粉尘螨Ⅰ类变应原成熟肽段基因的克隆和生物信息学分析

目的了解不同地区粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)成熟肽段基因序列的变异性及其编码蛋白的化学及免疫学特征。方法从皖南地区分离鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR扩增Der fⅠ成熟肽段基因,克隆到T载体测序确认。应用生物信息学软件对该基因进行初步分析。结果获得皖南地区两种不同基因型的Der fⅠ成熟肽段基因,与GenBank公布的其他地区Der fⅠ基因序列比较同源性在98.73%～99.84%之间;相应编码氨基酸序列的同源性在99.04%～100%之间,存在6个氨基酸残基变异位点,并影响其抗原表位的改变。结论不同地区Der fⅠ成熟肽段基因序列及其编码氨基酸序列存在差异,并对其免疫原性产生影响。克隆并分析研究我国各地的尘螨变应原基因序列及氨基酸序列变化,对于临床变应性疾病的诊治有重要的意义。     

粉尘螨I类变应原成熟肽段基因的克隆和生物信息学分析

目的 了解不同地区粉尘螨Ⅰ类变应原(Der f I)成熟肽段基因序列的变异性及其编码蛋白的化学及免疫学特征.方法 从皖南地区分离鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR扩增Der fⅠ成熟肽段基因.克隆到T载体测序确认.应用生物信息学软件对该基因进行初步分析.结果 获得皖南地区两种不同基因型的Der fⅠ成熟肽段基因,与GenBank公布的其他地区Der fⅠ基因序列比较同源性在98.73%-99.84%之间;相应编码氨基酸序列的同源性在99.04%-100%之间,存在6个氨基酸残基变异位点,并影响其抗原表位的改变.结论 不同地区Der fⅠ成熟肽段基因序列及其编码氨基酸序列存在差异,并对其免疫原性产生影响.克隆并分析研究我国各地的尘螨变应原基因序列及氨基酸序列变化,对于临床变应性疾病的诊治有重要的意义.     

粉尘螨过敏原Derf21的生物信息学分析

目的运用生物信息学方法对粉尘螨过敏原Der f21特征进行分析。方法采用clustalw2进行同源性分析、MEGA5工具包构建系统进化树、ProtParam Tools预测其理化性质、KinasePhos软件预测磷酸化位点。采用PSIPRED预测其二级结构、SWISS-MODEL预测其三级结构。用DNAStar对Der f21的B细胞抗原表位进行预测。利用网络服务器IEDB内相关软件、Preprod、SYFPEITHI、NetMHCII 2.2Server和NetMHCII pan 3.0Sever对Der f21蛋白T细胞抗原表位进行预测。结果粉尘螨基因组测序发现本实验室克隆的Der f21基因与GenBank上公布的屋尘螨Der p21(GenBank:ABC73706.1)同源性为71%。系统进化树结果显示:粉尘螨与屋尘螨、棉兰皱皮螨、害嗜鳞螨亲缘关系比较近。磷酸化位点预测显示:Der f21含有1个丝氨酸激酶、1个苏氨酸激酶及1个酪氨酸激酶。二级结构及三级结构预测结果显示Der f21的结构主要以α螺旋为主。B细胞抗原表位预测得到5个肽序列(23~28、39~46、55~71、91~99、127~133)。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(8~17、72~80、83~91和118~126)。结论对粉尘螨过敏原Der f21的分子特征进行预测,为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。     

粉尘螨Der f2变应原的分离纯化及其特征

目的 用粉尘螨（Dermatophagoides farinae）代谢培养基浸液（Dff）分离纯化粉尘螨2类变应原（Der f2）。方法 Sephadex G-100层析、DEAE离子交换层析、PAGE等方法分离纯化Der f2,并对Der f2作SDS-PAGE测定和热稳定性测定。结果 从Dff分离纯化得到较纯Der f2,经SDS-PAGE测定其相对分子质量为14000,并经100℃加热15min后,仍保留50%～83.3%生物学活性。结论 从Dff中分离纯化的变应原,其物化性质符合Der f2特征。     

