降落和重叠延伸PCR构建靶向肿瘤干细胞腺病毒载体及感染实验

目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1.KNOB△HI,同时在缺失HI环部位引入EcoRV限制性酶切位点。在此基础上,用降落PCR克隆纤毛基因全长编码区序列,构建出腺病毒穿梭质粒pNEB-F5。利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。再与pAdEasy-1,pShuttle-GFP在E.coli BJ5183中同源重组,得腺病毒载体Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP。用Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP分别感染CD133+人大肠癌细胞株SW480,通过荧光显微镜观察感染效率。结果降落PCR和重叠延伸PCR都扩增出特异性条带,测序结果与预期相符。与Ad5-GFP相比,Ad5FHI-GFP对CD133+人大肠癌细胞株SW480有显著提高。结论利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,其对CD133+人大肠癌细胞株SW480实验显示Ad5FHI-GFP组感染效率明显强于Ad5-GFP组。     

降落和重叠延伸PCR构建靶向肿瘤干细胞腺病毒载体及感染实验

目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1.KNOB△HI,同时在缺失HI环部位引入EcoRV限制性酶切位点。在此基础上,用降落PCR克隆纤毛基因全长编码区序列,构建出腺病毒穿梭质粒pNEB-F5。利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。再与pAdEasy-1,pShuttle-GFP在E.coli BJ5183中同源重组,得腺病毒载体Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP。用Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP分别感染CD133+人大肠癌细胞株SW480,通过荧光显微镜观察感染效率。结果降落PCR和重叠延伸PCR都扩增出特异性条带,测序结果与预期相符。与Ad5-GFP相比,Ad5FHI-GFP对CD133+人大肠癌细胞株SW480有显著提高。结论利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的...     

获得重构基因的简捷方法--重叠延伸PCR

目的：构建IFN-β信号肽序列与白细胞介素18（IL-18）成熟肽的重组嵌合分子。方法：从BALB/c鼠基因组DNA扩增IFN-β信号肽序列;由小鼠Pro-IL-18真核表达质粒获得IL-18成熟肽序列;以非对称PCR技术得到IFN-β信号肽编码区的反义链和IL-18成熟肽正链;采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)产生具有IFN-β信号肽与IL-18成熟肽的嵌合编码序列;定向连方式构建嵌合IL-18的表达质粒并测序。结果：连续胶PAGE表明非对称PCR可分别扩增出两个靶序列的特异性单链,大小符合预期。IFN-β信号肽对称PCR产物与IL-18非对称PCR产物混合作为模板,进行重叠延伸;电泳分析可见清晰的嵌合片段;测序显示重组质粒的表达框由两个设计的靶序列构成,且无移码。 结论：重叠延伸PCR是一种获得重构基因的简捷方法。     

高GC含量DNA序列PCR扩增的引物设计

目的建立一种高GC含量DNA序列PCR扩增的引物设计方法。方法共设计了15对高GC含量（66.0%~84.0%）DNA序列PCR扩增引物,引物Tm值均≥79.7℃,引物Tm差值（△Tm）均≤1℃。对本研究所设计引物及相关参考文献中部分引物的参数进行统计学分析。另外,基于本研究方法,设计了26对引物,以验证该方法在非高GC含量（35.2%~53.5%）DNA序列PCR扩增中的实用性。结果采用本研究方法,所有15对高GC含量DNA序列均成功扩增;统计结果显示,Tm值和△Tm是影响高GC含量DNA序列扩增的主要因素。结论设计具有较高Tm值和较低△Tm的引物可有效的解决高GC含量DNA序列的PCR扩增问题。另外,在较高的退火温度下,引物或DNA序列的二级结构无法形成。     

高GC hTwist表达载体构建及其表达条件优化

 目的 构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法 以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx 加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实：我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论 上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定了基础。     

一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法

目的:建立一种简便快速的重叠延伸PCR基因定点突变方法.方法:采用重叠延伸PCR的方法将人TGF-β2基因启动子区(-270bp～ 280bp)-114bp的5'CGTG3'序列定点突变为5'TTTG3',前两次PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需纯化,直接将胶条切下置于EP管中,-80℃冷冻10min,然后将胶条离心后分别取上清液作为模板进行第三次PCR,以获得全长的突变目的基因,最后将此突变基因插入报告载体pGL3-Basic进行基因测序.结果:人TGF-β2基因启动子区突变序列的测序结果与预期完全一致.结论:此方法简便经济、突变准确,是一种非常实用的基因定点突变方法.     

