大鼠局灶性脑缺血再灌后转录因子ATF4的表达变化

目的观察鼠脑缺血再灌注后ATF4mRNA及蛋白的表达变化。方法制备SD大鼠大脑中动脉闭塞模型,RT-PCR法、免疫组化染色分别测定鼠脑缺血半暗带区再灌注后不同时相ATF4mRNA及蛋白的表达变化。结果模型组ATF4mRNA与蛋白于再灌注后1h表达增加;ATF4mRNA表达于再灌注后6h达高峰,其蛋白表达于再灌注后24h达高峰。结论鼠脑缺血再灌注可诱导ATF4在缺血半暗带区表达,提示ATF4可能在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用。     

大鼠短暂局灶性脑缺血再灌注后核转录因子-kB的表达

目的　研究核转录因子 - k B(NF- k B)在局灶性脑缺血再灌注中的动态表达规律及其作用。方法　采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。应用细胞免疫组织化学法分析 NF- k B的移位 ,采用 Western- blot法检测脑组织中核 NF- k B的表达量。结果　局灶性脑缺血再灌注后 NF- k B明显从细胞浆移位于细胞核 ,核 NF- k B的表达量显著增加 (P<0 .0 1)。结论　局灶性脑缺血再灌注能够引起 NF- k B的表达增加 ,进一步产生炎症和免疫反应 ,从而参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制     

大鼠局灶性脑缺血预处理后激活转录因子4mRNA及其蛋白表达的变化

目的 观察缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注后激活转录因子4 (ATF4) mRNA及其蛋白表达的影响.方法 SD大鼠120只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)3组,每组按照再缺血后12h、ld、2d、3d4个时间点分为4个亚组.采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用原位杂交法和Western blot法观察再缺血后各个时间点ATF4 mRNA及其蛋白表达的变化.结果 MCAO组12hATF4mRNA及其蛋白表达均达高峰(P＜0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降;BIP组较MCAO组ATF4 mRNA及其蛋白表达均明显降低(P＜0.05,P＜0.01).结论脑缺血预处理可能通过抑制ATF4表达发挥其神经保护作用.     

大鼠局灶性脑缺血后神经营养因子表达的自然变化

目的 观察大鼠局灶性脑缺血后大鼠神经行为、梗死体积、组织形态及缺血半暗带神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平变化。方法 将健康雄性SD大鼠24只随机分为2组,Ⅰ组(假手术组); Ⅱ组(脑缺血组)。用线栓法建立动物模型,不给予再灌注,各组在术后48h断头取脑,处死前行神经功能评分,用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色计算脑梗死体积,用HE染色观察组织学形态,用免疫组织化学染色观察NGF、BDNF的表达水平。结果 Ⅰ组在神经功能评分、梗死体积、组织形态及大脑皮层相应部位NGF、BDNF阳性细胞数均正常。与Ⅰ组比较,Ⅱ组的神经功能评分和梗死体积均严重受损; 光镜下Ⅱ组缺血性病理改变较重,与Ⅰ组比较,Ⅱ组缺血半暗带NGF、BDNF阳性神经元数增加(P<0.05)。结论 脑缺血本身可上调缺血半暗带NGF、BDNF的表达水平。     

大鼠局灶性脑缺血后FADD和Daxx的表达

目的 探讨大鼠脑缺血再灌注后Fas相关蛋白FADD和Daxx在缺血半暗带的表达变化.方法 ①将SD大鼠随机分为假手术组和模型组.线栓法制备大鼠大脑中动脉梗阻(MCAO)模型,缺血2 h后恢复再灌注,再灌注后1、3、6、12和24 h处死动物.RT-PCR、免疫组织化学、Western blot等方法分别检测缺血半暗带FADD、Daxx mRNA和蛋白的表达变化;②免疫荧光双标分别标记神经元核区和FADD及Daxx蛋白染色区,激光扫描共聚焦显微镜观察二者在缺血再灌注前后神经元的定位.结果 再灌注3 h假手术组可以检测到少量的FADD mRNA和蛋白表达(mRNA:0.441±0.038;蛋白:156.78±13.04),模型组FADD mRNA和蛋白表达变化一致,在再灌注3 h开始上升(mRNA:0.628±0.059,P＜0.01;蛋白:131.28±5.99,F=15.692,P＜0.01),12 h达到高峰(mRNA:0.971±0.070,F=56.233,P＜0.01;蛋白:104.36±8.55,P＜0.01),24 h显著下降(mRNA:0.551±0.042,P＜0.05;蛋白:123.01±11.87,P＜0.01),模型组FADD mRNA和蛋白表达变化一致,在再灌注3 h开始上升(P＜0.01),12 h达到高峰(P＜0.01),24h显著下降(P＜0.05);假手术组可以检测到较高的Daxx mRNA和蛋白表达;模型组Daxx mRNA和蛋白表达变化一致,再灌注3 h开始上升(P＜0.01),此后持续上升,一直至24 h仍维持较高水平表达(P＜0.01);激光扫描共聚焦显微镜显示脑缺血再灌注后FADD的免疫活性位于胞质,Daxx的免疫活性从胞核向胞质移位.结论 大鼠脑缺血急性期FADD、Daxx mRNA和蛋白表达增加,可能参与了脑缺血后促凋亡作用.     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后MDM2的表达

