高浓度葡萄糖对Notch2信号通路及破骨细胞分化的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对RANKL诱导破骨细胞分化及Notch信号通路的影响.方法 高糖(5～40 mmol/L)条件下,RANKL刺激小鼠骨髓源性破骨前体细胞向破骨细胞分化,TRAP染色检测破骨细胞分化情况,实时定量PCR检测Notch信号通路相关基因(Notch1、Notch2、Jagged1)的表达情况.结果 RANKL诱导破骨细胞分化过程中,实验组(20 mmol/L和40 mmol/L葡萄糖)破骨细胞个数分别为(110.3±6.81)和(72.0±8.0); Notch1相对表达量分别为(1.25±0.43)和(1.14±0.45),Notch2相对表达量分别为(1.65±0.23)和(1.1±0.11),Jagged1相对表达量分别为(1.16±0.38)和(1.09±0.23);对照组(20 mmol/L和40 mmol/L甘露醇)破骨细胞个数分别为(152.7±7.0)和(157±12.5),Notch1相对表达量分别为(1.84±0.38)和(1.66±0.40),Notch2相对表达量分别为(2.82±0.28)和(2.42±0.27),Jagged1相对表达量分别为(1.52±0.26)和(1.45±0.34).其中,破骨细胞数量和Notch2基因表达量在实验组与对照组间差异具有显著统计学意义(P＜0.05).结论 高浓度葡萄糖抑制Notch信号及破骨细胞分化,该结果提示Notch2信号可能参与高糖抑制破骨细胞分化过程.     

GIT1通过Notch信号通路促进骨髓细胞向破骨细胞分化

目的:研究G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G-protein coupled receptor kinase-interacting protein 1,GIT1)是否通过Notch信号通路影响骨髓细胞向破骨细胞分化?方法:取8周龄GIT1野生型(GIT1+/+)和GIT1基因敲除(GIT1-/-)小鼠各8只,分离培养小鼠骨髓细胞并向破骨细胞诱导分化?分别在诱导后的4?7 d,检测细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)活性?在诱导后4?7 d,用real-time RT-PCR检测破骨细胞相关基因组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)?降钙素受体(calcitonin receptor,CTR)和基质金属蛋白酶9(matrix matalloproteinase,MMP-9)的表达,同时检测Notch信号通路受体?配体和目的基因的表达?结果:小鼠骨髓细胞向破骨细胞诱导分化过程中,基因敲除组破骨细胞的大小?数量?密度均低于野生型组;基因敲除组破骨细胞CTSK?CTR和MMP-9的表达均明显低于野生型组,差异有统计学意义 (P < 0.05);基因敲除组Notch信号通路配体Jagged1?受体Notch2和目的基因Hes1的表达明显高于野生型组,差异有统计学意义(P < 0.05)?结论:GIT1缺失可能通过上调Notch信号通路的表达来抑制骨髓细胞向破骨细胞分化?     

多发性骨髓瘤细胞分泌外泌体对破骨细胞分化的调控及其机制

目的 探究多发性骨髓瘤外泌体调控破骨细胞分化相关基因表达的功能及机制。方法 为了探究多发性骨髓瘤细胞对破骨细胞分化的影响,实验分为control组(THP-1细胞)、OPM2组(THP-1+OPM2细胞)、U266组(THP-1+U266细胞)、OPM2+GW4869组(THP-1+OPM2细胞+GW4869)和U266+GW4869组(THP-1+U266细胞+GW4869)。提取OPM2和U266细胞分泌的外泌体(OPM2 exo和U266 exo),透射电镜观察外泌体结构,Western blot鉴定外泌体标志蛋白TSG101、Hsp70、CD9。为了探究外泌体对破骨细胞分化的影响,实验分为OPM2 exo组(THP-1细胞+OPM2 exo)、U266 exo组(THP-1细胞+U266 exo)和PBS组(THP-1细胞+PBS)。qRT-PCR检测所有组细胞中活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATc1)、细胞原癌基因c-Fos、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)mRNA相对表达量,Western...     

