表皮松解性掌跖角化症一家系KRT9基因突变研究

目的研究表皮松解性掌跖角化症一家系角蛋白9(keratin 9,KRT9)基因突变情况。方法用聚合酶链反应技术扩增家系成员及家系外5O名正常人KRT9基因外显子1,DNA序列分析寻找突变位点。结果家系中患者KRT9基因外显子1第488位碱基C→T,导致162位的精氨酸被谷氨酸取代(R162Q),家系内正常成员及家系外5O名正常人均不存在此突变。结论 KRT9基因外显子1第488位密码子发生C→T突变导致该家系患者发生表皮松解性掌跖角化症。     

甲状腺激素抵抗综合征一家系TRβ基因突变研究

目的研究一个甲状腺激素抵抗综合征家系甲状腺激素受β（thyroid hormone receptor β，TRβ）基因（TRβ）突变情况。方法提取患者及14名家系成员、7名健康对照的外周血基因组DNA，PCR分段扩增刀够基因的第7～10外显子，产物纯化后直接进行DNA测序检测突变。结果测序结果，该家系中5名成员TRβ基因第10外显子的1642位核苷酸发生C→G的转换突变，该突变为错义突变，使该位点所编码的氨基酸由脯氨酸变为丙氨酸（P1453A），同时刀够基因第7外显子的第1020位核苷酸发生C→T的转换突变，该突变为一同义突变，其所编码的氨基酸仍为苯丙氨酸（F245F），两种突变均为杂合子突变。结论在中国人中发现1例TRβ基因突变所致的甲状腺激素抵抗综合征家系。     

变性高效液相色谱检测 PKD2基因突变

目的　利用变性高效液相色谱分析技术 ( denaturing high- performance liquidchromatography,DHPL C) ,检测 2型常染色体显性遗传性多囊肾病致病基因 ( polycystic kidney diseasegene 2 ,PKD2 )突变。方法　收集临床确诊的汉族常染色体显性遗传性多囊肾病 ( autosomal dominantpolycystic kidney disease,ADPKD) 94个家系 ,提取外周血白细胞 DNA,用聚合酶链反应 ( polymerasechain reaction,PCR)扩增目的基因的全编码区 ,DHPL C对 PCR产物进行突变筛选 ,出现异常峰型的DNA片段进行核苷酸序列测定 ,明确突变位点和类型。结果　以 5 0名健康志愿者为正常对照 ,从 94例患者家系中成功检测出 8种突变 ,包括 2种无义突变、3种移码突变、3种错义突变。无义突变分别位于第 5和13外显子 ( 12 4 9C→ T,2 4 0 7C→ T) ,编码氨基酸分别在 4 17和 80 3位形成终止密码子。移码突变分别位于第2、12和 13外显子 ( 6 36 - 6 37ins T,2 348- 2 35 1del AGAA,2 4 0 1del A)。错义突变分别位于第 1、4和 5外显子 ( 5 6 8G→ A,96 4 C→T,116 8G→A) ,其编码氨基酸发生改变 ( 190 Ala→ Thr,32 2 Arg→Trp,390 Gly→ Ser)。结论　所检测出的 8种突变 ,为 ADPKD患者的基因诊断、产前诊断和囊肿前诊断积累了资料     

视网膜色素变性隐性遗传致病基因PDE6B的突变分析

目的 了解常染色体隐性遗传视网膜色素变性(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)致病基因磷酸二酯酶β亚单位(phosphodiesterase β subunit,PDE6B)基因在中国视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)患者中的突变谱及突变率。方法 应用聚合酶链反应—单链构象多态性，对收集的35个常染色体隐性RP家系38例患者和55例散发RP患者进行PDE6B基因的22个外显子和5’端非翻译区突变筛选；对有变异条带者进行DNA序列分析。结果 测得一个常染色体隐性家系患者PDE6B基因第11外显子5’端上游第19位碱基(第10内含子内)发生G→A转换。1例散发RP患者同时检测到第6外显子第2492位点碱基T颠换为C和第10外显子5’端上游(第9内含子内)第27—28碱基之间有两个碱基TG插入。另两例散发RP患者分别发现第4外显子5’端上游30—31碱基处两个碱基GT插入和第18外显子3’端下游第15个碱基发生G→C颠换。结论 发现1名中国人的散发RP患者携带RP致病基因PDE6B基因的一种复合杂合突变。中国人的PDE6B基因内含子有多种变异。     