目的探讨局灶性脑缺血再灌注后(murine double-minute 2,mdm2)mRNA表达的时间分布特征。方法采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2h再灌注模型,RT-PCR技术检测mdm2 mRNA的表达。结果 Mdm2 mRNA在半暗带区缺血再灌注后6h表达开始增加,12h达高峰,24h开始下降,7d仍有表达。结论脑缺血再灌注后mdm2 mRNA表达增加可能是机体对缺血损伤的保护性反应。     

丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注后NF-κB与p38MAPK表达的影响

目的探讨丁苯酞(NBP)注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注(I/R)损伤后核转录因子-κB(NF-κB)与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)表达的影响。方法清洁级健康SD大鼠100只,根据随机分组法分成5组:假手术组(Sham组)、I/R组、NBP小剂量组(20mg·Lkg~(-1))、NBP中剂量组(40mg·Lkg~(-1))和NBP大剂量组(80mg·Lkg~(-1))各20只。采用Zea-longa线栓法制作大鼠局灶性IR模型,使用TTC染色法检测各组大鼠的脑梗死体积,苏木精-伊红染色法检测各组大鼠的脑梗死病理变化,利用Western blotting方法检测各组大鼠的NF-κB与p38MAPK表达以及NBP组大鼠经不同剂量NBP处理后的NF-κB与p38MAPK表达。结果 NBP组和IR组脑梗死体积明显高于Sham组,NBP组明显低于I/R组(P<0.05)。I/R组和Sham组相比,细胞排列紊乱,细胞数目减少,细胞间隙增宽,甚至严重的出现核固缩。I/R组和NBP组比Sham组中的p-NF-κB与p-p38MAPK表达升高(P<0.05)。结论 NBP能够抑制大鼠脑组织中磷酸化NF-B和磷酸化p38MAPK蛋白水平增加,减轻脑I/R损伤。     

TLR4及MyD88在大鼠局灶性脑缺血耐受过程中的作用

目的本实验拟探究经脑缺血预处理后Toll样受体4（TLR4）及其下游髓样分化因子88（MyD88）蛋白在脑缺血耐受中的作用。方法采用改进的大鼠大脑中动脉线栓法构造大鼠脑缺血预处理模型,取大鼠脑组织后应用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（Trc）染色观察鼠脑梗死面积变化,干湿法探究脑水肿程度改变,并通过Westernblot横向对比各组TLR4及MyD88蛋白表达情况。结果缺血处理后大鼠当其再次面临缺血再灌注损伤时,TLR4蛋白和MyD88蛋白表达在各观察时间点均呈现了不同程度的降低,且梗死面积及脑水肿程度也有所降低。结论经脑缺血预处理后脑组织可产生对致死性再灌注损伤的耐受,这种耐受是通过TLR4及MyD88蛋白的下调表达实现的并具有一定的时效性。     

大鼠局灶性脑缺血后的细胞凋亡现象

目的 :研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后的细胞凋亡现象及其时间和解剖分布。方法 :雄性SD大鼠 3 0只 ,用改良Longa法制左右侧大脑中动脉梗死模型 ,根据缺血时间不同进行随机分组 ;用电子显微镜和TUNEL染色检测细胞凋亡。结果 :电镜和光镜下显示 ,脑缺血后有DNA断裂和细胞凋亡现象 ,TUNEL染色示随缺血时间延长 ,凋亡细胞数目逐渐增加 ,缺血 1h时为每张切片 (83± 2 1)个 ,2h时为 (2 3 3± 3 6)个 ,4h时为 (3 73± 3 0 )个 (P <0 0 1) ;凋亡细胞主要分布在梗死灶边缘区的内侧。结论 :脑组织缺血后存在着细胞凋亡现象 ,凋亡在梗死灶的发展过程中起一定作用。     

