在BEP2D细胞恶性转化过程中TGF—β1对Smad7事件的调节

背景与目的：细胞逃避转化生长因子－β（TGF－β）诱导的对细胞生长,增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制。Smad7是TGF－β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF－β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF－β信号转导通路紊乱的机制之一。本研究旨在分析在细胞恶性转化过程中,Smad7基因表达是否发生紊乱,TGF－β1对Smad7基因的调控功能有无发生变化,以探索细胞发生恶性转化的原因。方法：培养BEP2D细胞及BERP35T－2细胞,于收获前60min和90min加入不同剂量的TGF－β1,提取细胞总RNA,分别以未加TGF－β1的细胞组作为对照,用Northern blot杂交比较两组细胞Smad7 mRNA表达的差异以及细胞对TGF－β1细胞因子刺激的反应性。同时提取BEP2D及BERP35T－2细胞蛋白,用Western blot方法比较两组细胞内源性TGF－β1表达的差异。结果：Smad7 mRNA表达水平恶性转化细胞高于永生化细胞;加了TGF－β1细胞因子后,BEP2D细胞Smad7 mRNA表达增高,BERP35T－2细胞表达水平改变不明显。而内源性TGF－β1的表达水平,BERP35T－2细胞稍高于BEP2D细胞。结论：Smad7在辐射致肺癌细胞系中的过表达及对TGF－）1应答的降低可能是辐射诱发肺癌发生的机制之一。     

SAGE方法分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达

目的：采用基因表达系列分析（serial analysis of gene expression,SAGE)方法,分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达。方法：细胞培养,收获永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞;提取细胞总RNA,分离mRNA,合成生物素标记的双链cDNA;采用SAGE方法获取标签序列,结合UniGene文库分析标签代表的转录本,最终通过SAGE软件分析标签丰度,比较两组细胞基因表达差异。选取SAGE实验得到的在两组细胞中表达的已知基因Smad7和CCR11,以RT-PCR方法制备探针,用两组细胞等量总RNA为样本,做Northernblot杂交。结果：建立了2个独立的SAGE文库。一个是1.5Gyα粒子照射诱发恶性转化BGEP2D细胞的SAGE文库,一个是永生化BEP2D细胞SAGE文库。从2具文库中分别挑取克隆53个、50个,进行测序,测序一共得到总标签2331个,代表单一转录本252个,有70%的SAGE标签可找到与之一一对应的基因,有84个核糖体蛋白基因,约占33%;有12个转录本（4.8%)找不到与之理想匹配的已知基因;2个SAGE文库间,大多数基因表达丰度相近,对2个SAGE文库进行比较发现有在永生化细胞中高表达的基因,也有在恶转细胞中高表达的基因。Northernblot杂交证实SAGE方法得到的TGF-β诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达。结论：（1）现有SAGE结果给出两组细胞基因表达丰度及表达差异的趋势。（2）SAGE方法结合Northernblot杂交,证实TGF-βr诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达,提示Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达。结论：（1）现有SAGE结果给出两组细胞基因表达丰度及表达差异的趋势。（2）SAGE方法结合Northernblot杂交,证实TGF-β诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达,提示Smad7基因参与细胞恶转,CCR11基因对维持细胞正常生长有作用。（3）SAGE方法同时定量比较两组或两组以上mRNA间基因表达水平,简便、快捷,尤其适于筛查已知基因的新功能。     

在BEP2D细胞恶性转化过程中TGF-β1对Smad7表达的调节

背景与目的:细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制.Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一.本研究旨在分析在细胞恶性转化过程中,Smad7基因表达是否发生紊乱,TGF-β1对Smad7基因的调控功能有无发生变化,以探索细胞发生恶性转化的原因.方法:培养BEP2D细胞及BERP35T-2细胞,于收获前60min和90min加入不同剂量的TGF-β1,提取细胞总RNA,分别以未加TGF-β1的细胞组作为对照,用Northernblot杂交比较两组细胞Smad7mRNA表达的差异以及细胞对TGF-β1细胞因子刺激的反应性.同时提取BEP2D及BERP35T-2细胞蛋白,用Westernblot方法比较两组细胞内源性TGF-β1表达的差异.结果:Smad7mRNA表达水平恶性转化细胞高于永生化细胞;加了TGF-β1细胞因子后,BEP2D细胞Smad7mRNA表达增高,BERP35T-2细胞表达水平改变不明显.而内源性TGF-β1的表达水平,BERP35T-2细胞稍高于BEP2D细胞.结论:Smad7在辐射致肺癌细胞系中的过表达及对TGF-β1应答的降低可能是辐射诱发肺癌发生的机制之一.     