一个先天性无虹膜家系PAX6基因的新突变

目的 通过分子遗传学分析,确定中国东北地区一个先天性无虹膜家系PAX6基因的突变位点.方法 采集一个家系3例先天性虹膜患者及5名健康成员和100名正常对照者的外周静脉血,应用聚合酶链反应,直接测序法,单链构象多态性技术以及T载体克隆测序等方法确定其突变位点.结果 患者为第5外显子从483位点开始9个碱基缺失的框内缺失突变:其密码子位置为41～43,即缺失门冬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸3个氨基酸(c.483del9).结论 PAX6基因是先天性无虹膜的致病基因,发现了PAX6基因一个新的突变位点.     

完全型雄激素不敏感综合征雄激素受体基因突变的鉴定与分析

目的 对l例完全型雄激素不敏感综合征(complete androgen insensitivity syndrome,CAIS)患者的雄激素受体(androgen receptor,AR)基因进行分析,寻找潜在的突变位点,并进一步分析其发病原因.方法 提取患者外周血全基因组DNA,扩增位于X染色体AR基因8个外显子及邻近外显子与内含子剪切位点DNA序列,对扩增产物直接进行DNA序列测定,与GenBank中的基因序列进行比对.结果 该患者AR基因在第6外显子核苷酸序列3507位点缺失一个碱基C而引起移码突变,致使在第808位密码子出现终止密码子(TGA)使得翻译提前终止形成截短的雄激素受体蛋白.该突变可能诱导雄激素受体结合能力发生功能上的变异,导致CAIS的发生.结论 AR基因第6外显子核苷酸序列3507位点缺失碱基C引起的移码突变是一种导致CAIS新的基因突变方式,该研究丰富了AR基因突变谱,为了解CAIS的发病机制提供了新的依据.     

一例性反转综合征SRY基因分析

目的 分析1例46,XY女性性反转综合征患者的性别决定基因SRY(sex-determining region of Y chromosome)的突变类型,探讨该患者发生性反转的分子机制.方法 收集患者临床资料,抽取静脉血.体外培养外周血淋巴细胞.采用染色体G显带分析患者核型.提取患者外周血DNA,采用PCR扩增SRY基因,并将回收产物直接测序.结果 患者核型为46,XY.PCR检测患者存在SRY基因.DNA序列分析显示患者SRY基因编码区第6位碱基缺失,发生移码突变,导致编码SRY蛋白第9位亮氨酸(L)的第2位碱基T、第3位碱基A与编码第10位丝氨酸(S)的第1位碱基A组合成为终止密码TAA,翻译过程提前终止,导致SRY蛋白缺乏.结论 SRY基因编码区第6位碱基缺失导致翻泽过程提前终止,患者不能合成完整的SRY蛋白,使其在胚胎期发生性逆转.     

X-连锁无汗性外胚层发育不良一家系EDA新发突变

目的检测一X连锁无汗性外胚层发育不良家系EDA基因突变。方法提取先证者、其姐和父母外周血基因组DNA,PCR扩增EDA基因编码区的8个外显子,PCR产物测序,明确突变位点。结果先证者EDA基因6号外显子第781位胞嘧啶C突变成胸腺嘌呤T,使其编码的蛋白第261位谷氨酰胺密码子CAA变成终止密码子UAA,蛋白表达提前终止;患者的姐姐和母亲在该位点均为C/T杂合子,患者父亲在该位点为C纯合子。结论本家系中c.781C>T突变为国内外首报,是导致X连锁无汗性外胚层发育不良临床表型的原因。     

