谷胱甘肽S转移酶-π与人肝细胞耐砷性关系的研究

目的探讨谷胱甘肽S转移酶-π（GST-π）在人胚肝细胞（L-02细胞）耐砷性中的作用。方法培养L-02细胞和耐砷L-02细胞,用实时PCR和免疫组织化学法检测细胞GST-π mRNA和蛋白表达情况;两种细胞均采用亚砷酸钠（NaAsO2）2．5、5．0、10mmol／L及NaAs02与GST-π抑制剂依他尼酸（EA）联合培养24h,噻唑蓝（MTT）法和石墨炉原子吸收光谱法检测细胞生存率和细胞内砷浓度。结果耐砷L-02细胞GST-π mRNA及蛋白表达阳性率均显著高于L-02细胞（P〈0．001）;单用NaAsO2培养时,耐砷L-02细胞生存率明显高于L-02细胞、砷浓度明显低于L-02细胞（P〈0．001）;NaAsO2与EA联用时两种细胞内砷浓度增加、细胞存活率降低（P〈0．001）。结论L-02细胞的耐砷性可能与GST-π基因高表达有关,此从基因水平上为砷中毒的防治提供了实验依据。     

长期低剂量诱导法培养人体抗砷细胞株的研究

目的培养人体具有抗砷特性的细胞株,为人体抗砷基因研究奠定基础。方法采用人体脐静脉内皮细胞(ECV鄄304),在含有低剂量亚砷酸钠(NaAsO2)的培养基中长期培养,并设同步对照细胞组;利用噻唑兰(MTT)检测法计算细胞生存率及半数致死量(LD50)作为反映细胞对砷耐受性改变的指标。结果短期诱导,细胞未表现出砷耐受性提高,经过12周NaAsO2诱导后,48h急性砷毒性实验中,实验组细胞对急性染砷表现出明显的耐受性提高,实验组在各浓度下生存率都明显高于同步对照组。实验组LD50为14.3μmol/L,对照组LD50为3.9μmol/L。结论人体细胞与其他生物体一样,在长期低剂量砷诱导下可以具备抗砷的特性。     

活性氧在亚砷酸钠诱导Chang肝细胞凋亡中的作用

目的研究在亚砷酸钠（NaAsO2）诱导人Chang肝细胞株的凋亡过程中细胞内活性氧（ROS）和还原型谷胱甘肽（GSH）的作用。方法通过流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,采用2′,7′-二乙酰二氯荧光素（DCFH-DA）检测细胞内ROS水平,应用DTNB法测定细胞内GSH含量。结果与对照组相比,在5～30μmol/LNaAsO2浓度范围内,随着NaAsO2浓度的增高,Chang肝细胞凋亡率、细胞内ROS水平及GSH含量均升高（P〈0.05） 5mmol/L N-乙酰半胱氨酸（NAC）可显著抑制NaAsO2诱导的细胞凋亡的发生（P〈0.05）及细胞内ROS水平的升高（P〈0.05）,但细胞内GSH含量继续升高（P〈0.05）。结论砷诱导的Chang肝细胞的凋亡可能主要取决于细胞内ROS的产生,而不是细胞内GSH含量的下降。     

