脐血造血干细胞低温保存方法的探讨

目的 探讨脐血造血细胞的低温保存方法。方法 分别用程控降温液氮保存法、非程控降温液氮保存法和-80℃非程控降温保存法保存脐血有核细胞。结果 3种方法保存脐血有核细胞均获得较满意的结果。结论 用羟乙基淀(HES)自然沉淀法和低速离心法分离脐血有核细胞，获得较满意的回收率；用-80℃非程控降温保存法保存脐血有核细胞，可降低二甲基亚砜(DMSO)对细胞的毒性作用，适用于短期保存造血细胞。     

脐血干细胞的分离方法比较

目的:为合理选择脐血干细胞的分离方法提供参考.方法:采用改良HES(羟乙基淀粉)沉降分离法和Ficoll分离法分离脐血干细胞,比较两种方法分离前后的有核细胞数、分离后的CD34 细胞数、分离后的有核细胞回收率及台盼蓝拒染率.结果:改良HES沉降分离法和Ficoll分离法分离前的脐血量、有核细胞浓度和细胞数差异无统计学意义(P＞0.05);分离后改良HES法有核细胞数、CD34 细胞数、有核细胞回收率高于Ficoll 分离法(P＜0.05),而显示有核细胞活力的台盼蓝拒染率两种方法比较差异无统计学意义 (P＞0.05).结论:改良HES分离法的有核细胞回收率高,分离速度快、污染机会小、终体积小,是脐血干细胞分离较好的方法.     

脐血有核细胞移植治疗脑卒中的动物实验

目的:脐血有核细胞中富含多系前体细胞,具备改善受损神经系统功能的潜能。为此建立阻塞性脑卒中动物模型,探讨脐血有核细胞移植对其治疗的可行性。方法:实验于2004-09/2005-05在深圳市宝安区人民医院动物实验室完成。①实验材料:脐带血取自足月新生儿,由深圳宝安血站研究室提供,产妇及其家属均签署知情同意书。SD清洁级成年大鼠80只,随机取20只作为正常对照组,另60只以电凝法建立阻塞性脑卒中模型。剔除运动功能障碍不典型鼠后,随机取5只作为模型观察,余鼠按1∶1随机分为细胞移植组和模型对照组,当出现单只为尾数时,将其分配在细胞移植组。②实验方法:无菌抽取脐血20mL,加入乙二胺四乙酸抗凝,Ficoll法分离脐血有核细胞。造模后第10天,细胞移植组大鼠将头部固定,按前囟尾侧3.0mm,中线旁1.5mm,深度1.2mm注入1011L-1脐血有核细胞悬液5μL,1μL/min。模型对照组注射等量无细胞脐血清,正常对照组不给予任何干预。③实验评估:造模后4周,5只模型观察大鼠制作脑切片,行苏木精-伊红染色镜检。各组分别于细胞移植前、细胞移植后2,6周进行横木行走实验和触觉刺激试验,检测其运动和触觉功能的恢复。处死各组大鼠制作病理切片,免疫荧光检测脐血有核细胞在脑内生存和分化情况。结果:正常对照组、细胞移植组、模型对照组各20只、24只、24只进入结果分析。①阻塞性脑卒中模型大鼠病理特征:造模大鼠出现行为障碍,缺血部位出现中风囊,病理切片可见缺血坏死区等阻塞性脑卒中所致脑组织病理损伤。②运动和触觉功能测试:细胞移植前,细胞移植组与模型对照组大鼠的横木行走能力、撕胶纸能力均基本相似(P=0.05),且明显低于正常对照组(P<0.01)。移植后第2周,细胞移植组大鼠两项能力均明显强于模型对照组(P<0.05),但仍低于正常对照组(P<0.01)。移植后第6周,细胞移植组大鼠的横木行走能力明显改善,与正常对照组基本相似(P>0.05);撕胶纸能力仍低于正常对照组(P<0.01)。③阳性细胞免疫荧光检测:细胞移植组进针注射部位存在大量抗人RNP/CD45双阳性完整细胞,并向大脑中线、皮层梗死部位迁移。所植入的细胞约2.95%表达胶质纤维酸性蛋白,3.41%表达神经特异性烯醇化酶。结论:移植人脐血有核细胞能有效改善阻塞性脑卒中大鼠的运动和触觉功能缺陷。     

影响脐血采集量的因素及对策

目的探讨提高脐血采集量的方法。方法对192份收集的脐血,从分娩的方式、胎儿体重、胎盘重量、胎盘娩出方式、孕周、穿刺次数与脐血量的关系等方面比较分析。结果分娩方式、胎儿体重、胎盘重量、胎盘娩出方式、孕周、穿刺次数都将影响脐血采集量。结论通过临床的选择和优化方法可有效的增加脐血采集量。     

脐血采集质量影响因素分析

[目的]探讨影响脐血采集质量的因素及提高采集质量的方法.[方法]比较分析192例脐血收集产妇的各项产科因素与脐血采集的关系.[结果]分娩方式、孕周、婴儿体重、胎盘重量、胎盘娩出方式、穿刺次数、采集过程中的污染等都可影响脐血采集质量.[结论]充分评估、选择合适的供者和采集方法可有效提高脐血采集质量.     