一个先天性白内障家系缝隙连接蛋白基因新突变

目的 鉴定一个中国常染色体显性遗传先天性白内障(autosomal dominant congenital cataract,ADCC)家系其致病与缝隙连接蛋白a3/a8(gap junction protein alpha3/alpha8,GJA3/GJA8)基因突变的关系.方法 对一个ADCC家系5名家系成员和100名正常健康人进行全面眼科检查.抽取外周血5 mL并提取基因组DNA.采用聚合酶链反应扩增GJA3/CJA8编码外显子及其侧翼内含子序列,纯化的PCR产物通过直接测序以筛查致病突变.结果 通过双向序列分析,发现GJA8基因第2外显子的第138位发生碱基G→A转换(c.138G》A,GGG→GGA),产生同义突变(G46G);第139个碱基因G→T颠换发生错义突变(c.139 G》T,GAT→TAT)导致第47位编码天门冬氨酸密码子突变为酪氨酸(D47Y),家系中非患者和100名对照者基因组序列均无此改变,而且生物信息检索显示GJAB基因第47位编码的天门冬氨酸具有高度的物种保守性.家系3例患者CJA3基因突变筛查未见任何碱基改变.结论 在一个中国人ADCC家系中发现GJAB基因新致病突变(D47Y).     

六个少汗性外胚层发育不全家系ED1基因的突变分析

目的 对6个少汗性外胚层发育不全(hypohidrotic ectodermal dysplasia,HED)家系进行ED1基因突变分析,为其提供遗传咨询和产前诊断.方法 采用聚合酶链反应和DNA直接测序对6个家系的先证者及其成员ED1基因的8个外显子进行序列分析.结果 6个家系患者中均检出了ED1基因突变,分别为R153C、A349T、G299S、A349T、X392Q和第9外显子缺失突变,其中R153C、X392Q和第9外显子缺失突变在中国人群中首次报告.上述位点的杂合突变在部分女性亲属中检出.结论 错义突变R153C、A349T、G299S和X392Q和第9外显子缺失是导致6个少汗性外胚层发育不全家系患者临床表型的主要原因,通过对家系个体ED1基因分析可进行携带者筛查和产前诊断.     

中国冠状动脉粥样硬化性心脏病患者MEF2A基因的新突变研究

目的研究冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）患者MEF2A基因在中国人群突变情况。方法应用聚合酶链反应．单链构象多态性（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）和DNA测序技术检测156例散发性冠心病（coronary artery disease，CAD）患者及93名健康人MEF2A基因第11外显子。结果在SSCP泳动异常标本中进行DNA直接测序后发现1例患者MEF2A基因147130（C→A）错义突变（P431Q）、147191（G→T）同义变异以及147108-147128位点21个碱基缺失而导致了7个氨基酸（424QQQQQQQ430）丧失。另有两例患者仅在147108-147128位点发现上述同样的21个碱基缺失而无错义突变和同义变异的改变。健康对照组未发现此错义与缺失突变，却发现存在同样的同义变异。结论冠心病患者在MEF2A基因第11外显子存在新的突变，此突变可能为病理性突变。     

汉族家族性中枢神经系统海绵状血管畸形致病基因的一个新突变位点

目的 探查汉族家族性中枢神经系统海绵状血管畸形(CCM)的突变基因。方法 选择经神经科确诊的2个家系(A及B)和8例散发性中枢神经系统海绵状血管畸形病例。所有受检对象临床表现有癫痫、突发头痛;2例伴有皮肤病变。候选基因为已确认的Krit-1,对该基因的16个编码外显子进行PCR扩增,扩增产物进行直接测序。结果 受检的A家系在第14外显子的第1289(从起始密码子计算,或2308即从mRNA的第一个碱基计算)位核苷酸一个拷贝有C→G的取代,出现编码改变(S430X),形成终止密码子(UGA),使翻译过程提前终止,导致的基因异常属无义点突变。同法筛查,A家族中有1名成员突变未获得遗传;散发病例发现一个正常多态性变化,未见到突变。结论 发现第1例汉族人CCM基因的点突变,也是国际上未见报道的新位点。这一点突变将会导致一种截短蛋白,是CCM发生的基本原因。研究结果可用于症状前基因诊断。     