根尖周病变中破骨细胞分化因子的免疫组化定位

目的:观察大鼠根尖周病变过程中破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor, ODF)的表达,探讨ODF与破骨细胞及根尖周骨吸收的关系。方法:将25只 SD大鼠开髓,分别于术后 0,7,14,21,28 d取下颌骨,制备组织切片,分别用免疫组织化学和酶组织化学的方法检测 ODF及破骨细胞在根尖周病损中的表达与分布。结果:在正常根尖周组织中偶见 ODF表达阳性细胞和前破骨细胞;术后 7 d根尖周有炎症细胞浸润,可见较多的ODF阳性细胞和少量破骨细胞;术后14 d根尖周表现为急性炎症反应,ODF阳性细胞及破骨细胞的数量上升至高峰;术后21~28 d根尖周病损进入慢性炎症期,ODF表达迅速下降,破骨细胞数量明显减少。结论:ODF表达于根尖周病损中,可能诱导了破骨细胞的分化,导致牙槽骨的吸收。     

破骨细胞分化因子及其受体和反意受体在骨巨细胞瘤中的表达及意义

目的:检测破骨细胞分化因子(ODF)及其受体(RANK)和反意受体-护骨因子(OPG)在骨巨细胞瘤(GCT)组织中的表达,探讨其与GCT中多核巨细胞形成J、affe分级和临床复发的关系。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测5例GCT组织中ODF、OPG、RANK mRNA的表达,用免疫组织化学法检测44例GCT组织中ODF蛋白的表达,统计分析其表达与Jaffe分级和临床复发的关系。结果:GCT组织中ODF、OPG、RANK mRNA均有表达,且ODF表达丰富;GCT组织单核基质细胞和多核巨细胞中均有ODF蛋白的表达,但以单核基质细胞为主,Ⅰ级单核基质细胞中ODF蛋白的表达明显高于Ⅱ、Ⅲ级,ODF蛋白的表达与复发无关。结论:GCT组织中ODF的表达与多核巨细胞的形成及Jaffe分级有关。     

两种不同培养方法对破骨细胞ATPase a3基因表达和骨吸收活性的影响

[目的]探讨不同方法培养下的大鼠破骨细胞（osteoclast,OC）骨吸收功能的差异,以及骨吸收关键基因ATPasea3的mR—NA表达水平的差异,为体外实验奠定基础。[方法]机械分离和诱导培养,即从新生24h的大鼠长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1,25（OH）2D3诱导大鼠骨髓细胞形成破骨样细胞（osteoclast like cell,OLC）,对获得的OC进行形态和骨吸收功能观察,并测定OC骨吸收关键基因ATPasea3的mRNA表达水平的差异。[结果]OC和OLC均为抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色阳性的多核巨细胞,与细胞共培养骨片上可形成骨吸收陷窝;诱导法培养出的OLC数目多于机械分离法,但诱导早期陷窝较之小而浅,诱导后期基本接近OC;OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA,在机械分离8h与诱导培养6天的细胞表达量无显著差异,但都远少于培养8天的表达量。[结论]诱导法可以培育出大量的OLC,优于机械分离法,但早期骨吸收功能较弱,OC骨吸收功能与其核数相关。后期的OCL与机械分离OC接近,可以用于各类实验。     