重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的：基于重叠延伸PCR (SOE PCR)技术构建转录因子EB (TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法：根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的 DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用Bam HⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E. coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果：第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段...     

用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原基因中的突变

目的：利用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因中的突变碱基。方法：针对构建的重组质粒PGEM-7Z／HBcAg中的两处突变设计三对引物,PCR定点突变后对重新构建的PGEM-7Z／HBcAg进行菌落PCR和酶切鉴定,初步筛选的阳性克隆进一步通过序列分析进行确证。结果：经PCR定点突变后,测序证明HBcAg基因序列与设计完全一致。结论：用该方法成功纠正了人工合成的乙肝病毒核心抗原基因中两个碱基的缺失,获得了预期的目的基因。     

应用改良PCR法构建高GC含量启动子多位点定点突变载体

目的利用StrataGene公司的QuickChangeTM定点突变试剂盒对高GC含量的人肝刺激因子启动子进行多位点定点突变。方法采用含有多位点突变的引物扩增启动子片段,通过加入不同浓度的DMSO,降低高GC含量模板及引物的解链温度,利用乙醇沉淀提高酶切产物的浓度。结果经测序鉴定成功构建5个含有不同突变位点的hHSS启动子突变载体。结论这种改良的PCR方法提高了对高GC含量启动子进行扩增的效率,具有快速、简便、经济、成功率高的特点,是值得推广的多位点定点突变载体构建方法。     

重叠PCR克隆Exendin-4的基因及序列分析

目的克隆Exendin-4 39肽氨基酸序列基因编码区cDNA。方法根据Exendin-4氨基酸序列编码cDNA,设计正、负向引物/模板链,利用重叠延伸PCR法扩增出Exendin-4编码区基因DNA片段;将获得的基因片段插入pGEM-T-Easy质粒中;转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,利用限制性内切酶及核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果经质粒DNA酶切分析及序列测定,获得了Exendin-4 DNA片段序列。结论本研究成功克隆了Exendin-4 cDNA,为下一步构建Exendin-4真核表达载体打下基础,也为Exendin-4基因治疗糖尿病提供了前提条件。     

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的：将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列进行拼接，形成融合基因。方法：利用重叠区扩增基因拼接法，分别扩增hPLAP-1C末端信号肽序列和SEA基因序列。然后，将二段基因拼接并与pGEM-T克隆栽体连接，酶切和测序鉴定。结果：成功扩增出hPLAP-1C末端信号肽序列131bp和SEA基因序列796bp；经测序证实，二段基因序列成功拼接(901bp)。结论：重叠区扩增基因拼接法能将SEA基因与hPLAP-1C末端信号肽序列拼接，形成融合基因。     

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析

目的: 获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene,HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析,检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达,为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法: 用3'RACE 和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析,用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果: HTA基因全长序列为1414 bp,经分析该序列包含3个外显子,2个内含子,其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系,而不表达于正常细胞系。结论: 成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达,作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。     

人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia Pastoris酵母中的表达

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定.方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肰的β-NGF基因序列;用A-r克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入CS115中,甲醇诱导分泌蛋白.结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SIS-PAGE电泳在14.OKD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性.结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性.     