p53基因第8外显子在喉癌中的缺失和点突变

目的 探讨抑癌基因p53第8外显子突变在喉鳞癌分子发病机理中所起的作用。方法 应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）银染技术和DNA直接测序法,检测喉鳞癌新鲜组织中抑癌基因p53基因第8外显子的突变情况。结果 60例喉鳞癌组织中,15例发生迁移率异常的SSCP区带。在SSCP阳性样本中随机抽出4例进行测序分析,发现两个标本在288位密码子缺失一个A,两个标本在292位密码子上缺失一个A。285、287密码子上共发生3次G→T的颠换,286密码子第3位碱基发生A→T的颠换。结论 喉鳞癌p53基因点突变与碱基缺失常常同时并存。p53基因第8外显子突变在喉癌的发生中可能起着重要作用。     

一个表皮松解性掌跖角化病家系的KRT9基因突变分析

目的明确一个伴随有类似关节指垫样病损和指甲病变的表皮松解性掌跖角化病的中国家系中角蛋白9(keratin9,KRT9)基因突变情况。方法用聚合酶链反应技术扩增家系成员及家系外50名正常人KRT9基因的编码区及外显子与内含子交界处,DNA序列分析寻找突变位点,然后经限制性内切酶Dde分析验证。结果患者KRT9基因第1外显子第160位密码子发生AAT→AGT的突变(N160S),而家系正常成员及家系外50个正常人中均不存在此突变。结论KRT9基因的第1外显子第160位密码子发生AAT→AGT突变(N160S)导致该家系患者发生表皮松解性掌跖角化病。     

一个遗传性多发性骨软骨瘤家系EXT1基因的突变分析CSCD

目的对1个遗传性多发性骨软骨瘤（hereditary multiple exostosis, HME）家系的先证者进行候选致病基因EXTI和EXT2的所有外显子检测,以寻找该HEM家系的致病性突变。方法应用PCR技术扩增EXT1、EXT2的全部外显子并进行直接Sanger测序分析。结果测序结果显示先证者EXT1基因第4外显子存在e．1202de1T（P．1401Tfs＊2）杂合缺失突变,该突变导致401位后的编码氨基酸发生移码,并在第402位引入终止密码,使EXTl编码的全长746氨基酸组成的蛋白质缩减至由402个氨基酸组成的截短型蛋白。该家系的其他6例患者均存在EXTle．1202delT的杂合移码突变,而表型正常家系成员未检测到该突变,符合基因型一表型共分离。未检测到EXT2基因的可疑突变。结论EXT1c．1202delT杂合移码突变是导致这个HME家系患者发病的分子机制。     

应用多重连接依赖性探针扩增和变性高效液相色谱技术筛查Peutz-Jeghers综合征家系致病基因突变

目的 联合应用多重连接依赖性探针扩增(MLPA)和变性高效液相色谱(DHPLC)技术快速筛查Peutz-Jeghers综合征家系致病基因的突变.方法 收集家系成员的外周血,采用MLPA、PCR-DNA测序等方法分别检测了LKB基因大片段缺失、碱基突变、碱基插入和缺失.同时收集250名正常人外周血,PCR-DHPLC筛查验证突变位点在正常人群中的分布.生物信息学分析突变位点对编码蛋白质结构和功能的影响.结果 2名家系受累成员均携带LKB基因924G＞C点的突变,这一突变位点在家系正常人和正常人群中都不存在.突变导致位于功能结构域的第308位编码氨基酸由色氨酸变为半胱氨酸,变异蛋白质结构和功能发生改变.结论 c.924G＞C位点的突变是一种病理性胚系突变,编码氨基酸的改变(Trp308Cys)是此家系的致病性因素.     