同型半胱氨酸对NIT-1细胞凋亡及细胞内SOD活性的影响

目的探讨同型半胱氨酸（Hcy）对克隆的胰岛β细胞NIT-1细胞株的存活率和凋亡的影响，以及对细胞内超氧化物歧化酶（SOD）的影响。方法将不同浓度的Hcy作用于NIT-1细胞后，用MTT的方法检测细胞生存率；用流式细胞仪Annexin V/PI双染色法和琼脂糖凝胶电泳检测不同浓度的Hcy作用不同时间对NIT-1细胞凋亡的影响；用黄嘌呤氧化酶法和WST结合的方法检测Hcy作用后的NIT-1细胞内SOD的活性。结果Hcy以时间、剂量依赖性的方式抑制NIT-1细胞的存活率（P〈0.01）。Hcy可诱导NIT-1细胞的凋亡，随作用时间的延长和Hcy浓度增加NIT-1细胞的凋亡率逐渐增加，浓度为100μmol／L的Hcy作用24h细胞凋亡明显增加，凋亡率为7、21％（P〈0．01），250μmol／L的Hcy作用12h后细胞凋亡率达8．91％（P〈0．01）。100μmol／L的Hcy作用24h后NIT-1细胞内SOD活性较正常组细胞下降20．2％（P〈0．01）。结论Hcy可抑制NIT-1细胞的存活率，并以时间和剂量依赖性的方式诱导细胞凋亡；这些有害作用可能是通过抑制细胞内的SOD的活性而发挥作用，为研究保护胰岛细胞功能提供一种新的思路。     

tBHQ对无机砷诱导HaCaT细胞凋亡中的保护作用

目的观察tBHQ对内源性线粒体凋亡通路和凋亡相关蛋白Bel-2等蛋白表达的影响,探讨tBHQ在无机砷诱导HaCaT细胞凋亡过程中的作用。方法采用分光光度法检测Caspase-3蛋白活力;Westernblot法分析细胞内Caspase-3、CytC、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果NaAsO2单独作用于HaCaT细胞24h,线粒体中CytC蛋白表达降低,而胞浆中CytC蛋白表达则随染砷剂量的增加而明显升高。tBHQ预处理12h后再分别暴露于NaAsO2,线粒体中CytC蛋白表达明显恢复,胞浆中CytC蛋白表达则随tBHQ剂量的增加而明显回落。此外,NaAsO。单独作用于HaCaT细胞24h,Procaspase-3蛋白表达降低,而Caspase-3活化程度均显著高于对照组（P〈0．01）,tBHQ预处理12h后再暴露于NaAsO2,Procaspase-3蛋白表达均明显高于相同浓度砷单独作用组,而且Caspase-3酶活力得到明显抑制,差异均具有统计学意义（P〈0．05）。NaAsO：单独作用于HaCaT细胞24h,与对照组相比Bcl-2蛋白表达降低,而Bax蛋白表达明显升高。tBHQ预处理12h后再分别暴露于NaAsO2,Bcl-2蛋白表达明显恢复,而Bax蛋白表达则随tBHQ剂量的增加而减少。结论tBHQ能够影响线粒体凋亡途径拮抗NaAsO2诱导的人皮肤角质细胞凋亡;tBHQ能够诱导调控凋亡相关蛋白Bcl-2／Bax从而发挥抗凋亡作用。     

体外非酒精性脂肪肝细胞模型线粒体通透转换孔的变化及其与细胞凋亡的关系

目的探讨线粒体通透转换孔（PT孔）与肝细胞脂肪变和细胞凋亡的关系。方法采用油酸诱导肝细胞株L02细胞建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）体外模型，油红O染色观察细胞脂肪变情况，应用荧光显微镜法观察各组荧光下降百分比（反映PT孔的开放程度），流式细胞仪Annexin V／P1法检测细胞凋亡情况。结果荧光显微镜观察结果显示，油酸可诱导L02细胞PT孔开放（72．58％±2．78％），与对照组（8．28％±4．98％）比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；并可于24h后引起肝细胞脂肪变，至72h后肝细胞脂肪变持续存在；随NAFLD体外模型造模时间延长，细胞凋亡比例逐渐增加，以48h和72h（分别为11．09％±4．95％和15．24％±2．45％）最为显著，与对照组（4．56％±1．25％）比较，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论PT孔开放程度与NAFLD体外模型细胞凋亡密切相关，并与肝细胞脂肪变有一定关系。     