脐血移植——移植方法、时间和对象

引言 1989年，首次报道1例范可尼(Fanconi’s)贫血患儿采用其HLA匹配妹妹的脐血(UCB)移植(UCBT)成功，7年后用于成人，并由此引致成人UCBT数百例。UCBT与骨髓移植(BMT)／外周血干细胞移植(PBSCT)之间的区别在于实际操作的不同。首先，每份UCB含有的有核细胞(Nc)数量仅为标准骨髓移植物的1／10，外周细胞移植物的1／100，     

脐血HLA分型的影响因素

脐血含丰富的造血干细胞,造血干细胞移植是治疗多种危重疾病患者的有效手段。收集脐血造血干细胞移植自１９８９年第１例ＨＬＡ全相合同胞获成功起,至今全世界已超过２３８例。脐血移植前的ＨＬＡ分型是决定其移植成功的重要环节之一。然而由于脐血在收集过程中时间、部...     

脐血单个核细胞成功培养的相关影响因素

目的:脐血来源丰富且免疫原性低,移植后排斥反应低的特性决定其具有临床应用的可行性。实验拟验证脐血单个核细胞数量与孕妇年龄条件、脐血量及制备因素的相关性,并证实其在体外培养的最佳条件。方法:实验于2006-03/2007-01在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成。①实验材料:300份脐血均来源于足月分娩的健康孕妇,全部签署知情同意书。孕妇年龄20～35岁,其中≤25岁36例,>25岁264例;脐血采集量15～130mL,其中<33mL18例,≥33mL282例;采集到制备时间差为2～24h,其中>12h30例,≤12h270例。红细胞裂解液由本实验室自制,主要成分为高渗盐水和三蒸水。②实验方法:人脐血用枸橼酸钠抗凝,采用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞,锥虫蓝染色结果表明活细胞比率达95%～100%。将脐血单个核细胞分别按1×106,5×106,1×107的密度接种,以未加细胞因子作为对照组,在无血清DMEM/F12培养液中加入20μg/L神经生长因子和2%神经营养因子B27作为扩增诱导组,于培养后的1,3,7d进行换液,培养周期选择5d、7～10d和15d。③实验评估:分别对脐血单个核细胞数与孕妇年龄、脐血采集量、采集到制备时间差的相关性进行分析。倒置荧光显微镜下观察细胞形态、细胞因子作用及最佳的种植密度、首次换液时间、培养周期。观察使用红细胞裂解液后对脐血单个核细胞增殖和分化的影响。结果:①脐血细胞的生长及形态特征:脐血单个核细胞刚接种时为散在的圆形细胞,2d贴壁,为散在的单个或数个细胞,呈长梭形,形态均一。3d左右细胞突起增加,细胞数量增多。随着培养时间的延长,可见多个细胞之间形成网络,诱导后出现神经样细胞形态。②脐血单个核细胞数的影响因素:脐血单个核细胞数与孕妇年龄不相关(r<0.3),与脐血量、采集到制备时间差均具有相关性(r>0.8)。③脐血单个核细胞培养影响因素:种植密度为5×106L-1、首次换液时间在3d左右、培养周期为7～10d的细胞生长状态较好。扩增诱导组脐血单个核细胞增殖和分化状态好于对照组。④红细胞对脐血单个核细胞生长分化的影响:红细胞裂解的最佳时间为45～50s,并发现红细胞对脐血单个核细胞的生长有一定程度影响,且破骨细胞较多。红细胞裂解后的脐血单个核细胞增殖分化较好,细胞形态较为均一。结论:①采集量为33mL、且采集到制备的时间差为12h的脐血制备单个核细胞数量超过1×108的成功例数较高。②5×106L-1接种密度、首次换液时间为3d、培养周期7～10d的脐血单个核细胞生长状态较好,神经细胞生长因子可促进其增殖分化。③红细胞裂解后脐血单个核细胞增殖分化更好,破骨细胞较少。     