骨质疏松性椎体骨折患者血清破骨细胞生成抑制因子和破骨细胞分化因子的表达及意义

目的 探讨骨质疏松性椎体骨折患者血清破骨细胞生成抑制因子(osteoclast suppressor,OCIF)和破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor,ODF)的表达及意义。 方法 选择衢州市人民医院2013年1月—2016年12月符合标准的骨质疏松性椎体骨折患者70例为骨质疏松组,非骨质疏松性椎体骨折患者70例为对照组。采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(Double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定血清OCIF和ODF水平。采用双能X线骨密度仪测量腰椎正位总体L_1-4骨密度及左侧股骨颈骨密度。采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析。 结果 骨质疏松组血清OCIF和ODF水平均高于对照组(均P<0.05)。骨质疏松组腰椎正位骨密度和股骨颈骨密度均低于对照组(均P<0.05)。骨质疏松患者血清OCIF、ODF水平与腰椎正位骨密度、股骨颈骨密度均呈负相关(均P<0.05)。骨质疏松患者血清OCIF、ODF水平与骨折程度无显著相关性(均P>0.05)。 结论 骨质疏松性椎体骨折患者血清OCIF、ODF水平升高,血清OCIF、ODF水平与骨质疏松性椎体骨折患者的骨密度关系密切,与骨折的严重程度关系不大。      

血清破骨细胞分化因子及生成抑制因子测定在前列腺癌骨转移诊断中的价值

目的探讨检测破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor,ODF)和破骨细胞生成抑制因子(osteo-clastogenesis inhibitory factor,OCIF)对前列腺癌骨转移诊断及病情评价的临床价值。方法分析2010年1月~2011年12月114例初诊为前列癌患者的资料。前列腺癌骨转移组和非骨转移组分别为61例和53例,采用ELISA法测定各组血清ODF和OCIF浓度。结果骨转移组患者血清ODF和OCIF分别为(31.35±5.34)和(42.12±9.04)ng/L,明显高于非骨转移组的(8.42±1.73)和(9.84±2.15)ng/L,差异有显著性(P<0.01)。ODF和OCIF诊断前列腺癌骨转移ROC曲线下面积分别为0.92和0.88,具有良好的诊断价值。诊断前列腺癌骨转移的灵敏度、特异度,ODF分别为91.42%和87.35%;OCIF分别为87.51%和85.37%。ODF随骨转移部位数量增加而明显升高,OCIF随骨转移部位数量增加而明显降低。新发骨转移组和骨转移组血清ODF和OCIF浓度均显著高于非转移组,差异有显著性(P<0.01);新发骨转移组血清ODF和OCIF浓度与骨转移组比较,两组间无显著性差异(P>0.05)。结论前列腺癌患者发生骨转移时,血清ODF和OCIF含量明显增高,可作为判断前列腺癌患者骨转移及监测病情的参考指标,在临床上有广泛的应用前景。     

冬凌草甲素抑制破骨细胞分化的机制研究

目的探讨冬凌草甲素抑制破骨细胞分化的作用及其机制。方法通过体外培养原代骨髓巨噬细胞（BMMs）,观察不同浓度冬凌草甲素对BMMs增殖的抑制作用和破骨细胞分化的影响;抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞数目和铺展率;qRT-PCR法检测破骨细胞降钙素受体（CTR）、组织蛋白酶K（CTSK）、活性T细胞核因子c1（NFATc1）mRNA表达水平。结果与对照组相比,经冬凌草甲素处理48、72h后,6.4滋M以上的冬凌草甲素对BMMs的增殖有明显抑制作用,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;经冬凌草甲素处理96h后,3.2滋M以上的冬凌草甲素对BMMs的增殖有明显抑制作用,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;在NF-资B受体活化因子配体诱导下,与对照组相比,0.4、0.8滋M冬凌草甲素可明显减少破骨细胞分化数目和铺展率（均P＜0.01）,且其CTR、CTSK、NFATc1mRNA表达水平均下调（均P＜0.01）。结论冬凌草甲素通过下调破骨细胞分化转录调控因子NFATc1的表达抑制破骨细胞的分化。     