α粒子诱发 BEP2D细胞转化过程中肺癌相关基因表达的 cDNA Microarray研究

目的：探讨辐射诱发人支气管上皮细胞（BEP2D）转化过程中肺癌相关基因的表达。方法：用Cartesian PixSys5500cDNA Microarray点样仪将60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。提取α离子辐射前BEP2D细胞（原代）和α粒子辐射后20代、35代细胞总RNA,经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中cDNA进行杂交。结果：原代细胞中检测到40个基因表达;20代检测到47个基因表达;35代检测到20个基因表达。所检测的基因中,抑癌基因的mRNA丰度的原代和20代后细胞中急剧下降;大多数癌基因的表达丰度在20代以后细胞中仅轻微下降;生长因子类基因大都在20代细胞表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮转化细胞中,抑癌基因的失活可能与细胞恶化有关,癌基因及生长因子类基因可能促进了细胞的转化。     

支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中p16基因甲基化改变研究

目的 研究人支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中pl6基因甲基化改变以及pl6基因mRNA转录情况。方法 选取正常人支气管上皮细胞系BEP2D及其经α粒子照射20周(R-20)、21周(R-21)、35周(T-35)和54周(T-54)的BEP2D细胞株作为研究对象(其中R-20、R-21末发生恶性转化，而T-35、T-54已发生恶性转化)．采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)检测各细胞株中pl6基因的甲基化改变情况，再运用半定量反转录PCR(retro-translation PCR，RT-PCR)检测pl6基因mRNA在各细胞株中的表达情况。结果 ①正常BEP2D细胞株pl6基因未发生甲基化，而R-20、R-21、T-35和T-54细胞的pl6基因均发生了甲基化改变。②与正常BEP2D细胞相比，R-20、R-21、T-35和T-54细胞p16基因mRNA转录水平均降低。结论 pl6基因甲基化改变发生在肺癌形成的早期阶段。p16基因甲基化可导致p16基因mRNA转录水平降低。     

Annexin Ⅰ基因转染对BEP2D细胞生长的影响

目的：研究AnnexinⅠ基因cDNA转染对永生化人支气管细胞系BEP2D生长的影响。方法：pT7T3D质粒经NotⅠ和XhoⅠ双酶切获得人AnnexinⅠ基因cDNA片段,亚克隆至真核表达载体pCI－neo,构建人AnnexinⅠ基因其核表达载体pCI－AXI。通过采用脂质体介导转染技术,将AnnexinⅠ的真核表达重组质粒和空载体质粒分别导入永生化人支气管细胞系BEP2D;合成AnnexinⅠ反义寡核苷酸,观察AnnexinⅠ基因对细胞生长的影响。结果：pCI－AXI转染永生化BEP2D细胞后,AnnexinⅠ的表达比永生化BEP2D细胞和空载体转染细胞提高了1．5倍。pCI－AXI转染细胞倍增时间为27h,较永生化细胞（37h）、空载体转染细胞（33h）明显缩短,流式细胞仪分析表明,AnnexinⅠ表达升高后促进G0／G1期细胞进入S期和G2／M期。永生化细胞、pCI－neo和pCI－AXI转染三种BEP2D细胞的接种效率分别为49．4％,57．87％,82．53％,pCI－AXI转染细胞形成的集落数明显高于其它两种细胞（P＜0．002）,并且细胞呈复层生长趋势;pCI－AXI转染细胞在软琼脂中的克隆形成率为0．01％,永生化细胞和空载体转染细胞在软琼脂中不能形成克隆。反义寡核苷酸（50mol／L）能显著抑制BEP2D细胞的生长（P＜0．05）。结论：AnnexinⅠ具有促进BEP2D细胞增殖,提高BEP2D细胞生存     