倍美力片中的结合雌激素含量测定和GC指纹图谱分析

目的:测定倍美力片中10种结合雌激素成分的含量,建立倍美力片的气相色谱法(GC)指纹图谱,评价倍美力片的内在质量。方法:采用GC法测定倍美力片中10种结合雌激素成分的含量。Rtx-225毛细管柱色谱(15m×0.25mm×0.25μm),柱温为210℃;载气为氢气,流速2.5ml/min,载气分流比为1∶3;载气线速度为60cm/s;以FID为检测器,3-O-甲基雌酮为内标,雌酮为内参照物。结果:通过GC法测定了10批倍美力片中的已知10种成分的含量,确定了10批倍美力片中的20个共有峰,得到分离度和重现性均较好的倍美力片GC指纹图谱;所建立的20个特征峰参数与美国食品药品监督管理局(FDA)提供参数相近。结论:本文所建立的结合雌激素含量测定和GC指纹图谱检测方法准确、可靠,重现性好,可作为结合雌激素产品内在质量控制的标准;倍美力片含有FDA规定的多种成分。     

大鼠细胞色素P450—2J3基因的克隆及其在293细胞中的表达

目的克隆大鼠CYP2 J3基因并构建pcDNA 3.1( )-CYP2 J3真核表达载体,检测其在293细胞中的表达。方法提取大鼠肝脏组织总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)扩增大鼠CYP2 J3基因,克隆入真核表达载体pcDNA 3.1( )。脂质体转染293细胞,用W estern b lotting鉴定其在293细胞表达。结果运用RT-PCR和OE-PCR获得CYP2 J3基因开放读码框架(ORF)全长序列,经酶切鉴定正确。测序结果与基因Gen Bank提交序列完全一致并成功构建真核表达载体pcDNA 3.1( )-CYP2 J3。W estern b lotting结果显示,转染pcD-NA 3.1( )-CYP2 J3后的293细胞能稳定有效表达CYP2 J3蛋白。结论大鼠CYP2 J3基因的成功克隆以及pcDNA3.1( )-CYP2 J3载体的成功构建,为CYP2 J3基因的功能研究和相关疾病的研究提供了可行的工具。     

抗HSV－糖蛋白（gp30）单克隆抗体重链可变区基因的克隆及序列分析

目的：获得鼠抗ＨＳＶ－２型特异性糖蛋白（ｇｐ３０）单抗重链可变区基因，为基因工程改建及表达奠定基础。方法：从分泌高中和活性的鼠抗ＨＳＶ－２型特异性单抗杂交瘤细胞系中提取ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，用ＰＣＲ法扩增出抗体重链可变区基因，并克隆入质粒，随机挑选阳性克隆进行核酸序列分析．结果：基因全长３５７ｂｐ，编码１１９个氨基酸，含有维持抗体结构的半胱氨酸，序列内无终止码．结论：所克隆基因具备小鼠抗体重链可变区基因结构特征，与已确认的小鼠抗体ＶＨ基因有较高的同源性，隶属于Ｋａｂａｔ分类体系中的小鼠抗体重链（Ａ）亚组．     

国产闭鞘姜属植物中薯蓣皂甙元的含量测定

姜科闭鞘姜属(CostusL.)植物全世界约150种,分布于热带非洲、南美洲和东南亚等地。我国有3种:闭鞘姜Costusspeciosus(Koen.)Smith、莴笋花CostuslacerusGagnep.和光叶闭鞘姜CostustonkinensisGagnep.,分布于广东、广西和云南等地。1970年Dasgupta等[1]报道从产于印度的闭鞘姜根茎中分离纯化得到薯蓣皂甙元,得率为2.12%,此后,许多学者对该属植物的化学成分和药理作用等进行了研究。目前,作为合成甾体激素的原料药,薯蓣皂甙元日益紧缺,为了合理开发利用国产闭鞘姜属植物资源,我们对其进行了薯蓣皂甙元的含量测定。薯蓣皂甙元的含量测定方…     

人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达

目的：克隆肿瘤特异性共享抗原mage-3基因,制备基于α－病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法：用RT-PCR方法从黑色素瘤细胞系LB373中制备mage-3基因,以含α－病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体,构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞,用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage-3蛋白的表达。结果：正确构建了mage-3/pSMART2a重组质粒,并且在转化此质粒的293细胞中检测出了mage-3蛋白的表达。结论：此重组mage-3/pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗,可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。