Notch1和Notch2对胰腺癌HPAC细胞中Hes家族靶基因的不同调控作用

目的研究Notch1、Notch2受体对胰腺癌HPAC细胞Notch信号通路下游Hes家族靶基因的影响。方法运用siRNA干扰技术分别干扰HPAC细胞中Notch1和Notch2基因,用Western blotting法检测Notch1和Notch2的干扰效率,用real-time PCR检测siRNA干扰后Notch下游靶基因Hes1、Hes2、Hes4和Hes6的mRNA表达水平;同时用Western blotting法检测Hes1的蛋白表达变化。结果与空白对照组(1.000±0.019)和siRNA对照组(0.908±0.039)相比,Notch1-siRNA转染组(0.124±0.005)的Notch1蛋白表达量显著降低。Notch1敲减降低了Hes1和Hes6的mRNA表达,Hes1与空白对照组和siRNA对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);Hes6与空白对照组和siRNA对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),对Hes2和Hes4的mRNA则没有影响。Hes2与空白对照组siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Hes4与空白对照组和siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组(1.000±0.015)和siRNA对照组(0.990±0.017)相比Notch2-siRNA转染组(0.350±0.009)的Notch2蛋白表达量显著降低。Notch2敲减降低了Hes1的mRNA表达,Hes1与空白对照组和siRNA对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而对Hes2、Hes4和Hes6的表达没有影响,Hes2与空白对照组和siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Hes4与空白对照组和siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Hes6与空白对照组和siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1和Notch2下调均不能引起Hes1蛋白水平变化。结论 HPAC细胞中Notch1的靶基因是Hes1和Hes6,而Notch2的靶基因是Hes1,提示不同Notch家族成员调控的靶基因有交叉但是不同。     

肝细胞癌中Notch1和Notch2蛋白表达及其意义

目的:探讨原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma,PHCC)中Notch1和Notch2蛋白的表达及临床病理学意义。方法:采取免疫组织化学ENVISION法对78例PHCC组织和对照组10例癌旁组织中Notch1和Notch2蛋白的表达进行检测,并结合临床病理学及随访资料,进行统计分析。结果:在PHCC组织中Notch1阳性表达52例(66.67%),Notch2阳性表达12例(15.38%),而对照组癌旁组织Notch1阳性表达2例(20.00%),Notch2阳性表达8例(80.00%)。Notch1阳性表达率PHCC组织高于对照组癌旁组织(P<0.01),而Notch2在PHCC组织中的阳性表达率低于对照组癌旁组织(P<0.01),两者比较差异均有统计学意义。Notch1的表达与有无肝硬化、肿瘤大小、HBsAg是否阳性、肿瘤分期及转移呈正相关,而Notch2的表达与患者年龄、组织分级以及TNM分期呈正相关。随访9年,死亡53例,存活25例,≥24个月38例,生存时间<24个月40例,平均生存时间34.96个月,2年生存率48.72%。Spearman等级相关性分析显示,随着Notch1阳性表达率提高,PHCC患者术后生存率下降,两者呈负相关,Notch2阳性表达率与PHCC患者的生存时间无相关性。结论:Notch1作为促癌基因,在PHCC的发生发展、浸润和转移起着重要作用,而Notch2在肝细胞癌中表达较低,可能具有抑制肝细胞癌生长的作用。     

体外应用不同方法培养破骨细胞的实验对比研究

目的:研究体外应用不同培养方法对所生成的破骨细胞数量及功能的影响?方法:体外采用3种方法培养破骨细胞:A组小鼠骨髓细胞中加入10 ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)培养24 h,未贴壁细胞30 ng/ml M-CSF预诱导3 d后,50 ng/ml M-CSF + 100 ng/ml核因子κB受体活化因子配体(RANKL)继续诱导;B组小鼠骨髓细胞与小鼠颅骨成骨细胞以10∶1的比例混合培养,加入1 × 10-6 mol/L 前列腺素E2(PGE2)和1 × 10-8 mol/L 维生素D3(VitD3);C组小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中加入100 ng/ml RANKL诱导培养?检测每组细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色情况及牙本质磨片吸收陷窝情况,Real-time PCR检测各组破骨细胞NFATc1?c-Fos表达情况?结果:各组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在牙本质磨片上形成吸收陷窝?B组所形成的破骨细胞数量最多,C组次之,A组最少;B组骨吸收陷窝数目最多,陷窝总面积最大,A组其次,C组最差;B组NFATc1?c-Fos表达高于C组及A组,A组表达最差?结论:3种培养破骨细胞的方法相比较,B组在破骨细胞分化和吸收功能方面优于A?C组?A?C组相比较,A组培养的破骨细胞骨吸收功能更强,C组所培养的破骨细胞分化更佳?     

