鄞州区50株结核杆菌6种耐药基因检测分析

目的：分析鄞州区结核杆菌耐药相关基因的突变特点,评价DNA测序分析在结核分枝杆菌耐药性检测中的价值。方法：利用DNA测序分析方法检测50株结核分枝杆菌的KatG、inhA、rpoB、embB、rpsL及rrs基因片段。结果;50株结核杆菌中,对INH、RFP、EMB、SM耐药的基因突变率分别为88％（包括KatG、inhA基因）、70％（rpoB基因）、100％（embB基因）、55％（包括rpsL、rrs基因）。其中INH耐药以KatG基因突变为主,SM耐药以rpsL基因突变为主,KatG基因突变多见于315位点,rpoB基因突变多见于531位点,embB基因突变多见于306位点,rpsL基因突变多见于43位点。结论：通过对结核杆菌常见耐药基因检测,将在短时间内区分敏感株及耐药株,有效指导临床用药,具有重要的意义。     

实时荧光PCR方法检测结核分枝杆菌mRNA的研究

目的建立检测结核分枝杆菌mRNA表达水平的实时荧光PCR反应体系,快速鉴定结核分枝杆菌。方法设计合成结核分枝杆菌mRNA相应引物和探针,探针标记以JOE为报告基团,BHQ1为猝灭基团。优化反应条件,建立结核分枝杆菌mRNA的实时荧光PCR检测方法。通过检测22份肺结核患者痰液、10份健康无症状人群痰液、结核分枝杆菌标准菌株和偶然分枝杆菌菌株培养菌落,检验方法的特异性、重复性和灵敏度。结果肺结核患者痰液检测均出现典型扩增曲线,CT均值31.35,标准差4.31。健康无症状人群痰液及偶然分枝杆菌未出现扩展曲线。对痰液标本及稀释RNA重复检测的变异系数在2.54%以下,检测CT值与痰涂片抗酸染色分枝杆菌的数量呈良好相关性。结论建立了一种快速实时检测结核分枝杆菌mRNA基因的荧光PCR方法,具有良好的敏感性和特异性。     

实时荧光定量PCR检测耐药结核分枝杆菌中耐药相关基因whiB7的表达

目的探讨结核分枝杆菌耐药性与whiB7基因表达水平之间的关系。方法以耐受利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和氟喹诺酮的结核分枝杆菌临床分离株为研究对象,利用实时定量PCR的方法,检测药物刺激结核分枝杆菌后whiB7基因表达水平的变化。结果除利福平刺激相应的菌株后,whiB7基因的表达水平变化不明显外,其余药物的刺激均会引起结核分枝杆菌耐药株的whiB7基因表达水平发生显著变化。结论结核分枝杆菌的whiB7基因是对多种抗生素刺激发生反应的基因,推测whiB7的表达参与结核分枝杆菌的耐药过程。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测痰结核分枝杆菌异烟肼耐药效果的评价

目的评价通过检测结核分枝杆菌katG基因突变以诊断异烟肼耐药并检测结核分枝杆菌的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法收集临床诊断为肺结核病的患者痰样本,用已建立的荧光PCR方法进行检测,与常规痰涂片抗酸染色、分枝杆菌培养和传统比例法药敏试验比较,评价检测结核分枝杆菌敏感性和特异性及异烟肼耐药的特异性和敏感性。统计学分析采用χ2检验,P值<0.05为差异有统计学意义。结果荧光定量PCR共检测186份痰液样本,敏感性为84.47%,特异性为100.00%。在确诊病人的痰液中阳性检出率84.47%,明显高于痰涂片40.99%(χ2=46.44,P<0.01),痰培养40.37%(χ2=47.89,P<0.01),且差异有统计学意义。其中荧光PCR在菌阳痰液中检出率94.44%,涂阴培阴的痰液中检出率75.28%。与常规药敏试验结果比较,培养阳性的61份痰样本的药敏符合率96.72%(59/61),敏感性33.33%(1/3),特异性100.00%(58/58)。结论 TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速诊断痰液中的结核分枝杆菌及其异烟肼耐药性。     

