整合素αⅡbβ3和血小板信号传递

整合素αⅡｂβ３（ＧＰⅡｂⅢａ）是血小板上含量最多的膜糖蛋白，是一种钙依赖性异源二聚体复合物。αⅡｂβ３作为一种粘附分子受体可结合含有ＲＧＤ序列的配体，β３分子上第１０９～１７１和２１１～２２２位氨基酸是识别ＲＧＤ的部位。αⅡｂβ３还可通过αⅡｂ链第２９４～３１４位氨基酸识别和结合纤维蛋白原γ链Ｃ端１２肽（ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ）。αⅡｂβ３同时介导血小板跨膜双向信号传递，内外信号传递可调节受体自身结合配体的亲和力状态；外内信号传递可引起继发的血小板反应，包括颗粒内容物的分泌，第二相血小…     

人幼稚巨核细胞膜整合素αⅡbβ3功能的研究

整合素 (αⅡｂ、β3)是血小板膜的主要受体。血小板激动剂 (ＡＤＰ或凝血酶等 )可导致αⅡｂβ3复合物的结构改变 ,使其具有纤维蛋白原受体活性。αⅡｂβ3是二价阳离依赖性异二聚体 ,在ＥＤＴＡ作用下 ,血小板αⅡｂβ3异二聚体可解离成αⅡｂ和 β3[1] 。我们探讨人幼稚巨核细胞 (ＣＭＫ11 5 )上αⅡｂβ3表达和功能 ,同时与血小板的αⅡｂβ3进行比较。材料和方法1　细胞株　ＣＭＫ11 5细胞在含有体积分数为 10 %胎牛血清(ＦＣＳ)的ＲＰＭＩ 16 40培养液中 ,于 37℃、体积分数为 5 %ＣＯ2孵箱中温育。每周更换 1～ 2次培养液。2　单克隆…     

用流式细胞术分析人血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa

用流式细胞术分析人血小板膜糖蛋白Ⅱｂ／Ⅲａ王美健林其燧潘家绮赖悦云血小板膜糖蛋白（ＧＰ）Ⅱｂ／Ⅲａ属整合素家族成员，是纤维蛋白原受体，介导血小板聚集。在先天性血小板无力症时，血小板ＧＰⅡｂ／Ⅲａ较少、缺失或异常。单克隆抗体作为分子探针对于研究血小板膜...     

血小板膜糖蛋白酶联免疫测定法的建立及应用

目的用酶联免疫法对血小板膜糖蛋白（ＧＰ）进行定量和定性测定。方法应用ＳＺ系列抗人血小板单克隆抗体建立了以竞争性酶联免疫法定量测定ＧＰⅠｂ、ＧＰⅡｂ、ＧＰⅢａ及α－颗粒膜蛋白１４０（ＧＭＰ－１４０）在不同血小板表面的表达量；又建立了固相间接酶联免疫法定性测定血小板特异性同种抗原。结果每个正常血小板表面含有ＧＰⅠｂ２１８８４±２４９１分子，ＧＰⅡｂ３９１４１±３６１８分子，ＧＰⅢａ４５２７７±５０７６分子。凝血酶活化血小板表达９００２±１０９５个ＧＭＰ－１４０分子／血小板。血小板无力症纯合子或杂合子可被明确鉴别。对１０种血小板特异性同种抗原的表达进行的人群调查结果表明，人类血小板抗原（ＨＰＡ）－１和ＨＰＡ－４同种抗原的表达频率不同于国外报道的人群频率。结论两种酶联免疫测定法有助于血小板ＧＰ以及血小板免疫学的研究，具有较大的临床推广应用价值。     

整合素αⅡb/β3在血小板双向信号转导中的作用

整合素αⅡb／β3是血小板表面表达最丰富的膜糖蛋白，不仅通过与配体的结合介导血小板的聚集、黏附、伸展，而且通过信号转导参与血小板的活化，在止血和血栓形成的过程中起重要作用。对整合素αⅡb／β3的结构及其参与双向信号转导的认识近几年有了较大进展。     