拉帕替尼诱导Her－2高表达乳腺癌细胞凋亡的机制探讨

目的探讨拉帕替尼诱导Her-2高表达乳腺癌细胞株SKBR-3凋亡的机制。方法取处于对数生长期的SKBR-3细胞,接种于96孔板。随机分为实验组和对照组,每组设6个复孔。实验组加入终浓度500μg／L拉帕替尼,对照组加入含DMSO无血清的DMEM培养液。培养24、48、72h后,采用MTT法检SKBR-3生存率,用流式细胞仪检测两组细胞凋亡情况,Western blot法检测磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）及survivin蛋白。结果拉帕替尼作用24、48、72h时SKBR-3生存率分别为100％、69．4％、62．0％（P均〈0．05）。实验组细胞凋亡率为10．48％,明显高于对照组的2．14％（P〈0．05）;实验组p-AKT与survivin蛋白相对表达量为0．49±0．12、0．51±0．38,明显低于对照组的1．46±0．13、0．89±0．36（P均〈0．05）。结论拉帕替尼诱导Her-2高表达乳腺癌SKBR-3细胞凋亡的机制与其下调p-AKT、survivin蛋白表达有关。     

多种砷化物对Chang肝细胞抗氧化酶的诱导作用

目的探讨不同无机砷和有机砷化物对Chang肝细胞的毒性,以及对Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶蛋白的诱导作用。方法采用Alamar Blue还原法测定细胞活力;Western blot免疫印迹法检测细胞内HO-1、NQO1、GST和GR的蛋白表达。结果通过Alamar Blue还原法测定细胞增殖活力,几种砷化物的毒性大小依次为As2O3〉NaAsO2〉Na2HAsO4〉DMA;不同浓度的无机砷染毒Chang肝细胞6 h后,发现随着染毒浓度的升高,HO-1和NQO1的蛋白表达水平逐渐增加;GST和GR的蛋白表达与染毒浓度无关,3个组都表达且相同;而有机砷DMA正相反,随着染毒浓度的升高,GST和GR的蛋白表达水平逐渐增加,HO-1、NQO1的蛋白表达水平与染毒浓度无关,染毒组与对照组相比无差异。结论不同砷化物对肝细胞的毒性不同;对于抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的蛋白表达,4种砷化物的针对性和诱导强度明显不同。     

用单细胞凝胶电泳观察氟砷单独及联合对淋巴细胞DNA损伤

目的 观察氟、砷单独及联合作用对正常人淋巴细胞DNA的损伤作用及特点。方法 采用单细胞凝胶电泳（SCGE）实验，观察不同剂量氟、砷单独及联合应用对正常人淋巴细胞DNA的损伤。结果 人淋巴细胞在浓度为0．1、0．5μmol／L的NaAsO2及浓度为10、50μmol／L的NaF染毒24h后，均引起明显的DNA泳动（彗星尾）并呈现明显的剂量-效应关系；氟砷联合作用淋巴细胞，在0．5μmol／L NaAsO2＋50μmol／L NaF的剂量下，细胞DNA的损伤呈现出协同作用（P〈0．01）。结论 NaAsO2与NaF均可引起DNA损伤；低剂量NaAsO2与NaF联合作用时，则呈现协同作用。     

砷中毒大鼠体内各脏器、组织中砷的分布

目的 研究砷中毒大鼠体内各脏器组织中砷的分布，为地方性砷中毒的治疗提供科学依据。方法 用亚砷酸钠（NaAsO2）诱导出大鼠亚急性砷中毒模型，采用超热中子活化法测定大鼠的肝、肺、肾、脾、心、脑、卵巢、睾丸、肌肉9种脏器组织中A5的含量。结果 中毒组大鼠各脏器组织中砷的含量均极显著高于正常对照组（P〈0．01或P〈0．001）。且砷在各脏器中的浓度并非均匀分布。在中毒组脏器组织中的浓度遵循脾〉肺〉肝〉肾〉卵巢〉心脏〉脑〉肌肉〉睾丸。结论 砷在脾、肺、肝、肾等脏器中大量的蓄积，可能导致这些器官细胞的损伤。     