不同培养方法对小鼠脂肪干细胞成骨分化的影响

目的??比较组织块贴壁法及胶原酶消化法所得脂肪干细胞的成骨分化能力。方法??分别采用组织块 贴壁法及胶原酶消化法原代培养小鼠脂肪干细胞, 观察细胞形态及细胞增殖情况, 并进行细胞鉴定, 比较两者成 骨分化能力。结果??两种方法所得脂肪干细胞在形态学上无差异,培养至第 3 代,细胞生长状态良好,生物学特 性稳定, CD44、Sca-1 表达率 >90%, CD31 表达率 <10%, 具有较好的成脂、成骨分化能力 ; 组织块贴壁法培养 所得脂肪干细胞增殖率高于胶原酶消化法（ P <0.05） ; 组织块贴壁法培养所得脂肪干细胞矿化结节、ALP 活 性及钙离子浓度高于胶原酶消化法（ P <0.05） 。结论??组织块贴壁法相对胶原酶消化法在脂肪干细胞培养及成 骨诱导分化过程中更具优势。     

Notch1和Notch2表达与宣威女性肺癌的关系及意义

目的 研究Notch1和Notch2在宣威女性肺癌中表达的临床意义.方法 采用免疫组化SP法检测54例宣威女性肺癌患者癌组织及远端正常肺组织中Notch1和Notch2表达,结合患者的临床病理特征及随访资料,探讨Notch1和Notch2在宣威女性肺癌患者病情评估及预后判断中的作用.结果 Notch1和Notch2蛋白主要表达于细胞质,在宣威女性肺癌中的阳性表达均显著高于远端正常肺组织(P＜0.05);Notch1和Notch2蛋白在不同临床分期、分化程度及淋巴结转移与否患者中的表达差异有统计学意义(P＜0.05).Notch1、Notch2蛋白在宣威女性肺癌中的表达呈正相关(P＜0.05).结论 宣威女性肺癌组织中存在Notch1和Notch2基因异常表达升高,Notch1和Notch2蛋白的表达水平结合临床分期作为宣威女性肺癌患者预后判断的参考指标有一定的指导意义.     

两种破骨细胞培养方法的比较及其吸收骨质的动态观察

目的:比较分析破骨细胞(osteoclast, OC)体外分离培养的方法,并动态观察其形态、分化及功能,为进一步探讨药物对OC性骨吸收的作用奠定基础.方法:采用两种OC的培养方法,即从新生24 h的兔长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成破骨样细胞(osteoclast-like cell, OLC)的方法,对获得的OC进行形态学和功能观察.结果: 倒置显微镜下观察,OC是一种多核巨细胞,有伪足并借助伪足的凹凸伸缩而变化形态、运动行走;HE染色均可见OC多核、胞浆有空泡;特异性抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色可见OC胞浆阳性,呈酒红色,多核.体外OC与骨片共同培养形成骨吸收陷窝,且在培养的7 d内陷窝数目和面积逐渐增大.1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成OLC,其形态结构特征与成熟OC相同,诱导出的破骨样细胞数目多于机械分离的方法,但每个细胞胞核数目总体上少于机械分离的方法,而且胞核多位于细胞周边,在骨片上形成的陷窝也较小而浅;培养液上清中的钙离子含量和酸性磷酸酶(acid phosphatase ,ACP)含量在培养的1～12 d内随时间逐渐增加.结论: 针对不同实验目的可以采用不同的分离培养OC方法.从骨髓腔内壁机械分离培养的方法可获得骨吸收功能较活跃的OC.1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成的OLC数量较多,适于对OC分化过程的研究.     