血小板膜糖蛋白αⅡb基因A2334 C突变对αⅡ bβ3复合物合成及转运的影响--附一例报告

目的探讨血小板膜糖蛋白αⅡb基因A2334C突变对αⅡbβ3复合物合成的影响。方法构建αⅡb基因A2334C真核表达载体，测序正确后用脂质体将其与表达人整合素β3亚基的真核表达质粒αⅡbβ3共转染CH0细胞，对转染后细胞用Westelmblot法鉴定αⅡb基因A2334C突变体在CH0细胞中的总体表达；用流式细胞仪分析转运至细胞膜表面的αⅡb基因A2334C亚基；为了明确突变亚基的亚细胞定位，构建了αⅡb基因A2334C GFP融合蛋白表达质粒并用激光共聚焦显微镜确定GFP融合蛋白的细胞内定位。结果Western blot证明转基因CH0细胞有αⅡb A2334C基因的表达，但是成熟αⅡb的比例较正常对照低；流式细胞仪检测发现在细胞膜上有该亚基的分布，但是只有正常的25％；进一步的融合蛋白细胞内定位研究显示，αⅡb基因．A2334C GFP可以由内质网转运至高尔基体。结论αⅡb基因A2334C突变没有影响αⅡb的合成及其与B3的结合，但是仅有少部分前体αⅡb能够进一步形成成熟的αⅡb，其膜上的表达仅为正常的25％。该突变不影响αⅡbβ3由内质网向高尔基体的转运。该突变的致病机制可能是αⅡb的折叠错误使其容易降解导致膜上αⅡbβ3复合物减少及血小板功能减弱。     

血小板膜糖蛋白酶联免疫测定法的建立及应用

用酶联免疫法对血小板膜糖蛋白进行定量和定性测定测定。应用ＳＺ系列抗人血小板单克隆抗体建立以竞争性酶联免疫法定量测定ＧＰⅠｂ，ＧＰⅡｂ，ＧＰⅢ及α－颗粒膜蛋白１４０在不同血小板表面的表达量；又建立了固相间接酶联免疫法定性测定血小板特异性同种抗原。     

一例复合杂合突变导致血小板无力症的发病机制研究

目的探讨1例血小板无力症患儿的发病原因,阐明其致病机制。方法收集1例血小板无力症患儿外周血,通过基因测序技术明确致病基因位点;采用PCR定点突变方法制备突变质粒,转染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO-K1),构建体外真核表达系统。用免疫印迹法检测突变型CHO-K1细胞中血小板αⅡb和β3蛋白的合成;流式细胞术检测突变型CHO-K1细胞膜和胞质αⅡb和β3表达水平;免疫荧光显微镜观察突变型CHO-K1中αⅡb和β3的表达及分布。结果该患儿为Ⅱ型血小板无力症。基因测序发现ITGB3基因存在2个突变,且尚未被报道。ITGB3 c.1495 TC错义突变导致β3蛋白亚基第499号半胱氨酸被精氨酸代替(p.C499R);ITGB3 c.1728 delC移码突变导致β3蛋白亚基第577号丝氨酸开始的氨基酸合成发生改变,并在改变之后的第92个氨基酸终止。免疫印迹法结果为突变型CHO-K1细胞裂解液中均检测到αⅡb和β3一级结构的合成表达。流式细胞术检测结果为突变型CHO-K1细胞表面及胞内β3表达量缺如;荧光显微镜检测结果为突变型CHO-K1细胞未见β3蛋白亚基的分布。结论 ITGB3 c.1495 TC和c.1728delC突变是该患儿的发病原因,这2个突变并未影响血小板膜β3蛋白亚基一级结构合成,但影响其高级结构的表达和形成。     

1例血小板无力症的分子发病机制研究

目的探讨1例血小板无力症患儿的发病原因,阐明其致病机制。方法收集1例血小板无力症患儿外周血,通过基因测序技术明确致病基因位点;采用PCR定点突变方法制备突变质粒,转染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO-K1),构建体外真核表达系统。用免疫印迹法检测突变型CHO-K1细胞中血小板αⅡb和β3蛋白的合成;流式细胞术检测突变型CHO-K1细胞膜和胞质αⅡb和β3表达水平;免疫荧光显微镜观察突变型CHO-K1中αⅡb和β3的表达及分布。结果该患儿为Ⅱ型血小板无力症。基因测序发现ITGB3基因存在2个突变,且尚未被报道。ITGB3 c.1495 TC错义突变导致β3蛋白亚基第499号半胱氨酸被精氨酸代替(p.C499R);ITGB3 c.1728 delC移码突变导致β3蛋白亚基第577号丝氨酸开始的氨基酸合成发生改变,并在改变之后的第92个氨基酸终止。免疫印迹法结果为突变型CHO-K1细胞裂解液中均检测到αⅡb和β3一级结构的合成表达。流式细胞术检测结果为突变型CHO-K1细胞表面及胞内β3表达量缺如;荧光显微镜检测结果为突变型CHO-K1细胞未见β3蛋白亚基的分布。结论 ITGB3 c.1495 TC和c.1728delC突变是该患儿的发病原因,这2个突变并未影响血小板膜β3蛋白亚基一级结构合成,但影响其高级结构的表达和形成。     