BEP2D细胞和R15Hp35T-2细胞中60个肺癌相关基因的表达研究

目的：研究永生化人支气管上皮细胞（BEP2D）和α粒子辐射诱发BEP2D细胞后形成的恶性转化细胞（R15Hp35T-2)中60个肺癌相关基因的表达谱。方法：首先搜集了60个肺癌相关的基因，经扩增和纯化后，用Cartesian PixSys550 cDNA Microarray点样仪将60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。然后提取BEP2D细胞和R15Hp35T-2细胞的RNA，经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中的cDNA进行杂交。结果：与BEP2D细胞相比，R15Hp35T-2细胞中上调表达的基因有27个，下调表达的基因有7个。大部分抑癌基因的mRNA丰度在2种细胞中表达相似；而大多数癌基因和生长因子类基因的mRNA丰度在R15Hp35T-2细胞中高表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮恶性转化细胞中，癌基因及生长因子类基因可能共同促进了细胞的转化。     

miR-223通过Lmo2基因和MAPK信号通路调控急性淋巴细胞白血病的恶性生物学行为

目的:探讨miR-223调控急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)E6-1细胞的增殖和体内成瘤能力及其作用机制.方法:应用实时荧光定量PCR检测miR-223在不同ALL细胞株中的表达水平,免疫荧光染色法检测携带miR-223mimic慢病毒感染E6-1细胞株的感染效率,双荧光素酶实验检测miR-223和Lmo2的相互结合关系,MTT增殖实验和克隆形成实验检测过表达miR-223对E6-1细胞株增殖和克隆形成能力的影响.裸鼠体内成瘤实验检测miR-223过表达对E6-1细胞成瘤能力的影响.Western blotting检测miR-223对MAPK信号通路相关蛋白表达的影响.结果:miR-223在E6-1细胞株中表达水平相对较低(P＜0.05),双荧光素酶实验证实miR-223可以直接靶向结合Lmo2的3'UTR区序列.过表达miR-223后:(1)抑制E6-1细胞的增殖能力(0.16±0.02 vs 1.15±0.21,P＜0.05);(2)抑制E6-1细胞的裸鼠体内成瘤能力[(0.56±0.08) vs (1.69±0.22)g,P＜0.05];(3)调控MAPK信号通路的活性.结论:miR-223可靶向作用Lmo2通过MAPK信号通路调控ALL细胞的增殖、克隆形成和体内成瘤能力.     

石蒜碱通过TGF-β/Smad 信号通路调控自噬抑制食管癌细胞增殖

目的:探讨石蒜碱对食管癌细胞增殖的影响,并分析其机制。方法:细胞计数8（CCK-8）法分析细胞增殖抑制率,MDC染色法检测自噬泡,Western blot法分析LC3II/LC3I、Beclin-1、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、p-Smad2/Smad2水平,观察3-MA对石蒜碱调控自噬和凋亡的影响。裸鼠成瘤实验验证石蒜碱对裸鼠体内瘤体的瘤重、瘤体积及自噬、p-Smad2/Smad2水平的影响。结果:2、4、8、16、32、64 μmol/L的石蒜碱抑制ECA109细胞增殖（F=22.412,P＜0.05）,IC50值为（15.56±2.16）μmol/L。4、8、16 μmol/L石蒜碱促进自噬泡的产生,增加LC3II/LC3I、Beclin-1水平,降低TGF-β1、p-Smad2/Smad2水平（P＜0.05）;3-MA可以逆转石蒜碱对自噬、凋亡及TGF-β/Smad信号通路和Bcl-2/Bax信号通路的影响;体内实验显示,100 mg/kg石蒜碱能降低瘤体体积、瘤体质量,下调p-Smad2/Smad2水平,上调LC3II/LC3I水平（P＜0.05）。3-MA可以逆转石蒜碱对瘤体体积、瘤体质量及LC3II/LC3I、p-Smad2/Smad2水平的影响。结论:石蒜碱能抑制ECA109细胞的增殖,促进细胞凋亡,对体内ECA109细胞移植瘤抑瘤效果明显,其机制与调控TGF-β/Smad信号通路激活自噬有关。     

