阳离子脂质体介导的基因转移机制

背景：与病毒载体相比,许多天然与合成的阳离子类脂以脂质体的形式用于基因转移,具有无免疫原性、易生产、质粒免受核酸酶降解和无致瘤性等优点,并且作为病毒载体的有效替代物,阳离子脂质体能用于细胞的体内和体外转染。目的：介绍阳离子脂质体介导的基因转移机制研究进展。方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库（CNKI：1987/2010）和PubMed（1987/2010）数据库,检索词分别为＂基因治疗、阳离子脂质体、基因转移、机制＂和＂gene therapy,cationic liposome,gene transfer,mechanism＂,语言分别设定为中文和英文。从阳离子脂质体基因转染和基因转移机制进行总结,综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制。结果与结论：共检索到108篇,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入20篇文章。综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制,包括阳离子脂质体/DNA复合物的形成、细胞吸收、内含体释放和复合物解体以及细胞核摄入等方面的研究内容。结果提示,对类脂构效关系和基因转移机制的研究,是提高阳离子脂质体转染效率和优化基因治疗的关键。     

阳离子脂质体介导的基因转移机制

背景:与病毒载体相比,许多天然与合成的阳离子类脂以脂质体的形式用于基因转移,具有无免疫原性、易生产、质粒免受核酸酶降解和无致瘤性等优点,并且作为病毒载体的有效替代物,阳离子脂质体能用于细胞的体内和体外转染.目的:介绍阳离子脂质体介导的基因转移机制研究进展.方法:由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:1987/2010)和PubMed (1987/2010)数据库,检索词分别为"基因治疗、阳离子脂质体、基因转移、机制"和"gene therapy,cationic liposome,gene transfer,mechanism",语言分别设定为中文和英文.从阳离子脂质体基因转染和基因转移机制进行总结,综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制.结果与结论:共检索到108篇,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入20篇文章.综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制,包括阳离子脂质体/DNA复合物的形成、细胞吸收、内含体释放和复合物解体以及细胞核摄入等方面的研究内容.结果提示,对类脂构效关系和基因转移机制的研究,是提高阳离子脂质体转染效率和优化基因治疗的关键.     

小鼠骨髓细胞体外扩增及其造血重建的研究

目的：观察干细胞因子（ＳＣＦ）与白细胞介素（ＩＬ）－１或ＩＬ－３联合对经５氟尿嘧啶（５ＦＵ）处理的骨髓细胞的体外扩增作用和体外扩增细胞移植的小鼠造血恢复能力。方法：在含有细胞因子的液体培养体系中培养５ＦＵ处理的骨髓细胞，观察粒－巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ）和高增殖潜能集落形成细胞（ＨＰＰ－ＣＦＣ）数量的增加以及移植扩增细胞的小鼠外周血细胞恢复。结果：单用ＳＣＦ无扩增作用，但ＳＣＦ与ＩＬ－１或ＩＬ－３联合时，与对照组相比较ＣＦＵ－ＧＭ分别增加３３．７±１８．１倍和１８．１±６．３倍。ＨＰＰ－ＣＦＣ分别扩增１７．８±１０．５倍和１２．７±９．１倍。移植体外扩增细胞组与对照组比较，外周血细胞恢复时间缩短１～３天，并且生存率也显著提高。结论：在液体培养体系中ＳＣＦ与ＩＬ－１或ＩＬ－３联合对造血细胞扩增有协同作用，并且体外扩增后的骨髓细胞能加速移植受体的早期造血重建。     

脉冲超声辐照微泡增强脂质体介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨脉冲超声辐照微泡超声造影剂提高脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒在肝癌,细胞(HepG2)中转染率的可行性.方法 将HepG2接种在24孔板中,随机分为以下6组:①空白对照组;②质粒+脂质体组;③超声+质粒组;④超声+质粒+微泡组;⑤超声+质粒+脂质体组;⑥超声+质粒+脂质体+微泡组.荧光显微镜及流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白表达及转染效率;MTT法检测此转染方法对HepG2生长活性的影响.结果 超声+质粒+脂质体组的转染效率最高,并对细胞活性无明显影响;而超声+质粒+脂质体+微泡组转染效率与超声+质粒+脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但细胞活性与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脉冲超声辐照可介导基因转染,并能提高脂质体基因转染效率.同时,在一定条件下,超声微泡造影剂可提高超声介导基因转染效率,此方法可为基因转染提供新的思路.     