抗血小板抗原 3a,5b(HPA-3a,5b)引起的新生儿同种免疫血小板减少症

抗血小板抗原３ａ，５ｂ（ＨＰＡ－３ａ，５ｂ）引起的新生儿同种免疫血小板减少症胡翊群ＦＢｏｅｈｌｅｎ夏文权王鸿利新生儿同种免疫血小板减少症（ＮＡＩＴ）是由胎儿与母亲的血小板抗原不合所致。我们报道１例患儿和母亲存在两种血小板抗原型不合，母亲血清中被检测出...     

血小板膜糖蛋白Ⅱb L721R和Q860X复合杂合突变导致血小板无力症的分子机制

目的 探讨血小板膜糖蛋白Ⅱ b L721R和Q860X复合杂合突变导致血小板无力症的分子机制.方法 应用PCR法对先证者αⅡ b和β3基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增;PCR产物纯化后直接测序,检测其突变基因.突变位点经直接测序证实排除基因多态性.采用PCR定点突变法构建αⅡ b L721 R和Q860X突变真核表达载体,测序正确后用脂质体将其分别与表达β3亚基的真核表达载体共转染293T和CHO细胞.采用流式细胞术检测转染细胞膜上αⅡ bβ3的表达,用Westernblot法鉴定αⅡ b L721R和Q860X突变体在转染细胞内的总体表达,采用免疫荧光共聚焦显微镜确定αⅡb L721R和QS60X突变体的细胞内定位.结果 先证者在αⅡ b基因存在T2255G(L721R)和C2671T(Q860x)复合杂合突变.PCDM8 Ⅱ bL721R/PCDM8Ⅲa转染的293T细胞表面αⅡ b为野生型的2.1%,133为野生型的11.0%.PCDM8Ⅱ bQ860X/PCDⅢ8ma转染的293T细胞表面αⅡb为野生型的31.9%,B3为野生型的18.0%.Western blot法证实突变αⅡ b L721R与β3共表达后,可检测到前体αⅡ b(pro-αⅡb),但未检测出成熟αⅡb.αⅡ b Q860X与β3共表达后,检测到截短型αⅡ b蛋白.免疫荧光细胞内共定位研究显示L721R和Q860X突变αⅡ bβ3蛋白大部分分布于内质网,仅有少量在高尔基体中.结论 αⅡb L721R和Q860X突变不影响αⅡ b蛋白的合成和pro-αⅡbβ3复合物的形成,但阻碍了pro-αⅡbβ3复合物由内质网向高尔基体的转运,导致细胞内滞留,从而影响了αⅡbβ3在细胞表面的表达,是导致血小板表面缺乏αⅡbβ3复合物、产生血小板无力症的分子机制.     

绿色荧光蛋白(GFP)融合于人整合蛋白αⅡb C端不影响αⅡbβ3复合物在CHO细胞正常表达

本研究选择αⅡb作为靶蛋白观察绿色荧光蛋白(GFP)标记对αⅡbβ3复合物生物合成过程和表达的影响。从人αⅡb表达载体p3．1—2b中经PCR扩增的αⅡb基因全长cDNA，插入表达载体pEGFP—N1中构建αⅡbGFP融合蛋白表达载体，测序正确后利用脂质体将重组质粒与表达人整合蛋白B，亚基的真核表达质粒p3．1—3a共转染CHO细胞，对转染后细胞用Western blot方法鉴定αⅡbGFP基因在CHO细胞中的表达并用激光共聚焦显微镜确定融合蛋白的细胞内定位，结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，Western blot证明转基因CHO细胞有人αⅡbGFP基因的表达，融合蛋白细胞内定位研究显示αⅡbGFP可以由内质网转运至高尔基体．．结论：成功构建了人αⅡbGFP融合蛋白真核表达载体；GFP融合于αⅡbC端不影响αⅡbβ3复合物在CHO细胞的正常表达。     