粉尘螨过敏原Der f15的表达、纯化和生物信息学分析

目的表达纯化出粉尘螨过敏原Der f15蛋白,并预测其三维结构及B细胞抗原表位。方法利用实验室已有的Der f15质粒转化到大肠杆菌Rosetta,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过亲和层析纯化蛋白,经免疫印迹法(Western-blot)分析Der f15免疫原性,用生物信息学方法分析Der f15的三维结构及B细胞抗原表位。结果高效表达出Der f15蛋白。SDS-PAGE结果显示:表达的产物分子量约107ku。经亲和层析成功纯化蛋白,纯化蛋白以尘螨过敏患者血清为一抗进行Western-blot,结果显示:Der f15重组蛋白能与患者血清IgE发生特异性结合,而阴性对照没有反应条带出现,表明Der f15具有良好的抗原性。对B细胞抗原表位的预测表明,Der f15蛋白的第20~35、121~131、340~359及485~500是潜在B细胞抗原表位。结论粉尘螨Der f15表达、纯化和生物信息学分析研究有助于了解Der f15蛋白的分子生物学特性,为粉尘螨过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。 更多还原     

粉尘螨Der fI变应原的免疫化学特征鉴定

作者在原制备Der f Ⅰ变应原基础上进行其免疫化学特征鉴定。Der fⅠ的交叉免疫电泳(CIE)结果证实提纯的Der f Ⅰ为均质性。Der f Ⅰ氨基酸组成与Dandeu(1982)、Heymann(1986)报道的Der f Ⅰ相应结果相关性比较表明,三者在氨基酸组成上有相似性。采用放射性变应原吸附试验(RAST)检测55份螨过敏性患者血清抗Der f ⅠIgE抗体水平,其中49.09％病人RAST阳性,平均阳性特异性IgE水平为6.58±3.90百分结合率。结果表明Der f Ⅰ是粉尘螨主要的变应原。     

尘螨变应原Der f 2基因克隆及序列分析

目的:获得尘螨变应原Der f 2基因及其生物信息学资料.方法:提取粉尘螨总RNA,RT-PCR合成Der f 2的cDNA片段,回收PCR产物并连接至pMD19-T simple,经测序验证后亚克隆入表达载体pET-28a( ),转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒,双酶切鉴定.用ExPaSy,EBI,NCBI网站的在线软件对测序结果进行分析.结果:RT-PCR扩增获得了Der f 2 cDNA片段,酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.与参考序列相比,测序结果多了87 bp(77～163),但Blastn发现中国广州和德国Reinbek报道的序列中也含此87bp.同源性、相似性、序列比对及分子进化分析提示,该序列与中国广州和德国Reinbek报道的序列亲缘关系较近.推测该变应原由176个氨基酸组成,与附睾分泌蛋白E1具有同源性,信号肽位于1～17aa处,在6～24aa处有一跨膜螺旋.二级结构由a-螺旋(16.57%),延伸链(32.57%)和随机卷曲(50.86%)组成.结论:获得了粉尘螨变应原Der f 2编码基因及其分子特征,为进一步生产基因工程变应原用于临床诊治变态反应性疾病奠定了基础.     

粉尘螨主要变应原基因Der f1和Der f3改组的研究

目的:探索粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f1和Der f3基因片段两两混合,采用DNAshuffling技术对粉尘螨变应原Der f1和Der f3基因进行重组,琼脂糖凝胶电泳检测重组子。结果:以Der f 2 F和Der f2 R为引物在酶切10、15、20、25、30min均可扩增出清晰条带;以Der f1 F和Der f1 R、Der f1 F和Der f2 R、Der f2 F和Der f1 R为引物在酶切10、15、20、25、30min的模板中均无条带出现;而其他引物组合则在不同酶切时间的模板中均出现条带。结论:通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3间的融合基因,为大规模制备高效、低价的哮喘疫苗奠定了基础。     

抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。方法利用重组Derf1蛋白为免疫原,免疫BALB／c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,其Ig亚型均为IgG1,且6株单抗均具有良好的效价。ELISA和Western—blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组Derf1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Derf1检测及纯化方法奠定了基础。     

粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。     

粉尘螨Der f 38的结构与免疫优势表位的生物信息学预测分析

目的：分析粉尘螨过敏原Der f 38的理化性质及结构特征,并综合生物信息学工具预测其免疫优势B、T细胞表位。方法：从世界卫生组织/国际免疫学联合会的过敏原数据库中获取Der f 38的氨基酸序列信息,利用ProtParam对Der f 38的理化性质特征进行分析。通过SWISS-MODEL、AlphaFold2及GalaxyRefine对Der f 38的三维结构模型进行综合构建、优化得到最佳的蛋白模型。利用DNAStar Protean、Bepipred 2.0、ElliPro、DiscoTop、TepiTool进行Der f 38蛋白的B细胞线性、构象型表位以及T细胞表位的综合预测。结果：Der f 38为分子量13.99kDa且等电点为9.08,总平均亲水性为-0.337,不稳定指数为31.79。通过多种生物信息学工具综合分析,共得到4个优势B细胞线性表位、8个B细胞构象表位和8个T细胞表位。结论：Der f 38属于碱性蛋白,具有一定的亲水性和稳定性,含有多个免疫优势的B细胞和T细胞抗原表位,为进一步针对该蛋白的疫苗和过敏原特异性免疫疗法的设计与开发提供理论参考。     

屋尘螨和粉尘螨主要变应原的筛选和分析

目的研究尘螨主要变应原组分及性质。方法用SDS—PAGE、Western印迹和LC—MS／MS方法,对屋尘螨和粉尘螨的主要变应原组分进行筛选、分析和鉴定。结果两种尘螨的三个样本均有数条在蛋白大小和含量方面较为独特的条带,其中屋尘螨和粉尘螨抗原间蛋白质构成差别较大,两个粉尘螨样本间蛋白带差别较小。屋尘螨主要变应原大小约为12～15kDa和94～98kDa;粉尘螨主要变应原大小约为49～53kDa和94～98kDa,但其中一粉尘螨样本在49～53kDa和94～98kDa位置却未出现反应带。用LC—MS／MS方法从主要变应原条带中鉴定出屋尘螨变应原蛋白约64个,粉尘螨变应原蛋白约84个。它们包括一些已知的尘螨变应原、酶类、translation elongation factor、ribosomal protein、外膜（脂）蛋白、Keratin、Glycine cleavage systemprotein、binding protein、Heatshock protein、regulation protein、hypothetical protein、polpolypmtein和pol protein等蛋白质类别。结论屋尘螨和粉尘螨主要变应原构成及其免疫学反应强度均存在一定区别。针对中国人的尘螨主要变应原可能包括Derp2、Derp14、Dert3,Derf15和Derf17等,上述鉴定的其它蛋白质的一些也可能是潜在的变应原。     

粉尘螨变应原Derf1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达、纯化粉尘螨主要变应原Der f1重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:大量诱导表达含pET-28a(+)-Der f1质粒的BL21菌株,SDS-PAGE电泳并割胶纯化目的蛋白,以此为抗原免疫新西兰大白兔,收集血清进行效价检测并用Western blot检测其特异性。结果:割胶回收可有效纯化Der f1重组蛋白,抗Der f1抗体效价为1∶32 000。结论:成功制备Der f1多克隆抗体,以期为尘螨过敏性疾病的诊断和免疫治疗提供参考。     

狸猫α-干扰素全基因的克隆及生物信息学分析

根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序.用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析.结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点.IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