核酸环介导等温扩增技术

介绍环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景。环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可检测乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠状病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒、结核分支杆菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、螺旋体、肺炎链球菌和耶氏菌等。     

不同来源的树突状细胞体外扩增比较研究

【目的】对脐血和外周血树突状细胞(DC)体外扩增进行比较,探索更好的DC来源。【方法】取正常人脐血及外周血,以Ficoll分离提取白细胞,去除悬浮细胞后,分别加入含有GM-CSF、TNF-α及GM-CSF、IL-4的完全培养基中培养,于4、8、10 d进行表型(CD1α、CD83、CD80、HLA-DR)分析及形态观察,1周左右分别检测同种异体混合淋巴细胞反应培养,比较诱导细胞增殖的能力。【结果】脐血诱导的DC细胞数明显大于外周血来源的DC细胞数(脐血2.05±0.05,外周血0.45±0.01),两组有显著差异(P<0.05)。比较两种来源的DC在形态及细胞表型上无显著差异(P>0.05),两者刺激同种异体混合淋巴细胞增殖的能力无显著差异。【结论】脐血和外周血均可成功诱导成熟DC,脐血诱导DC增殖比外周血效率高。     

RNA病毒载体介导的基因转移进展

自1970年Baltimore和Temin两个实验室首次分离出逆转录病毒以来,针对RNA病毒的研究在世界各地蓬勃开展。特别是以RNA病毒作为疫苗和基因治疗载体的研究更是方兴未艾,本文对这方面的研究进展作一初步探讨。     

RNA病毒载体介导的基因转移进展

自1970年Baltimore和Temin两个实验室首次分离出逆转录病毒以来,针对RNA病毒的研究在世界各地蓬勃开展。特别是以RNA病毒作为疫苗和基因治疗载体的研究更是方兴未艾,本文对这方面的研究进展作一初步探讨。     

基因扩增实验室的质量控制措施

聚合酶链反应(PCR)具有较高的敏感性和特异性,能够对核酸分子进行定性和定量检测[1],随着分子生物学技术的不断进步,PCR技术取得了前所未有的发展.实时定量PCR是一种新型先进的实时核酸定量方法,与常规的终点定量PCR技术相比,不仅有很高的灵敏度和特异性,而且操作简便,PCR基因扩增技术简单易行,应用日趋广泛[2],但其影响因素很多,在实践过程中时常出现这样或那样的问题,甚至得不到预期的结果,或出现无法解释的现象.近年来在大量科学工作者的共同努力下,取得了许多宝贵的经验,使这一技术日趋完善,毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术,许多问题至今仍然不能得到很好的解释或解决.相信随着对PCR的深入研究,在PCR的应用过程中不断总结经验,PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献.本实验室是多年来从事核酸临床检测的专业机构,结合国内外的实践经验,在实验室质量控制方面做了一些基础性工作,现论述如下,以供参考.     

人骨髓间充质干细胞靶向纳米基因载体制备及体外细胞磁共振成像

目的 探讨靶向纳米基因载体单链神经节苷脂抗体-聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁（scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION）转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的可行性、效率及体外细胞MR显像能力。方法 合成scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION后,采用凝胶阻滞实验评估其复合外源性基因的能力;动态光散射法测量scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA纳米复合物的粒径大小及表面电位;体外细胞毒性实验检测其对hBMSCs的细胞毒性。采用流式细胞仪检测scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION靶向转染hBMSCs的效率,并设置PEG-g-PEI-SPION组、cAbGD2-PEG-g-PEI-SPION组、抗体竞争抑制（scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2）组和同型抗体（scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION）组,通过激光共聚焦显微镜及普鲁士蓝染色观察hBMSCs对纳米复合物的摄入。通过体外细胞MR扫描验证scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION的MR成像功能。结果 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION细胞毒性小,复合外源性基因后能够形成稳定的纳米复合物,粒径80~100 nm。在相同的N/P比值下,scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION组的转染率明显高于其他组（P<0.001）。N/P=20时,靶向组具有最高转染率[（59.60±4.50）%]。同时,scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION中的SPION可有效标记hBMSCs,在MR T2/T2^*加权图像上呈低信号。结论 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION是一种MRI可视的、可有效转染hBMSCs的靶向纳米基因载体。     