293T细胞模型中整合素β3胞浆尾段不同氨基酸基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响

目的:建立含有Calpain切割相关的β3胞浆尾段突变体的293T细胞模型,研究β3胞浆尾段不同氨基酸基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响。方法:利用293T细胞模型建立共表达人类野生型整合素αⅡb和野生型β3或突变型β3(β3ΔNITY(β3胞浆段截去NITY基序)、β3Δ754(β3胞浆段截去羧基末端最后8个氨基酸TNITYRGT)、β3Δ759(β3胞浆段截去羧基末端最后3个氨基酸RGT)的稳转细胞株,通过细胞在固相化纤维蛋白原上的黏附及伸展试验检测各稳转细胞株的黏附及伸展功能。结果:成功建立了293T-αⅡbβ3ΔNITY、293T-αⅡbβ3Δ754、293T-αⅡbβ3Δ759、293T-αⅡbβ3细胞株,稳定表达野生型整合素β3全长的293T--αⅡbβ3细胞株较293T细胞具有良好的在固相化纤维蛋白原上的黏附和伸展能力,可以作为血小板的替代模型,而293T-αⅡbβ3ΔNITY稳转细胞株的黏附和伸展能力稍低于293T-αⅡbβ3稳转细胞株,但293T-αⅡbβ3Δ754细胞、293T-αⅡbβ3Δ759细胞株的黏附和伸展能力均明显受损。结论:对整合素β3介导的细胞伸展功能,RGT基序至关重要,而NITY并非必不可少,同时所建β3胞浆尾段不同突变体的293T细胞株也为进一步的质谱分析数据库比对奠定了基础。     

TNF-α在脑梗死中的作用及对α5β1、αVβ3表达的影响

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在脑梗死中的作用及对细胞外基质蛋白-纤维素连接蛋白整合素受体α5β1、αVβ3表达的影响。方法选择海口市人民医院脑梗死急性期患者40例,同时纳入脑梗死缓解期患者40例,40例健康体检者设为对照组。分别采用ELISA法和流式细胞仪检测TNF-α、α5β1、αVβ3的表达情况。结果脑梗死急性期TNF-α、α5β1和αVβ3水平高于脑梗死缓解期和对照组,差异有统计学意义(P0.05);脑梗死缓解期患者和对照组TNF-α、α5β1和αVβ3比较,差异无统计学意义(P0.05)。TNF-α阻断后脑梗死急性期患者培养细胞上清液中TNF-α、α5β1和αVβ3水平明显低于TNF-α阻断前,差异有统计学意义(P0.01)。经TNF-α刺激后,人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中α5β1和αVβ3的表达均有不同程度的上调,同对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论脑梗死急性期患者TNF-α呈高表达,TNF-α对脑梗死急性期脑血管新生起促进作用,其可能机制是上调α5β1、αVβ3的表达。     

血小板GPⅡb精氨酸584-终止信号点突变

我们发现２例血小板无力症（Ｇｌａｎｚｍａｎｎｔｈｒｏｍｂａｓｔｈｅｎｉａ，ＧＴ）患者均存在血小板膜ＧＰⅡｂ基因第１７外显子第９６４４位核苷酸Ｃ→Ｔ杂合子突变，导致血小板ＧＰⅡｂ第５８４位上的精氨酸变成终止信号。因为ＧＴ为常染色体隐性遗传性疾病，杂合子...     

整合素αⅡbβ3在血小板中作用的研究现状

近年, 心脑血管血栓性疾病的发生率逐年增高, 而引起血栓性疾病的首要原因是病理性血栓的形成。血小板在止血和血栓形成中发挥重要作用。整合素αⅡbβ3是血小板表面表达最丰富的受体, 且是血小板活化聚集的终末通路。整合素αⅡbβ3拮抗剂, 如阿昔单抗、依替巴肽及替罗非班, 具有抑制血栓形成作用, 但其在抗血栓的同时可导致严重出血, 因此如何在抗血栓的同时降低出血发生率是相关研究热点。整合素αⅡbβ3可介导血小板双向信号转导, 因此研发新型拮抗剂, 选择性地阻断细胞外向细胞内信号转导而不影响细胞内向细胞外信号转导, 可发挥抗血栓作用而不导致出血, 是新的抗血栓策略。笔者拟重点对整合素αⅡbβ3及其在血小板相关信号通路中的作用, 以及各种靶向整合素αⅡbβ3的抗血栓药物进行介绍, 为临床抗血栓治疗提供新思路。     