实时荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌研究中的应用

<正>核酸扩增技术特别是聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)可对不同来源的核酸进行定性检测,但需在PCR反应终止后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,这不仅无法准确定量,而且还容易发生交叉污染,产生假阳性。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性价值及耐药特征分析

目的 评价荧光PCR熔解曲线法(熔解曲线法)对结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测价值。方法 采用熔解曲线法与传统液体药敏法同时检测156例临床分离培养MTB对抗结核药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)和氟喹诺酮类药物耐药情况,并对2种检测方案结果进行比较。结果 与液体药敏检测相比,熔解曲线法对5种抗结核药物耐药性检测结果差异无统计学意义(P> 0.05),以液体药敏检测为金标准,熔解曲线法检测RFP、INH、EMB、SM以及氟喹诺酮类药物耐药性的灵敏度分别为100.00%、75.86%、61.54%、75.00%、90.00%,特异度分别为97.10%、95.28%、99.30%、96.21%、100.00%,Kappa值分别为0.885、0.721、0.707、0.724、0.944,表明2种检测方法一致性好。结论 荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物RFP、INH、EMB、SM及氟喹诺酮类的耐药性与液体药敏法检测效果一致,灵敏度、特异度均较高,具有较好的临床应用价值。     

TaqMan MGB双探针实时PCR快速检测结核分枝杆菌rpoB基因多位点突变方法的建立

目的建立快速、灵敏的检测结核分枝杆菌rpoB基因常见突变位点的新方法。方法采用TaqMan小沟结合物(MGB)探针技术,检测146例活动性肺结核患者和35例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况,测序方法为参考方法。结果146例活动性肺结核患者痰标本中,双探针方法检出阳性118例,其中rpoB基因突变56例,与测序方法比较符合率100.0%;35例非结核性肺部疾病患者痰标本双探针方法检测均为阴性,特异性100.0%;该方法最低检出下限为1×103拷贝/ml。结论TaqMan MGB双探针方法能快速、准确地检测结核分枝杆菌rpoB基因位点突变情况,适用于临床对耐药结核分枝杆菌的快速诊断。     

荧光定量PCR检测结核杆菌PncA基因突变研究

目的运用实时荧光定量PCR方法检测结核分支杆菌耐吡嗪酰胺(PZA)分离株PncA基因突变情况,从而探讨其水平与结核病的临床转归的相关性。方法用荧光定量PCR Taqman探针技术,以PncA基因片段设计引物,以突变发生率最高的47位(Thr→Ala)(PncA139)和85位(Leu→Pro)(PncA254)设计探针,10倍系列稀释含有目的基因的质粒,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线。并用于检测临床105份标本(TB-DNA>103)pncA基因突变表达量。结果①63例PncA139点突变表达量>102,占60%;②31例PncA254点突变表达量>102,占30%;③PncA139位突变表达量>103的患者同时也出现PncA254位突变表现,且TB-DNA表达量均>106;④PncA139位突变的高拷贝组与低拷贝组突变率比较χ2为50.44,85位点χ2为20.97,P值均<0.005,比较差异亦有明显统计意义。结论 TB-DNA高拷贝且PncA基因突变是临床结核病患者病情反复,以致迁延不愈的原因之一。     

新型细菌耐药基因NDM-1实时PCR检测方法的建立

目的 建立灵敏、特异、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测新型细菌耐药基因NDM-1.方法 根据NCBI数据库中β-内酰胺酶类相关耐药基因的序列,详细进行比对,选择特异性最高的片段设计引物和TaqMan探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光PCR方法.对所建立的实时荧光PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价.结果 本方法对各种细菌病原体的新型细菌耐药基因NDM-1的检测具有高度特异性和灵敏度.优化后的引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为100 nmol/L,灵敏度和特异度均为100％.该方法的检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,远远高于普通PCR1.0×105拷贝/μl的检测下限.结论 所建立的方法能够特异和敏感地检测携带NDM-1基因的超级细菌,能够作为携带有该基因细菌的灵敏快速的检测方法.     