Construction of IL-2 gene-modified human hepatocyte and its cultivation with microcarrier

AIM: To construct interleukin-2 gene-modified human hepatocyte line (L-02/IL-2) and investigate the changes of the function of liver cells and IL-2 secretion in culture with microcarrier,laying the foundation for further experimentation on hepatocyte transplantation. METHODS: hIL-2 gene was transduced into L-02 hepatocytes by recombinant retroviral vector pLNCIL-2, and the changes of morphology and clonogenicity rate of the transduced cells were observed, the secretion levels of hIL-2 in cultural supernatant were detected by ELISA and NeoR gene was amplified by PCR. The growth of L-02/IL-2, the special biochemistry items and the levels of IL-2 were detected after cultivation with microcarrier. RESULTS: The clonogenicity rate of the L-02/IL-2 cells was lower than that of L-02/Neo cells and L-02 cells. The levels of hIL-2 could reach 32,000 pg/10(6) cells per day and kept secreting for more than ten weeks. NeoR gene segment was respectively obtained by PCR from both L-02/IL-2 and L-02/Neo cell's genomic DNA. At the 6(th) day in culture with microcarrier, the matrix-induced liver cell aggregates were formed, the number of alive L-02/IL-2 cell were 16.8+/-0.53 x 10(6)/flask and the levels of ALB and UREA were 52.54+/-1.28 mg/L and 5.29+/-0.17 mmol/L, respectively. These data had not significantly changed as compared with those of L-02 cells (P>0.05); However, the levels of IL-2 in IL-2/L-02 cells remarkably exceeded that in L-02 cells in the whole culture process (P<0.001). CONCLUSION: The IL-2 gene-modified hepatocyte line has been successfully constructed. The L-02/IL-2 cellular aggregates cultured with microcarrier have a high capacity of IL-2 production as well as protein synthesis and amino acid metabolism.     

人类金属硫蛋白-1F cDNA基因与砷化物相互作用的研究

目的探讨砷化物作用于人类正常肝细胞后金属硫蛋白-1F cDNA基因表达的变化。方法利用SMART方法克隆cDNA基因,生物信息学分析克隆基因的同源性、染色体定位、基因结构和对该基因编码蛋白质进行分析并对该蛋白质进行跨膜信息分析,基因芯片方法检测染砷L-02细胞金属硫蛋白-1F基因的表达。结果成功克隆金属硫蛋白-1F cDNA基因,经生物信息学分析可知,该基因定位在人染色体16q13区段, 跨膜信息分析发现金属硫蛋白-1F基因编码蛋白质可以穿出生物膜,基因芯片结果证实染砷的人正常肝L-02 细胞在染砷早期金属硫蛋白-1F基因表达增高。结论发现人类金属硫蛋白-1F基因是砷化物作用的一个相关基因,早期参与了砷代谢解毒。     

TG、VLDL和OX-VLDL对L-02和HLF细胞增殖及合成细胞外基质的影响

目的探讨脂质对肝细胞和成纤维细胞生物学活性的影响。方法以ＭＴＴ法、透明质酸（ＨＡ）放免测定法及３Ｈ－脯氨酸掺入法，观察４种不同浓度的甘油三酯（ＴＧ）、极低密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）和氧化极低密度脂蛋白（ＯＸ－ＶＬＤＬ）对无血清培养正常成人肝细胞（Ｌ－０２细胞）和人胚肺成纤维细胞（ＨＬＦ细胞）增殖及合成ＨＡ和胶原蛋白的影响。结果一定浓度的ＴＧ、ＶＬＤＬ和ＯＸ－ＶＬＤＬ可影响ＨＬＦ和（或）Ｌ－０２细胞的增殖，促进其胶原蛋白和ＨＡ的合成，其中以ＯＸ－ＶＬＤＬ的作用最为显著。结论肝内脂质，特别是ＯＸ－ＶＬＤＬ过多，可通过促进肝细胞和成纤维细胞合成细胞外基质诱导肝纤维化形成。     