脐血有核细胞分离、冻存方法的研究

目的探讨脐血有核细胞的分离、冻存方法,减少脐血的贮存空间。方法脐血采集按美国脐血库标准操作规程（SOP）168份脐血采用6％羟乙基淀粉（HES）、三联袋两次离心分离法将脐血分离成WBC层、RBC层和血浆层．脐血终搬为18～22ml。结果分离前后有核细胞计数、各系祖细胞数、CD34^＋细胞获得率分别为92．4％、96．5％、89．7％、80．2％、90．4％。结论证实HES分离脐血未造成有核细胞及各系祖细胞的明显损失。脐血可用简单的方法减少体积,节省液氮消耗量,降低了贮存空间,是一种用以建立脐血库的尝试。     

脐血采集方法、影响因素分析及注意事项

探讨如何提高采集脐血量,分离获得足够的造血干细胞。从产科采集对象、采集方法的选择、采集时机、采集过程、穿剌方法、污染情况等方面阐述脐血采集时应注意的问题,以通过严格筛选和优化方法,提高脐血的质量,确保脐血移植或输注的临床效果。     

脐血采集质量影响因素分析

[目的]探讨影响脐血采集质量的因素及提高采集质量的方法。[方法]比较分析192例脐血收集产妇的各项产科因素与脐血采集的关系。[结果]分娩方式、孕周、婴儿体重、胎盘重量、胎盘娩出方式、穿刺次数、采集过程中的污染等都可影响脐血采集质量。[结论]充分评估、选择合适的供者和采集方法可有效提高脐血采集质量.     

影响脐血HLA分型因素的探讨

脐血造血干细胞因其独特的生物学特性 ,来源丰富等特点 ,是一个具有潜力的造血干细胞来源 ,但供受体之间ＨＬＡ的配合程度仍是影响移植成功的重要因素。人们在采用外周血做ＨＬＡ分型方面已积累了一些经验 ,但是否适用于脐血的ＨＬＡ分型 ?为此 ,我们随机采集了 15份足月顺产的新生儿脐血 ,根据脐血的特点对细胞分离等容易影响ＨＬＡ分型的因素进行改进 ,完善脐血的ＨＬＡ分型方法 ,结果报告如下。1　材料与方法1 1　脐血采集　采用密闭式采血法 ,胎儿娩出后 ,立即穿刺脐静脉抽取 ,ＡＣＤ抗凝 ,2 4ｈ内完成细胞的分离。1 2　试剂　ＨＬＡ Ⅰ…     

不同护理操作因素对脐血采集质量的影响

目的探讨不同护理操作因素对脐血采集质量的影响。方法90例行脐血采集的产妇，随机分为2组：试验组和对照组。每组45例。2组均采集脐血．观察2组第1次脐静脉穿刺采集时间、操作采血袋高度、第2次脐静脉穿刺采集时间中脐血量、单个核细胞（MNC）、微生物污染情况。结果试验组第1次脐静脉穿刺采集时间、操作采血袋高度脐血采集量和MNC的数量均较对照组明显增加（均P〈0．05）。试验组第2次脐静脉穿刺采集时间中脐血采集量、MNC的数量与对照组比较差异均无统计学意义（均P〉0．05）。试验组第1次脐静脉穿刺采集时间中无微生物污染。结论良好的护理操作可有效提高脐血采集质量，降低脐血污染率。     

脐血单个核细胞四种细胞因子表达的检测

脐血单个核细胞四种细胞因子表达的检测习杰英韩丽邵文斌李旭陈葳刘娟为探索脐血干细胞移植的免疫和造血重建机制，我们检测了脐血单个核细胞（ＭＮＣ）表达白细胞介素２（ＩＬ－２）、白细胞介素４（ＩＬ－４）、白细胞介素６（ＩＬ－６）及粒－巨噬细胞集落刺激因子（Ｇ...     

转化生长因子-β1对脐血单个核细胞增殖周期及凋亡的影响

通过检测转化生长因子 β1 (TGF β1 )对脐血单个核细胞增殖周期及凋亡的作用 ,探讨其对造血进行负调控的机制。采用 5′ 溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)掺入法检测TGF β1 对细胞DNA合成的影响 ;应用Westernblot检测TGF β1 对G1 期细胞周期蛋白cyclinA ,cyclinD1,CDK2和CDK4表达的影响 ;用姬姆萨染色和流式细胞分析法检测TGF β1 对细胞凋亡的作用。结果表明 :①培养细胞加入 10 %胎牛血清 (FBS)和 1,2及 5ng ml的TGF β1 12小时后 ,BrdU的OD值与对照 (10 ?S)组相比有显著性差异 (P <0 .0 1) ;继续培养 2 4小时后 ,1ng mlTGF β1组的BrdU检测OD值与 10 ?S组相比无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,而 2ng ml和 5ng mlTGF β1 组的OD值与10 ?S组相比差异有显著性 (P <0 .0 5 )。②与对照组相比 ,2ng mlTGF β1 还可明显抑制cyclinA ,cyclinD1,CDK2和CDK4的表达。③与 2ng mlTGF β1 共培养 12和 2 4小时后 ,细胞出现凋亡特征性改变 ,凋亡率分别为14 .4 2 %和 31.98% ;而对照组未见明显形态变化 ,凋亡率分别为 4 .71%和 5 .76 %。结论 :TGF β1 可通过抑制造血细胞DNA的合成和G1 期细胞周期蛋白的表达 ,从而阻止细胞进入S期 ,抑制细胞增殖。TGF β1 还可促进造血细胞凋亡 ,因而是一个重要的造血负性调控因子。     