α粒子诱发转化人支气管上皮细胞系BEP2D中XRCC5等基因的突变检测

目的与方法:用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法观察α粒子诱发人支气管上皮细胞系BEP2D细胞转化过程中相关基因的改变.结果:细胞转化过程中,双链断裂修复基因XRCC5发生碱基突变,改变从转化早期过程就持续存在;而p16基因exon2和hMSH2基因exon12未见变化.结论:XRCC5基因在α粒子照射后早期发生突变,使细胞丧失修复双链断裂损伤的能力,是α粒子诱发支气管上皮细胞转化过程中的启动事件之一.     

Smad4蛋白与蛋白激酶在非小细胞肺癌信号传导通路中的作用

目的探讨Smad4在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达,研究其与有丝分裂激活的蛋白激酶（MAPK）各亚族的关系和临床意义。方法应用Western印迹分析和RT-PCR方法,检测42例手术切除的肺癌标本和正常肺组织中Smadd的表达;应用免疫组化法,检测71例肺癌蜡块标本中Smad4和MAPK的亚族p38、ERK1、JNK1的表达。对各因子进行生存分析,判断对NSCLC预后的影响。结果在肺癌组织中,Smad4蛋白和mRNA的表达均低于正常组织（P〈0．05）;p38、ERKI和Smad4的表达与病理分期有关（P=0．000;P=0．000;P=0．005）;JNK1的表达与肿瘤位置（P=0．028）和病理分期（P=0．000）有关;Smad4和p38（P=0．000）明显相关。单因素分析显示,Smad4（P=0．0001）、p38（P=0．0000）、JNK1（P=0．0208）、肿瘤分化（P=0．0059）和病理分期（P=0．oooo）与预后相关。多因素分析显示,Smad4（P=0．019）、p38（P=0．044）、肿瘤分化（P=0．003）和病理分瓤P=0．020）与预后明显相关。p38阴性而Smad4阳性的肺癌患者预后较好（P=0．000）。结论Smad4的表达在NSCLC的发生发展中可能起重要意义。在NSCLC中,ras—MAPK信号通路、转换生长因子p（TGF—p）／Smad4信号通路的主要蛋白密切相关,p38和ERK1抑制Smad4的表达。Smad4和p38可用于判断NSCLC的预后。     

Smad4和Smad7在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的探讨Smad4和Smad7在人脑胶质瘤中的表达及意义.方法采用免疫组化方法,对临床经过石蜡包埋的30例胶质瘤和8例正常脑组织标本进行定位和定性检测.结果 Smad4 和 Smad7蛋白在胶质瘤中有不同程度的表达,在正常脑组织、低、高级别胶质瘤中Smad4的阳性表达分别为44.80±16.19,25.81±9.48,6.73±3.71,P<0.05.Smad7的阳性表达分别为6.69±3.86,18.22±7.84,41.95±17.27,P<0.05.差别均有显著意义.且Smad4与Smad7的表达水平呈负相关,r＝-0.82,P<0.01.结论 Smad4随胶质瘤的病理分级增高阳性表达降低,对胶质瘤的进展有抑制作用.Smad7则相反,可能参与了胶质瘤的恶性进展.     