LDR法和实时荧光PCR法定量检测慢性乙肝患者YMDD突变的比较

拉米夫定对于慢性乙肝和一些更为严重的肝病患者是一种有效的抗病毒药物。然而,长期的拉米夫定单一疗法导致在一些慢性乙肝患者出现了拉米夫定耐药突变。突变发生率从第一年的16%~32%往第2年的38%,第3年的57%,第4年的67%的逐渐增长[1]。这种耐药性突变与反转录酶的高度     

结核杆菌初始耐药对化疗效果的影响

目的 了解结核杆菌初始耐药对化疗的影响。方法将我院2001年1月-2005年12月4年间未用过抗结核药或用药未超过1月、有药物敏感性测定、门诊随访记录资料完整的肺结核患者分为耐药组(134例)及敏感组(162例),进行对比分析。结果痰菌阴转率前者为77.6%、后者为96.9%,2年细菌学复发率10.8%及3.5%。耐1药者痰菌阴转率89.1%;耐2药及3药者各为72.7%及54.5%。结论初始耐药,尤其耐多药是化疗失败的主要原因。     

55株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因突变研究

[目的]了解福建省耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因的突变特征。[方法]PCR扩增了55株结核分枝杆菌临床分离株，对包括81个碱基利福平耐药决定区（RRDR）在内的rpoB基因片段进行序列测定。[结果]10株敏感菌株rpoB基因未检测到突变。45株耐多药分离株中有40株rpoB基因存在21种不同类型突变，其中17个点突变，2个插入突变，2个缺失。[结论]88．9％的耐多药菌株检测到rpoB基因的突变，最常见的突变部位分别是531、526和516位密码子，突变率分别是47．1％、19．6％和7．8％。     

四川省结核病耐药动态及变化趋势

目的：掌握四川省结核病药动态及变化趋势，评价结构病控制实施效果。方法：对四川省1985、1990年和2000年3月结核病流调耐药性调查结果进行分析。结果：（1）3次调查结果显示结论核病总体、继发耐药率呈下降趋势。（2）各种药物的耐药发生频率中以INH为最高，EMB最低，RFP耐药率明显上升，INF呈下降趋势。（3）不同耐药类型的发生频率中耐一药下降，含INH＋RFP的耐多药率呈上升趋势，尤以2000年耐药率增高明显，结论：四川省结核病总体耐药情况虽呈下降趋势，但耐药率明显增高的情况不容忽视，继续贯彻现代结核病控制策略，阻止耐药结核病的流行。     

江西1010例PCR-线性杂交酶显色法检测结核分枝杆菌耐药性结果分析

目的 评价PCR-线性杂交酶显色法在江西的应用效能，分析江西地区结核分枝杆菌相关耐药基因rpoB、katG、inhA的变异特征。方法 采集江西省肺结核涂阳患者痰标本或经离培养获得的分离株共1010例，采用PCR-线性杂交酶显色法检测rpoB、katG、inhA基因突变情况，同时对其中860例进行了罗氏药敏检测。结果 以罗氏药敏为“金标准”评价PCR-线性杂交酶显色法检测利福平耐药性的敏感度和特异度分别为88.69%和96.24%；检测异烟肼耐药性的敏感度和特异度分别为77.29%和96.39%。在304株利福平耐药rpoB突变株中，突变频率高的位点是531位点、526位点次之；309株katG和inhA基因突变株中，katG S315T1占73.14%、inhA C15T占12.62%。异质性耐药突变菌株占3.61%。结论 PCR-线性杂交酶显色法是耐药结核病快速筛查的有效方法，江西利福平、异烟肼耐药株主要基因突变型为rpoB的S531L和katG的S315T1，高水平耐药菌株所占比例大。     

1684株结核分支杆菌单一、联合药敏试验结果分析

目的了解长沙市结核分支杆菌耐药情况。方法采用绝对浓度法进行结核分支杆菌药敏试验。结果1 684株结核分支杆菌药敏试验显示:单一药敏试验耐药率高低次序是:RFT(15.50%)、SM(12.59%)、RFP(10.69%)、INH(8.37%)、PZA(6.47%)、PAS(2.79%)、EMB(2.32%)、KM(1.72%);总耐药率为26.03%。结论长沙市结核分支杆菌总的耐药率低于全国平均水平。     

