration of VEGF in the supernatant mounted to the peak level 3-5 d after VEGF165 gene transfection (1,011-1,027 pg/ml) and decreased gradually thereafter, but still maintaining higher levels than those in the control group and pAdTrackCMV group (349 pg/ml vs 116 pg/ml and 125pg/ml, respectively, P<0.01). CONCLUSION: MSCs can be induced to differentiate into myogenic cells in vitro and express VEGF after VEGF gene transfection, and this success may provided a basis for combining MSC transplantation with gene therapy for regeneration of the damaged myocardial cells.     

EPHA2在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究EPHA2在人骨髓间充质干细胞(hBMSC)成骨分化过程中表达的动态变化及其在成骨分化中的作用.方法:hBMSC成骨分化诱导0、4、10和14 d后分别收集细胞提取RNA和蛋白,采用Real-timePCR和Western blot方法检测EPHA2mRNA及蛋白表达;使用EPHA2的si-RNA下调EPHA2表达后进行成骨分化诱导,检测下调EPHA2表达对早期成骨分化指标ALP活性及晚期成骨分化指标钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响.结果:EPHA2在hBMSC成骨分化过程中表达逐渐上升,下调EPHA2表达能抑制ALP活性和钙沉积,抑制OSX、OCN及关键转录因子RUNX2的表达.结论:EPHA2在hBMSC成骨分化过程中表达逐渐上升,EPHA2可能通过增强RUNX2的表达从而促进hBMSC成骨分化.     

转基因修饰后的自体骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠后成肌调节因子的表达研究

目的 探讨携带micro-dystrophin基因的自体骨髓间充质干细胞移植mdx鼠后在移植鼠体内分化为肌细胞的可能机制.方法 采用逆转录病毒介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs(mMSCs),通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠.在移植后免疫荧光检测micro-dystrophin的表达并在不同时间点检测MyoD的表达.结果 移植后成功检测到micro-dystrophin,其表达随着移植时间的延长而增加;随移植时间延长MyoD阳性肌纤维比例增加,分别达到9%(4周时)、15%(8周时)、28%(12周时).RT-PCR和Western blot也发现,随着移植时间的延长,MyoD表达增加.结论 自体mMSCs可携带外源性micro-dystrophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞,移植入的干细胞向肌细胞的分化是一个持久的、连续的过程,成肌调节因子在调节其分化过程中发挥了重大作用.     

骨髓间充质干细胞成骨细胞分化研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的基础研究和临床应用广泛,BMSCs具有良好的成骨分化潜能,同时具有多向分化的能力,可向脂肪、骨、软骨细胞分化。BMSCs在合适的生长因子作用下可以快速地向成骨细胞分化和增殖,并且具有容易取材、容易分离、容易扩增、多谱系转化而不发生明显免疫排斥反应等优点,在骨组织工程领域拥有广泛的应用价值。但是,随着使用增多,存在的问题也日益突出,如生物学特性、分离鉴定、诱导分化和临床应用进展等问题还有待进一步解决。     

心肌细胞介导骨髓间充质干细胞的心肌样分化

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在不同培养条件下定向分化过程中的生物学特性变化及其机制.方法贴壁法分离大鼠MSCs,培养至第6代.实验分3组:条件培养基组,用新生鼠心肌细胞培养上清液制成的条件培养基处理MSCs48 h 2次,其间间隔48 h;混合培养组,新生鼠心肌细胞和MSCs按1:1的比例混合培养1周;对照组,MSCs常规培养.检测各组MSCs中心肌细胞结构功能蛋白:心肌肌联蛋白(titin)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果①条件培养基可诱导MSCs心肌样分化,表达心肌细胞骨架蛋白titin的Z带及A带部分,Cx43大量表达,但在检测期内未观察到MHC的表达;②MSCs在混合培养中与心肌细胞形成连接,表达titin,部分细胞内可检测到类似肌小节的结构,Cx43集中分布于细胞相邻的界面;③对照组中的部分MSCs可少量表达Cx43及titin.结论源于心肌细胞的各种因素可促使MSCs心肌样分化,分化的程度取决于作用信号的性质.     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化

骨髓由非贴壁的造血细胞和贴壁的基质细胞部分组成.这些贴壁的基质细胞部分包括多能间充质干细胞和分化的骨髓间充质基质细胞.间充质干细胞(mesenchymal stemce lls,MSCs)系统依靠增殖来自我更新,但是能够保持其干细胞的表型而引起成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成纤维细胞的分化[1].     