CRISPR/Cas9技术构建的 ITGA2B c.2659C＞T(p.Q887X)无义突变的血小板无力症小鼠模型对血小板功能的影响

目的:用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达的ITGA2B c.2659C＞T(p.Q887X)无义突变的血小板无力症小鼠模型,并对其血小板膜表面糖蛋白αⅡbβ3的功能做进一步研究.方法:根据ITGA2B基因信息设计并合成针对c.2659C位置的供体寡核苷酸和gRNA载体并进行体外转录.将gRNA和Cas9 mRNA...     

健康成人血小板膜糖蛋白的表达特征

目的　观察健康成人血小板６ 种膜糖蛋白（ Ｇ Ｐ） 在不同性别、不同年龄,静息状态与活化状态时的表达特征。方法　用流式细胞仪测定静息状态下及用凝血酶受体活化肽（ Ｔ Ｒ Ａ Ｐ） 激活的血小板所结合单抗的分子数。结果　男性静息血小板和活化血小板中 Ｇ Ｐ Ⅱｂ／ Ⅲａ 和 Ｇ Ｐ Ⅲａ 显示随年龄减少现象,在静息血小板中 Ｇ Ｐ Ⅱｂ／ Ⅲａ 和 Ｇ ＰⅢａ 值与年龄呈负相关,ｒ 值分别为 － ０ ．４０９ 和－ ０ ．５３４ ,其 Ｐ 值均＜ ０ ．０５ ;而女性中未见到类似结果。 Ｔ Ｒ Ａ Ｐ 激活后 Ｇ Ｐ Ｉｂ 在血小板表面表达下降,而 Ｇ Ｐ Ⅱｂ／Ⅲａ 、Ⅲａ 、 Ｐ选择素均增高,其中 Ｐ选择素在激活后的升高值与激活前的基础值呈负相关。静息血小板的 Ｇ ＰⅠｂ 分子数约为３０ ０００ ,它与 Ｇ Ｐ Ⅴ的比值约３∶１ 。结论　健康人血小板 Ｇ Ｐ表达存在性别和年龄差异。     

单链多聚酶链反应直接测序检测血小板GPⅡb和GPⅢa基因点突变杂合子

单链多聚酶链反应直接测序检测血小板ＧＰⅡｂ和ＧＰⅢａ基因点突变杂合子陈方平９０年代以来的分子生物学研究表明：血小板无力症的分子缺陷大部分为血小板ＧＰⅡｂ和ＧＰⅢａ基因突变［１］。检测点突变杂合子或疾病携带者在人类优生和亲缘鉴定上具有重要意义。为了探讨...     

整合素αvβ3与脑胶质瘤恶性程度的相关性研究

目的 通过检测脑胶质瘤不同组织学的整合素αvβ3情况,揭示整合素αvβ3与脑胶质瘤恶性程度之间的关系.方法 对20例脑胶质瘤标本进行常规HE染色和免疫组化分析,依据术后病理检查结果,将患者分为低度恶性组（LM）（Ⅰ-Ⅱ级）和高度恶性组（HM）（Ⅲ-Ⅳ级）.对每例切片免疫组化结果进行微血管和肿瘤细胞分析,αvβ3受体染色以棕黄色颗粒、背景清晰为阳性表达.＂–＂为无细胞着色,＂＋＂为低度表达,＂＋ ＋＂为中度表达,＂＋ ＋ ＋＂为高度表达.结果 整合素αvβ3主要表达于细胞膜、胞质、血管内皮及肿瘤周围浸润组织,呈棕黄色颗粒.肿瘤周围水肿、正常及坏死组织未见αvβ3表达.10例低度恶性胶质瘤中,αvβ3中度表达4例,低度表达6例;10例高度恶性胶质瘤中,αvβ3高度表达9例,中度表达1例.高度恶性组αvβ3的表达高于低度恶性组,两组间存在显著性差异（χ2=16.80,P=0.000,P＜0.05）.整合素αvβ3与患者年龄、性别、肿瘤部位、大小等无关.结论 整合素αvβ3与脑胶质瘤恶性程度密切相关,为进一步整合素αvβ3靶向治疗提供参考.