大鼠局灶性脑缺血半暗带葡萄糖转运子3 mRNA的表达

目的 研究大鼠局灶性脑缺血不同缺血时间皮质半暗带和中心区葡萄糖转运子3（GLUT3）转录水平的表达规律。方法 用插线法建立大鼠局灶性脑缺血模型，剥取缺血半暗带及中心区皮质组织，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），测定GLUT3mRNA水平的变化。结果 缺血半暗带GLUT3mRNA在缺血3小时升高，24小时达到高峰，96小时后基本恢复正常。缺血中心区GLUT3mRNA在缺血后3小时有一短暂的升高，随后迅速下降呈低水平表达。结论 GLUT3在缺血半暗带的表达上调，有可能是机体对缺血损伤的保护性反应。     

大鼠局灶性脑缺血后脑组织环氧酶-2蛋白的表达

目的　观察大鼠持久性脑缺血不同时相过程中脑组织环氧酶 2蛋白的表达特性。方法　采用线栓法大鼠大脑中动脉阻塞模型 ,以尾壳核平面为模板 ,应用免疫组织化学方法观察假手术组及缺血 1、4、12、2 4和 48h组环氧酶 2蛋白阳性染色细胞的分布部位及数量。结果　正常对照组、假手术组、缺血 1和 4h组均无阳性染色细胞 ,缺血 12h阳性染色细胞开始增多 [(46± 19)个 /mm2 ],缺血 2 4h达到高峰 [(70± 14)个 /mm2 ],缺血 48h阳性细胞数量减少 [(41± 13)个 /mm2 ],差异有显著意义。阳性染色细胞仅见于额顶部大脑皮质上部、扣带皮质中细胞形态完整的神经元及血管内皮细胞 ,而胶质细胞并无着色。结论　环氧酶 2蛋白主要由缺血半暗带的神经元和血管内皮细胞表达 ,缺血早期环氧酶 2蛋白并不表达 ,表达时间具有延迟性 ,提示其可能与迟发性神经元损伤有关。     

大鼠局灶脑缺血酪氨酸激酶B表达图像分析

目的 观察局灶脑缺血大鼠酪氨酸酶B(TrkB)阳性神经元的表达,探讨脑缺血损伤与TrkB的关系。方法 制作大鼠局灶脑缺血模型,应用免疫组化方法观察不同缺血时间、不同脑区TrkB阳性神经元数的动态改变,并进行图像分析。结果 正常脑组织内即存在着一定数量的TrkB阳性神经元,脑缺血损伤后,在额、顶叶皮质及尾壳核外侧部的变性坏死区中心,TrkB阳性神经元缺失,而变性坏死区周边的半暗带区TrkB阳性神经元自缺血6h开始明显增多,且持续于整个缺血期。其它部位TrkB表达也不同程度增强。方差分析显示,与正常对照组比较,除假手术组外(P>O.05).缺血组各组均差异显著(P<0.01)。结论 脑缺血损伤后TrkB的表达有显著改变,考虑与神经元的损伤修复机制有关。     

大鼠脑缺血后PEDF表达及替米沙坦调控作用的研究

目的动态观察大鼠脑缺血后色素上皮源性生长因子(PEDF)的表达变化,并探讨替米沙坦的调控机制。方法线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠模型。实验1,动态观察PEDF蛋白和基因表达;实验2,替米沙坦干预,采用Western blot和qR-T PCR观察PEDF基因和蛋白变化,比较各组脑梗死体积、患侧脑水肿和神经功能。结果 MCAO后24h开始,PEDF表达明显减少。替米沙坦通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)上调PEDF,明显改善神经功能缺失,减轻脑水肿,减小梗死体积。结论调控内生性PEDF表达可能是治疗脑缺血的新靶点。     

局灶脑缺血鼠下丘脑室旁核促肾上腺皮质素释放激素的表达

目的探讨脑缺血对下丘脑垂体肾上腺轴的影响。方法动态观察局灶脑缺血鼠下丘脑室旁核（ＰＶＮ）促肾上腺皮质素释放激素（ＣＲＨ）的变化，采用免疫组化方法显示ＰＶＮＣＲＨ的表达。结果正常对照组鼠下丘脑ＰＶＮ有少量ＣＲＨ的表达，脑缺血２天内下丘脑ＰＶＮ无ＣＲＨ的表达，脑缺血第三天后ＣＲＨ的表达明显增多，且一直持续到脑缺血的第八周，而假手术组４周基本恢复正常。结论脑缺血后下丘脑ＰＶＮ的ＣＲＨ分泌细胞立即被激活；长期脑缺血使ＣＲＨ分泌细胞的活动增强。     