兔骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells ,BM -MSCs)向神经元定向诱导分化及分化前后体外培养的条件。方法 :无菌条件下收集兔股骨骨髓 ,用相对密度为 1 0 77的淋巴细胞分离液分离出白膜层细胞群 ,贴壁法筛检其中的MSCs ,用DMEM H条件培养基进行原代及传代培养。分别取 5和 10代的MSCs向神经元定向诱导。诱导后更换为神经培养基继续培养 ,并在 1～ 2 0d用免疫细胞化学方法检测分化细胞的特异性表面标志。结果 :兔骨髓MSCs在DMEM H条件培养基中建立高纯度的细胞培养 ,能够稳定地连续传代达 10代以上。不同代数的MSCs诱导后均表达巢蛋白 (nestin)和神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)。诱导后NSCs在神经培养基中继续存活 2 0d以上 ,但未见扩增。结论 :兔骨髓MSCs能够诱导表达神经元特异性标志 ,且诱导前后的MSCs均可在体外培养条件下存活。     

诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向软骨细胞诱导分化的能力。方法 选用不同代次的MSCs，使用条件培养基，观察细胞的形态变化，同时采用细胞化学和免疫组化的方法检测糖胺多糖的分泌和Ⅱ型胶原的表达。结果 MSCs在转化生长因子-β1、维生素C的作用下，7天后可见细胞多变为圆形或随圆形，糖胺多糖和Ⅱ型胶原染色阳性，表现出软骨细胞的分化特点。结论 在一定培养条件下成功诱导人MSCs向软骨细胞分化。MSCs作为骨组织工程学方面的种子细胞具有潜在的应用价值。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向神经细胞分化的潜能。方法体外培养人BMMSCs,并诱导其向神经细胞分化。诱导前后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达以鉴定细胞类型,流式细胞术检测细胞周期以确定细胞增殖活性。结果分离培养的BMMSCs有克隆增殖能力。诱导后,分化细胞呈现典型神经元的表型,且免疫荧光染色呈NSE阳性。流式细胞术分析显示诱导前BMMSCs的增殖指数(PI)较高,细胞增殖活跃。与诱导前比较,诱导分化细胞的PI显著降低(P<0.01),细胞增殖发生抑制,而分化阶段各期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMMSCs可以在体外增殖扩增,并能分化为神经元样细胞,且分化的神经元样细胞能较长时间存活。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。     

VEGF诱导人骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性

目的:研究内皮细胞生长因子(VEGF)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向内皮细胞定向分化的可行性并观察其生长增殖特性.方法:采用密度梯度离心法获取大量较纯的骨髓间充质干细胞,分为2组,实验组以含VEGF的M199培养液进行体外诱导分化,对照组用M199培养液培养.通过光镜、电镜及免疫组织化学染色方法分别观察所分化细胞的形态及表型,并绘制细胞生长曲线.结果:培养早期BMSCs多呈扁平、梭形、多角形形态,2周后实验组细胞渐呈集落状、椭圆形、铺路石样排列,而对照组细胞呈"毛发状"成纤维细胞外形.透射电镜下实验组细胞浆内有内皮细胞特征性单层质膜包裹结构--Weible-Palade 小体.对照组无此结构.实验组第3代细胞的Ⅷ因子相关抗原阳性比例接近(78.20±5.90)%,与人血管来源内皮细胞((82.70±4.47)%)相比,差异无统计学意义,而对照组细胞Ⅷ因子相关抗原染色呈阴性.生长曲线呈指数增长,短期内无明显衰老现象.结论:人BMSCs在VEGF的诱导下可定向分化为内皮细胞,并且保持了干细胞旺盛的增殖能力.     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的表达

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)端粒酶活性的表达以及深低温冻存和向脂肪细胞诱导分化对基因表达的影响.方法:联合应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离人hMSCs,传代培养.深低温冻存hMSCs或诱导其向脂肪细胞分化,以TRAP(Telomerase repeat amplification protocol assay) 法分别检测新鲜的不同传代次数的hMSCs、冻存复苏后培养的hMSCs和诱导分化为脂肪细胞的hMSCs的端粒酶活性.结果:用TRAP法检测hMSCs(n=19)端粒酶活性(RTA)是(1.46±0.67)%,分化成脂肪的hMSCs(n=3)的RTA为(11.80±2.52)%(P<0.001);不同传代次数MSCs端粒酶活性的比较中,早期hMSCs(n=10)的RTA为(1.46±0.83)%,晚期hMSCs(n=9)的RTA为(1.46±0.47)%(P=0.99);在低温冻存对hMSCs端粒酶活性的影响中,新鲜的hMSCs(n=13)的RTA为(1.41±0.44)%,低温冻存的hMSCs(n=6)的RTA为(1.57±1.07)%(P=0.64).结论:hMSCs的端粒酶呈阴性,传代培养和低温冻存不影响基因表达水平.向脂肪细胞分化后hMSCs端粒酶活性表达水平增高,其确切机制尚需进一步研究.     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞方法的建立

目的：分离和培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,并在体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。方法：利用Percoll梯度分离法、贴壁筛选法及单克隆培养法,分离、培养、扩增hMSCs;应用地塞米松、吲哚美辛、IBMX及胰岛素定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。结果：体外分离、培养出高度同源性的hMSCs,hMSCs具有独特的细胞免疫学表型,即CD73、 CD105、CD166、CD90及CD44阳性,CD34、CD31及CD45阴性。诱导3 d后,hMSCs细胞内有小脂滴出现,诱导2周后,脂滴数量增加并相互融合,细胞由长梭形变为圆形或多边形。结论：成功建立hMSCs分离培养方法,体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。