提高多药耐药基因导入人CD_(34)~ 细胞转导效率的探讨

目的　探讨逆转录病毒介导的多药耐药基因 (mdr1)导入人CD34 细胞的影响因素 ,以提高基因转导效率。方法　用流式细胞术 (FCM)检测不同组合细胞因子及人骨髓基质细胞 细胞因子支持的基因转导效率 ;用造血祖细胞集落培养观察耐药性 ;用FCM检测不同浓度紫杉醇素对基因转导细胞的作用。结果　细胞因子SCF Flt配体 (FL) IL 3组合支持的基因转导效率高于其它组合 (SCF IL 6 IL 3,SCF IL 6 IL 3 Tpo ,SCF IL 3)。骨髓基质细胞 细胞因子 (SCF FL IL 3)支持的基因转导效率 (2 0 .5 % )又高于单纯用该组细胞因子的转导效率 (15 .2 % ) ,并且前者形成的抗性集落形成细胞数多于后者。在 10ng ml紫杉醇作用下基因转导CD34 细胞的阳性率可达 38.5 %。结论　骨髓基质细胞 细胞因子 (SCF FL IL 3)对基因转导有较强的促进作用 ;一定浓度的紫杉醇具有富集基因转导细胞的作用     

IL-6基因转染的骨髓基质细胞系对骨髓移植小鼠造血功能恢复的促进作用

目的:探讨白细胞介素6(IL-6)基因转染的骨位基质细胞系QXMSC, IL6对骨髓移植后造血功能的重建作用。方法:将骨髓造血细胞和骨髓基质细胞系一起经尾静脉注射给同系小鼠,建立骨髓移植(BMT)模型。小鼠的造血功能用脾结节(CFU-S)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E、BFU-E)测定及外周血各项血液学指标来确定。结果:QXMSC_1 IL-6转基因骨髓基质细胞可明显增强BMT小鼠形成的CFU-S、CFU-GM、CFU-E和BFU-E数,促进外周血象的恢复。结论:QXMSC_1 IL-6细胞可明显促进小鼠骨髓移植后早期造血功能重建。     

细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的影响

本实验探讨细胞因子SCF,IL-3和IL-6对基因转移效率的影响,为临床基因治疗提供可靠依据。以小鼠造血干细胞为靶细胞,应用包装细胞株PA317-GCGPXSN制备病毒上清,实施基因转移,采用FACS,GM-CFU,PCR和Southern blot方法测定基因转移效率。实验结果为:SCF,IL-3,IL-6单用或联合应用后,FACS测定的基因转移效率为0.07％-0.20％,GM-CFU测定的结果为20.4％-46.40％,阳性对照组测定的结果则分别为0.06％和10.92％。结论提示SCF/IL-3,SCF/IL-3/IL-6联合应用能显著提高基因转移效率。     

腺病毒介导CD40Ig基因转染联合骨髓细胞输注诱导大鼠心脏移植物耐受的研究

目的　研究CD4 0Ig基因转染联合骨髓细胞输注对大鼠心脏移植免疫耐受诱导的影响。方法　构建可表达CD4 0Ig的腺病毒载体Ad CD4 0Ig。建立大鼠心脏移植模型 ,将实验动物分为 5组 :A ,对照组 ,无任何处理 ;B组 ,单纯输注供者骨髓细胞 ;C ,单纯输注Ad CD4 0Ig ;D ,Ad CD4 0Ig和供者的骨髓细胞联合输注 ;E :输注对照腺病毒Ad Lacz。观察心脏移植物的存活时间、并MLR检测及移植物组织学检查。结果　 5组移植物的存活时间分别为 :8 34± 0 35天、9 2 6± 0 84天、18 73± 1 5 7天、36 91± 4 2 0天和 7 87± 0 4 1天。D组移植物的存活时间显著延长 ,MLR表现出供者特异的低反应性 ,组织切片检查淋巴细胞浸润情况也明显减轻。结论　腺病毒介导CD4 0Ig基因转染联合骨髓细胞输注 ,可诱导一定程度的免疫耐受。     