Notch信号对视网膜前体细胞分化的作用

目的：观察Notch信号对体外培养的SD大鼠视网膜前体细胞分化的影响。方法：从胎龄16 d的SD大鼠分离视网膜神经上皮,采用悬浮法培养视网膜前体细胞。实验分Notch信号抑制组和对照组两组。第14天行免疫细胞化学法分析细胞类型、Notch信号的表达及变化。结果：视网膜前体细胞大部分表达Notch1胞内段及其下游转录因子Hes1,少量细胞表达bHLH转录因子NeuroD和Mash1;自发分化后大量细胞表达bHLH转录因子NeuroD和Mash1,少量细胞表达Notch 1胞内段和Hes1。Notch信号抑制组Nestin,GFAP阳性率显著低于对照组,β-tubulin阳性率显著高于对照组,而Recoverin阳性率与对照组差异无统计学意义。结论：Notch1信号在体外可能参与了对视网膜前体细胞分化的抑制,抑制Notch信号可部分促进视网膜前体细胞向神经元分化,同时抑制了神经胶质细胞的分化。     

Notch在血液肿瘤细胞周期阻滞中的作用

细胞周期调控依赖多种调控蛋白协同作用以及生长因子等细胞外因素通过信号转导调控。这中间任一环节异常都可能引起细胞周期阻滞。p53、p21以及p16基因使细胞停滞在G1期的研究已相当透彻。Notch信号传递途径在胚胎发育和肿瘤血管发生中扮演重要的角色,尚有抑制Notch达到抑制肿瘤细胞增长的目的。新近研究发现,由配体刺激的Notch活化调节了急慢性髓细胞白血病细胞增长,Notch系统对白血病的治疗是一个很有前景的途径。     

鹿角脱盘对辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤Notch2基因表达和免疫功能的影响

目的：观察鹿角脱盘对辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤Notch2基因的表达和免疫功能的影响,探讨其在辐射致癌过程中的作用。方法：将90只近交系BALB/c小鼠随机分成对照组、照射组和照射给药组,每组30只。照射组和照射给药组小鼠采用X射线照射,建立胸腺淋巴瘤动物模型,照射后给予照射给药组小鼠喂饲含鹿角脱盘超微粉的鼠粮。6个月后,取全血和胸腺,采用RT-PCR和Western blotting法分别检测胸腺淋巴瘤组织中Notch2 mRNA和蛋白表达水平;采用ELISA法检测血清免疫球蛋白（IgG、IgA和IgM）水平,应用SOD试剂盒检测血清中SOD活性。结果：照射组和照射给药组小鼠胸腺瘤发生率分别为53.33%（16/30）和36.67%（11/30）;照射组小鼠胸腺瘤组织中Notch2 mRNA和蛋白表达水平较对照组小鼠正常胸腺组织均明显升高（P<0.05）,而照射给药组小鼠胸腺瘤组织中Notch2 mRNA和蛋白表达水平均低于照射组（P<0.05）;照射组小鼠血清中IgG、IgA和IgM水平均低于对照组（P<0.05）,而照射给药组小鼠血清中IgG、IgM和血红蛋白水平及SOD活性均高于照射组（P<0.05）。结论：电离辐射激活Notch2基因和蛋白的高表达及降低小鼠免疫功能可能是辐射诱发胸腺淋巴瘤的发生机制之一;鹿角脱盘可通过抑制Notch2基因和蛋白的表达及提高小鼠免疫功能而降低辐射致癌的发生率,起到抑制肿瘤的作用。