结核分支杆菌药敏和耐药基因检测的临床应用和分析

目的 采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌耐药基因（rPOB、katG和rPSL),评估它的临床应用价值。方法 通过Bactec-960快速培养,PCR－SSCP和药物敏感试验了解114例肺结核病人结核分支杆菌耐药情况,分析了临床治疗效果。结果 近1／3的初治肺结核病人至少耐一种抗结核药物,RFP、INH和SM敏感株rPOB、katG和rPSL基因突变率分别为6．5％、11．4％和27．2％,耐药株基因突变率分别为60．2％、45．7％和62．7％,耐药基因突变率随着耐药浓度增而高而增高。药敏试验联合耐药基因检测指导治疗效果满意。结论 耐药基因检测指导治疗是一种新探索,与药敏试验联合应用可互相弥补,可能成为临床指导用药的好方法。     

绵阳市结核分支杆菌耐药性分析

目的了解绵阳市结核分支杆菌耐药情况,为耐药结核病的预防控制提供依据。方法采用比例法对79株结核分支杆菌进行一线抗结核药物:异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)耐药性检测。结果共检测出耐药菌17株,总耐药率为21.52%,多耐药率为12.66%,耐多药率为6.33%。初治耐药率为18.64%,获得性耐药率为30.00%。单耐药顺序为:INH>SM>RFP>EMB,耐药率分别为15.19%,12.66%,7.59%和7.14%。耐药在性别和年龄组方面无统计学意义。结论绵阳市结核分支杆菌耐药率低于全国平均水平,应进一步加强耐药菌监测以指导临床合理用药。     

859例原发培阳肺结核全程督导短程化疗效果与耐药性分析

目的　分析 85 9例原发培阳肺结核病人其耐药性与全程督导短程化疗 (DOTS)效果的关系。方法　药敏试验采用比例法 ,培养基中药物浓度分别为 S4 μg/ m l、H0 .2 μg/ m l、R4 0 μg/ ml和 E2 μg/ ml;病人治疗采用卫 项目统一规定的全程间歇短化方案 (2 S3H3R3/ 4 H3R3)。结果　 85 9例病人经 6个月的治疗后 ,除 8例失访外 ,其中治愈 771例 (89.8% ) ,完成治疗 6 7例 (7.8% ) ,失败 9例 (1 .0 % )。化疗失败病人耐单药和耐二药组与敏感组无显著性差异 (P>0 .0 5 )。结论　对于原发敏感和耐一或二种药物的病例采用 6个月短程化疗方案是合理有效的     

荧光定量PCR在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用

目的建立荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法,评估其在肺结核的t临床诊断和疗效评估中的应用价值。方法针对结核分枝杆菌保守序列IS6110基因设计引物和探针,建立荧光定量PCR方法。分别以荧光定量PCR、集菌培养法和抗酸染色法检测168份疑似肺结核和5例确诊病人随访的痰标本,比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用。结果该荧光定量PCR法能扩增巧6l1O基因片段（107bp）,序列分析显示为结核分枝杆菌核酸序列,方法的检测灵敏度为4copies／反应;而对偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟茵的样本扩增结果均为阴性,荧光定量PCR法与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为64．29％（108／168）、35．12％（59／168）和12．50％（21／168）,前者高于后两者（P〈0．叭）。对抗酸染色法和集菌培养法阳性的样本,荧光定量PCR法的灵敏度分别为100．00％（21／21）和96．61％（57／59）。对20份非结核病人来源的痰标本．荧光定量PCR方法检测结果均为阴性,符合率为100．00％。用荧光定量PCR检测方法对5例活动性肺结核病例治疗期间进行了动态检测,结果显示病人晨痰中结核分枝杆菌的数量呈持续下降的趋势（即0值增加）。结论该荧光定量PER方法具有快速、敏感和特异性高的特点,可以快速、及时获取病人服菇詹的治府时票曲瞑辟的詹蛙督导妊井撂蚀饺摇臣者舌亚拍I性J妻音、;,