体外转染JWA核酶逆转录病毒载体对人骨髓基质细胞黏附功能的影响

目的探讨JWA核酶基因转染对人骨髓基质细胞(BMSC)黏附功能的影响。方法设计合成JWA核酶基因并构建于逆转录病毒载体pLXSN上,转染体外培养的人BMSC(BMSC-JWARZ组),应用半定量RT-PCR法(sqRT-PCR)测定细胞内JWA mRNA的表达,流式细胞仪检测BMSC细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管黏附分子-1(VCAM-1)的表达,并检测共培养条件下BMSC对Jurkat细胞的黏附率及Jurkat细胞增殖变化。以pLXSN空载体转染的BMSC(BMSC-pLXSN组)及未转染细胞(BMSC组)为对照。结果BMSC-JWARZ组JWA mRNA表达量[吸光度(A)值]为0．187±0．045,较BMSC-pLXSN组(0．382±0．039)及BMSC组(0．366±0．048)显著降低;BMSC-JWARZ组细胞表面ICAM-1阳性细胞率为(16．11±3．93)％,较B-pLXSN组[(38．24±5．37)％]及BMSC组[(36．27±6．19)％]显著降低;BMSC-JWARZ组细胞表面VCAM-1阳性细胞率为(12．08±3．34)％,较BMSC- pLXSN组[(26．88±5．17)％]及BMSC组[(24．55±3．68)％]显著降低;B-JWARZ组细胞对Jurkat细胞的黏附率为(23．65±5．27)％,较BMSC-pLXSN组[(35．14±8．11)％]及BMSC组[(33．72±6．29)％]显著降低,与BMSC-JWARZ组细胞共培养的Jurkat细胞倍增时间为58．7 h,明显长于与BMSC-pLXSN组(44．1 h)及BMSC组(43．7 h)细胞共培养时。结论JWA核酶基凶转染可抑制人BMSC内JWA基因的表达,抑制骨髓基质细胞黏附功能。     

Micro-dystrophin基因修饰的MSCs在mdx小鼠体内分化为肌卫星细胞的研究

目的：探讨携带抗肌萎缩蛋白小基因（Micro-dystrophin）的自体骨髓间质干细胞（MSCs）在Duchenne型肌营养不良症（DMD）模型鼠（mdx小鼠）体内分化为肌卫星细胞的潜能。方法：采用逆转录病毒介导micro—dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs,通过尾静脉注射移植治疗mdx小鼠,移植后12周免疫荧光法检测受体鼠腓肠肌micro-dystrophin的表达,并分离培养肌卫星细胞进行鉴定。结果：受体鼠腓肠肌成功检测到micro-dystrophin表达;分离培养肌卫星细胞发现部分细胞可同时表达micro—dystropbin和c—met及micro—dystrophin和desmin。结论：自体mdx小鼠MSCs可携带外源性micro—dystrophin基因,并在体内分化为micro—dystrophin阳性肌细胞,少数细胞可作为肌卫星细胞长期存在。     

大鼠骨髓基质干细胞诱导分化神经细胞的实验研究

目的探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性，为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法无菌取成熟大鼠长骨骨髓，密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞，在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞，通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定。结果骨髓基质细胞能在神经干细胞条件培养基中增殖、分化，表达巢蛋白抗体抗原，在适宜诱导分化因子及条件下进一步分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有神经细胞特异性核蛋白抗体抗原表达阳性。结论在适宜培养条件及诱导因子联合作用下，骨髓基质细胞可成功诱导出神经元样细胞。     

人骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的　探讨人骨髓基质细胞 (hBMSC)协同以干细胞因子和FL为主的细胞因子对脐血CD3 4 + 细胞的体外扩增作用。方法　采用免疫磁珠法分选脐血CD3 4 + 细胞 ,以SCF +IL 3+IL 6 +FL +EPO组合高效扩增CD3 4 +细胞[1] ,并结合该细胞因子组合接种到预先照射 (2 0Gy)的hBMSC上 ,d10结束培养 ,收获细胞分别作细胞计数、集落培养和流式细胞术检测CD3 4 + 细胞数。结果　本法获得的脐血CD3 4 + 细胞纯度较高 (92± 0 .0 4 ) % ,在hBMSC组培养的d2 ,造血细胞几乎都粘附到hBMSC上 ,随着培养时间的延长 ,CD3 4 + 细胞比例不断下降。hBMSC组与无hBMSC组相比 ,除细胞总数扩增倍数外 ,CFU GM、BFU E、CD3 4 + 细胞扩增倍数差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。结论　①脐血来源的CD3 4 + 细胞粘附于滋养层上形成造血灶 ,且 10d后造血细胞仍具有体外集落形成能力 ,表明骨髓基质细胞可支持并维系体外造血 ;②hBMSC协同外源性细胞因子可能是扩增造血干 /祖细胞的较理想方案