子宫内膜癌组织Smad2/3和Smad7表达及其临床意义的探讨

目的:探讨Smad2/3和Smad7在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化SP法检测Smad2/3和Smad7在正常子宫内膜组织、非典型增生子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中的表达情况。结果:Smad2/3和Smad7的表达从正常子宫内膜组织到非典型增生内膜组织,再到子宫内膜癌组织,其阳性率呈逐渐下降趋势,P<0.05。在子宫内膜癌组织中,Smad2/3、Smad7的表达均与手术-病理分期无关,P>0.05;与组织学分级有关:随组织学分级的增加而表达减少,P<0.05。结论:Smad2/3和Smad7蛋白均参与了子宫内膜癌变的病理过程;在子宫内膜癌组织中,Smad2/3和Smad7的表达缺失与子宫内膜癌的分化相关。     

蛋白质组学技术识别Maspin在支气管上皮永生化细胞和恶性转化细胞中的差异表达

背景与目的：Maspin蛋白是一种抑制肿瘤的丝氨酸蛋白酶抑制剂,它在抑制肿瘤生长和转移中发挥一定作用。本研究是利用蛋白质学技术鉴定Maspin在支气管上皮细胞恶性转化过程中的差异表达。方法：利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳、肽质量指纹谱技术以及生物信息学技术,对Maspin在永生化细胞系及恶性转化细胞系的表达进行功能蛋白组学分析。结果：在分子量14．4-94kDa、等电点PI3—10范围内,2—D电泳分离出1500多个蛋白质点。凝胶图像分析显示Maspin蛋白在永生化细胞中的表达比恶性转化细胞表达高。Northern blot证实永生化细胞的Maspin mRNA丰度高于恶性转化细胞。结论：肺癌组织中Maspin在细胞转录和翻译水平的表达异常,这可能是肺癌发生的原因之一。     

Smad7基因过表达的促增殖作用机制探讨

目的 研究Smad7过表达使人支气管上皮细胞系增殖能力增强的机制。方法 用Smad7真核表达载体PCISmad7．neo同携带有报告基因碱性磷酸酶的c-myc顺式增强子元件pMyc-SEAP共转染,检测Smad7基因对增殖信号通路的影响。用RT-PCR方法,检测稳定转染Smad7基因前后永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系BEP2D和BERF35T2细胞内c-myc、p15、p21表达水平的变化,调查Smad7基因对TGF-β介导的抗增殖基因反应的调控。结果 报告基因检测结果表明,Smad7基因可使参与增殖信号通路的c-myc顺式增强子元件活性增强。RT-PCR结果表明,在稳定转染Smad7基因的细胞中,c-myc表达上调,p15表达降低,对TGV-β刺激的应答丧失,p21表达降低。结论 Smad7基因可通过调控TGF-β介导的抗增殖基因应答来影响细胞的生长、增殖能力。     

幽门螺杆菌对人胃癌MKN45细胞p38MAPK信号转导通路激活作用的研究

背景与目的: 环氧合酶2(cyelooxygenase-2,COX-2)是花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandins,PGs)代谢中重要的限速酶,幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染诱导胃黏膜COX-2的过度表达是胃癌发生的重要环节,但Hp感染胃黏膜细胞COX-2表达的机制尚不清楚.本研究旨在揭示Hp对人胃癌MKN45细胞COX-2表达和p38MAPK信号通路的影响,探讨COX-2表达的可能机制.方法: 采用实时荧光定量PCR(real time-PCR)检测Hp标准株NCTC11637感染对人胃痛MKN45细胞COX-2 mRNA转录的影响,Western blot检测坳COX-2蛋白表达的影响和p38MAPK信号通路的激活及其下游因子ATF-2的表达.结果: Hp感染人胃癌MKN45细胞后,COX-2 mRNA的表达明显上调,Hp感染3、6、9、12 h后COX-2 mRNA的表达量分别为正常值的3倍、7.2倍、5.1倍和4.3倍,各时间组COX-2 mRNA表达均明显高于对照组(P＜0.01);Up与MKN45细胞共培养24 h后,COX-2蛋白的表达亦显著增加(P＜0.01).Hp感染MKN45 20 min后,p38MAPK信号通路被激活,60 min达峰值;p38MAPK下游因子ATF-2的表达也明显增加,2 h达高峰,随着作用时间的延长,表达逐渐下降,24 h仍有表达.结论: Hp感染能诱导人胃癌MKN45细胞COX-2的表达;激活p38MAPK信号通路,增加其下游因子ATF-2的表达,可能是其诱导COX-2表达的机制.