粉尘螨主要变应原Derf1基因的改造与可溶性表达

目的 在大肠杆菌中提高粉尘螨1类变应原(Der f 1)的可溶性表达.方法 用RT-PCR方法扩增得到Der f 1的全长序列与成熟肽序列(mDer f 1);以已知Der P 5基因的前导序列替换Der f 1前导序列和原酶序列,重新构建出rDer f 1基因;将上述3个基因分别克隆人原核表达载体pGEX-4T-1中表达,经Western-blot对三者的表达产物进行分析鉴定.结果 Western-blot表明, pGEX-Der f 1与pGEX-mDer f 1的表达产物分别为分子量约63000与51000的重组蛋白质,重组蛋白质主要存在于细胞裂解液的沉淀中.pGEX-rDer f 1大量表达了可溶性目的 蛋白质,分子量约53000,并被成功地分离纯化.三种表达产物均可被鼠抗GST抗体与螨过敏患者血清特异地识别.结论 表达了含Der f 1, mDer f 1与rDer f 1的三种GST融合蛋白质,它们均具免疫反应性,纯化获得了CST-rDer f 1融合蛋白质,为后期的诊断及治疗奠定了基础.     

日本血吸虫合抱相关未知功能基因SJCHGC00821的克隆及生物信息学分析

目的 克隆与日本血吸虫合抱相关但未知功能的新基因SJCHGC00821，构建其真核表达载体，并应用生物信息学初步探讨其功能。方法 应用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增SJCHGC00821基因全长ORF，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3中，通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定。应用生物信息学初步分析其细胞定位、蛋白序列、结构域及功能。结果 获得日本血吸虫合抱相关未知基因SJCHGC00821的克隆，序列分析结果提示该cDNA序列含有一个597bp的完整阅读框序列，编码198个氨基酸，其编码蛋白的理论分子量为22．76kDa，等电点为4．84。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论 成功地克隆了日本血吸虫SJCHGC00821基因全长ORF，构建了其pcDNA3真核表达载体，为进一步研究其结构与功能创造了条件。     

尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体的构建

目的:构建尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体,为进一步转染真核细胞表达融合蛋白奠定基础.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,将其连接到小鼠IL-12(mIL-12)基因3′端,组成融合基因mI...     

乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析

目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3024bp的乳糖酶基因,利用生物软件分析,推测乳糖酶基因共编码1008个氨基酸,蛋白分子量为114KDa,等电点为4．9,氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征,为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。     

尘螨1类变应原Derf1和Derp1生物信息学分析

目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果:尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1分别编码321和320个氨基酸,分子量分别为36.4和36.1 ku,理论等电点(p1)分别为5.66和5.65,两蛋白均为亲水性蛋白且可能均无跨膜区,Der f 1的二级结构以不规则卷曲为主(43.93%),而Der p1的二级结构以α螺旋为主(43.75%)。两变应原均由蛋白酶抑制子I 29和木瓜蛋白酶C-端2个结构域组成,且半胱氨酸活性位点、组氨酸活性位点和天冬酰胺活性位点的位置相似。结论:Der f 1和Der p 1的这些特性有助于为螨性过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗提供理论支持。     

人载脂蛋白CⅡ成熟肽编码基因的克隆

目的：克隆人载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）成熟肽编码基因。方法：以人基因组DNA为模板，利用聚合酶链反应（PCR）分别扩增ApoCⅡ成熟肽的编码基因外显子3和外显子4，继而采用外显子拼接法。以两种扩增产物为模板再次进行PCR，得到246bp的人ApoCⅡ基因编码片段。将ApoCⅡ基因编码片段重组入载体pUC18，并进行序列测定。结果：PCR扩增得到ApoCⅡ基因编码片段．经测序证实重组人载体pUC18中的ApoCⅡ编码片段的序列与Genbank中所检索到的编码序列完全一致。结论：利用外显子拼接法完成人ApoCⅡ成熟肽基因编码片段的克隆，为基因工程研制有生物活性蛋白提供了可行的技术手段。