人脐血单个核细胞体外分化为内皮细胞的初步研究

为了探讨细胞因子组合在体外定向诱导人脐血单个核细胞(mononuclear cell，MNC)分化为内皮细胞的可行性，以及脐血干细胞在缺血性疾病中应用的可能性，利用源自人脐静脉血的MNC及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor—basic，bFGF)及胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin—likegrowth factor—Ⅰ，IGF—Ⅰ)的细胞因子组合的培养条件，体外进行向内皮细胞的诱导分化。结果表明：在该体系条件下可诱导分化出典型梭形内皮细胞，流式细胞术检测vWF( )细胞率可达80％以上，电镜观察发现在胞浆中含有内皮细胞的Weibel—Palade小体。结论：脐血单个核细胞在VEGF等细胞因子的诱导下有可能定向分化为内皮细胞，脐血有望成为治疗缺血性疾病成体干细胞的一个供源。     

脐血单个核细胞培养前后神经细胞特有标志物的变化

背景：目前神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)的来源仅限于胚胎，因此寻找一种新的：NSCs的来源对于神经科学领域基础与应用研究的发展至关重要，而脐血中资源丰富。目的：探讨脐血单个核细胞培养前后神经细胞特有标志物的表达差异。地点与材料：研究地点为郑州大学医学院干细胞研究中心。材料为用肝素抗凝采血袋从郑州大学第一附属医院及第三附属医院产科无菌收集健康产妇足月孕娠顺产或剖宫产的婴儿脐带血50～100mL，充分混匀后，置保温盒中带回实验室。设计与方法：采用RT-PCR方法对脐血单个核细胞培养前后nestin，NF-M及MAP2 mRNA的表达进行检测。主要观察指标：脐血单个核细胞培养前后nestin，NF-M和MAP2 mRNA的表达。结果：nestin，NF-M及MAP2 mRNA在培养前后的脐血单个核细胞中表达呈阳性；同未培养的脐血单个核细胞相比，nestin，NF-M及MAP2 mRNA在培养的脐血单个核细胞表达增强。结论：在直接分离的脐血单个核细胞中存在着神经(干)细胞；培养后，神经元样细胞增多，nestin，NF-M及MAP2 mRNA表达增强。     

人脐血间充质干/祖细胞的生长特征

为了评估脐血中间充质干 /祖细胞存在的频率 ,了解脐血间充质干 /祖细胞的增殖特点 ,寻找新的组织工程种子细胞 ,取足月顺产胎儿脐血、淋巴细胞分离液分离单个核细胞 ,悬浮至含 2 %胎牛血清的DMEM培养基中 ,培养并扩增脐血间充质干 /祖细胞 ,行免疫组织化学鉴定。结果表明 :脐血单个核细胞中间充质干 /祖细胞集落出现的频率为 0 .5× 10 -6,呈成纤维细胞样 ,传 2 0代仍可维持其形态特征 ,可有效扩增 1.3× 10 7倍。结论 :低血清DMEM培养液能维持脐血间充质干 /祖细胞增殖分化能力 ,脐血间充质干 /祖细胞是又一良好的组织工程与细胞治疗的种子细胞。     

人胃癌抗原粗提物对脐血有核细胞凋亡、细胞周期及集落形成的作用研究

脐血同骨髓、外周血相比，不仅富含造血干细胞，而且这些造血干细胞处于更早期阶段，增殖能力、自我更新能力也更强。因此，它是重要的造血干细胞供源，脐血有核细胞（CBNC）主要成分是造血干细胞。为进一步提高脐血干细胞移植后造血重建的速度和质量，拓展脐血的临床应用领域，我们在采用人肺癌抗原（自提）诱导脐血有核细胞的CTL活性和NK活性（结果另文报道）的基础上。用此抗原处理CBNC后，观察其凋亡、钿胞周期、集落形成的变化，以探讨其临床应用的可行性。