两个X连锁少汗性外胚层发育不良家系的基因突变分析

目的 对两个X连锁隐性遗传少汗性外胚层发育不良(X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia,XLHED)家系进行ED1基因突变分析,为罹患家庭提供遗传咨询及产前诊断.方法 综合应用序列分析及多重连接依赖性探针扩增方法,对两个家系的先证者进行ED1基因突变分析,并针对检测到的突变位点对女性成员进行检测.采集家系1胎儿的羊水细胞进行产前诊断,包括致病突变位点的分析、ED1基因内4个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点的单倍型连锁分析、性别鉴定及核型分析.结果 家系1先证者缺失ED1基因第1外显子及下游2个STR位点DXS8269,DXS1422区域,其余外显子序列分析未见异常,其女儿为该缺失突变的携带者;结合连锁分析、性别鉴定及核型分析结果,家系1胎儿为男性非ED1基因缺失突变携带者,胎儿足月分娩后随访,为健康个体.家系2先证者经序列分析检测到ED1基因第3外显子c.463C＞T(R155C)错义突变,母亲为c.463C＞T(R155C)杂合突变携带者.结论 ED1基因第1外显子区域缺失和错义突变R155C是导致2个少汗性外胚层发育不全家系患者临床表型的主要原因,ED1基因的突变检测结合单倍型分析,能准确地对该类家系提供产前诊断.     

一例α1,4半乳糖基转移酶基因一碱基缺失导致p表型

目的　研究 α1,4半乳糖基转移酶基因决定 p表型的分子基础。　方法　在标准血清学鉴定红细胞表型的基础上 ,PCR扩增 p表型个体 α1,4半乳糖基转移酶基因的第 3外显子编码区序列 ,PCR产物经割胶纯化后直接进行测序分析。结果　p表型个体 α1,4半乳糖基转移酶基因第 3外显子第 30 0或30 1位核苷酸 G缺失 (TCGG→ TCG) ,导致阅读框架在第 10 1位氨基酸发生移码 ,在第 113位氨基酸处提前形成终止密码。先证者父母为杂合缺失携带者。　结论　发现了 α1,4半乳糖基转移酶基因第 3外显子第 30 0或 30 1位处 G缺失突变 ,该突变可能是 p表型的分子机理之一。     

线粒体糖尿病家系基因突变的遗传学筛查

目的 探索与糖尿病发病相关的线粒体基因突变位点。方法 采用PCR、DNA直接测序技术对28个临床疑似线粒体基因突变糖尿病家系(mitochondrial diabetes mellitus，MDM)进行线粒体基因突变高发区域(tRNA^Leu(UUR)基因及NADH脱氢酶1基因)的筛查。结果 两个家系发现与糖尿病发病有关的突变位点。其中1个家系(16号)同时携带nt3243A→G突变和16S rRNA3205C→T突变。该家系两例患者均有消瘦、耳聋、β细胞功能低下、发病年龄低的特点，先证者血乳酸水平在正常高限。在另1先证者患耳聋的家系(28号)发现NDl基因3434A→G突变，导致氨基酸改变，与家系中糖尿病呈共同分离。上述突变均未在正常人中检测到。结论 3243位点突变在本组家系中的发现率为3．08％。16S rRNA3205C→T突变可能与糖尿病发病有关或与nt3243A→G突变协同作用。NDl基因3434A→G突变与28号家系糖尿病的发生有关。     

家族性慢性良性天疱疮一家系ATP2C1基因突变筛查

目的 对家族性慢性良性天疱疮一家系的ATP2C1基因突变进行检测.方法 采用聚合酶链反应扩增该家系4例患者和80名健康对照个体ATP2C1基因的全部外显子,直接测序法进行DNA测序,80名健康对照者为无亲缘关系的正常人.结果 在该家系所有患者中均检测出ATP2C1基因第163位碱基由C突变为T,导致终止密码子的提前出现.该突变位点在该家系正常人及健康对照人群中皆未发现.结论 该突变可影响ATP2C1基因的转录和翻译,在中国汉族人家族性慢性良性天疱疮家系中首次报道.