大鼠脑缺血-再灌注后小脑AQP4蛋白的表达变化

目的观察大鼠大脑中动脉闭塞后远隔部位小脑组织形态学改变以及水通道蛋白—4(AQP4)的表达变化。方法健康雄性SD大鼠40只,体质量260~300g,随机分成4组,分别为脑缺血—再灌注12h、1d、3d组和假手术组,采用线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型,Longa评分法对大鼠进行神经功能评分,苏木精—伊红染色观察大鼠小脑的组织形态学变化;免疫组化染色测定大鼠小脑AQP4蛋白表达,测量平均吸光度值(mean optical density,MOD)评价染色程度。结果假手术组动物麻醉苏醒后未见神经功能缺损。脑缺血—再灌注12h神经功能评分升高,12h~1d之间无明显差异,3d神经功能评分减低(P0.05)。苏木精—伊红染色显示假手术组小脑结构未见明显异常,脑缺血—再灌注后12h小脑区出现缺血性损害,细胞肿胀,胞核深染,但细胞排列尚好;1~3d时胞核浓染加深,出现核固缩,细胞排列紊乱,间隙增宽。假手术组小脑区AQP4表达极少,脑缺血—再灌注12h、1d和3d大鼠缺血侧小脑区均可见AQP4阳性着色细胞,12h~1d AQP4 MOD值随时间延长逐渐增高,3d时较1d时降低,3组AQP4表达水平均明显高于假手术组(P0.05)。结论大脑中动脉脑梗死后小脑区存在损伤,并且有AQP4表达增加,小脑区AQP4表达同神经功能损伤程度密切相关。     

局灶性脑缺血后海马各区NMDAR表达的实验研究

目的：观察局灶性脑缺血对N－甲基－D－天门冬氨酸受体（NMDAR）及NMDARmRNA表达的影响。方法：采用线栓法制作可复流脑中动脉闭塞大鼠模型。30只雄性大鼠随机分为3组;正常组、假手术组和大脑中动脉闭塞（MCAO）组。MCADO后第5天处死动物,取脑组织进行NR1免疫组化及NR1mRNA原们杂交检测。结果（1）正常组海马各区均有NR1阳性细胞伯分布,其中海马CA3区、DG区分布较多;MCAO组NR1阳性细胞在海马CA1区、CA3区及DG区的数密度、光密度较正常组高;（2）正常组海马各区均有极少量的NR1mRNA阳性细胞分布,MCAO组NR1mRNA阳性细胞在海马CA1区、CA3区的数密度、光密度均较正常组有显著性增高。结论：大鼠海马各区都存在着NR1及NR1mRNA不同程度的表达,MCAO后NR1及NR1mRNA的表达水平上调。     

超负荷血糖对鼠局灶性脑缺血侧皮质内皮抑素表达的影响

目的观察超负荷血糖对鼠局灶性脑缺血侧皮质区内皮抑素(endostatin)表达的影响,进一步探讨超负荷血糖加重脑缺血损伤的分子机制。方法用SD大鼠腹腔内注射链脲佐菌素首先建立糖尿病高血糖大鼠模型,继而应用栓线法建立永久性局灶性脑缺血模型。随机分为3大组:假手术组、脑缺血组和糖尿病脑缺血组。于缺血24h时间点行神经功能评分、TTC染色测梗死面积、TUNEL法检测细胞凋亡数目、免疫组化及Western blot检测ES表达,并进行图像分析。结果糖尿病脑缺血组的神经功能评分为(4.73±0.35)、梗死面积为(50.12±3.54)、细胞凋亡数为(26.22±2.35)、免疫组化检测ES为(99.35±3.25)及Western blot检测ES为(1.193±0.045)。脑缺血组的神经功能评分为(3.18±0.65)、梗死面积为(39.98±2.02)、细胞凋亡数为(17.28±1.01)、免疫组化检测ES为(113.17±1.35)及Western blot检测ES为(1.033±0.032)。与脑缺血组相比,糖尿病脑缺血组的神经功能评分、梗死面积、细胞凋亡数、ES蛋白表达均明显增加(P<0.05)。结论血管再生可能参与了超负荷血糖加重脑缺血损伤的过程,上调ES表达可能是超负荷血糖加重脑缺血损伤的机制之一。     

大鼠局灶性脑缺血水通道蛋白4的变化

目的 探讨缺血性脑水肿后水通道蛋白4(AQP4)的变化，研究脑水肿的发病机制。方法 选用Wis—tar雄性大鼠42只，体重250～300g，鼠龄3～4月，按缺血时间随机分为6h、1d、3d、5d、7d、14d及假手术组，参考Lon—ga等方法建立大鼠大脑缺血模型，应用免疫组化染色检测脑组织中AQP4的变化。结果 AQP4在缺血组织表达增强，缺血6h即增强，3d达高峰，7d恢复正常。结论 AQP4是影响缺血性脑水肿的重要因素。