HERG1 K+通道在肝癌细胞系BEL-7402中的表达及其意义

[目的]观察HERG1 K 通道在肝癌细胞系BEL-7402的表达,探索其在肝癌发生与发展中的作用。[方法]RT-PCR方法检测hepg1在肝癌细胞系BEL-7402细胞和正常肝细胞系L-02细胞中表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)研究HERG1 K 通道对BEL-7402细胞和L-02细胞增殖作用;以流式细胞仪检测该通道对肝癌细胞系BEL-7402细胞周期的影响。[结果]HERG1 K 通道在肝癌细胞中表达,而在正常肝细胞中不表达,该通道特异性抑制剂E-4031可以显著抑制BEL-7402细胞的增殖,而对不表达herg1基因的L-02细胞增殖不起作用;E-4031抑制BEL-7402细胞HERG1 K 通道后可导致G1期细胞显著上升。[结论]HERG1 K 通道可能是一个潜在的癌基因,可促进肝癌细胞的增殖;参与调控BEL-7402细胞周期的G1期进程。通过抑制该通道的功能,或下调其表达抑制该肿瘤的发生与发展;HERG1 K 通道可能是肝癌治疗的一个潜在的药物靶点和诊断性生物标志。     

不同转移潜能肝癌细胞株血管内皮生长因子及其受体的表达和意义

目的 探讨血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)在不同转移潜能肝癌细胞株中的表达及其意义.方法 应用半定量RT-PCR、酶联免疫吸附试验和(或)Western blot检测4株不同转移潜能的肝癌细胞株及一株正常肝细胞中VEGFR-1、VEGF-A、VEGF-B及VEGFR-2的mRNA和(或)蛋白质表达.结果 MHCC97-H、MHCC97-L和SMMC-7721细胞均有VEGFR-1 mRNA和蛋白质表达,且VEGFR-1 mRNA和蛋白质在MHCC97-H中的表达高于MHCC97-L、SMMC-7721的表达,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05),而其配体VEG-A和VEGF-B在检测的4种肝癌细胞株和正常肝细胞株L-02中均有表达.同时在检测的四种肝癌细胞株和正常肝细胞株L-02中均能检测到VEGFR-2 mRNA和蛋白质表达,但各组间表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 具有转移潜能的肝癌细胞株有VEGFR-1表达,而且其表达强弱与肝癌细胞株的转移潜能呈正相关,VEGFR-1的表达可能促进了肝细胞癌的侵袭转移.     

三氧化二砷选择性诱导人肝癌细胞凋亡及 相关基因的实验研究

目的 明确三氧化二砷对人肝癌细胞的诱导凋亡作用及其分子机制。方法 用四甲基偶氮唑蓝法、AO/EB荧光染色法、透射与扫描电镜观察、DNA电泳、流式细胞术、TUNEL法及免疫组织化学等方法,观察了三氧化二砷对体外培养的人肝癌细胞株QGY-7701、QGY-7703和正常人肝细胞株L-02的生长活力、细胞凋亡、细胞周期及其相关基因表达的影响。结果 三氧化二砷能显著地抑制人肝癌细胞QGY-7701和QGY-7703的生长,用药后诱导其出现了典型的细胞凋亡形态学和生化学改变,并使细胞周期阻滞于S期,且bcl-2基因表达明显下降,bax和Fas基因表达显著增强;三氧化二砷对正常人肝细胞株L-02无明显作用。结论 三氧化二砷对人肝癌细胞有显著的选择性诱导凋亡作用,且受到多种基因调控,这一结论为应用三氧化二砷治疗原发性肝癌提供了可靠的实验依据。     

敲减OGT对肝细胞脂肪合成的作用研究

目的探讨敲减N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)对肝细胞脂肪合成的影响。方法建立L02正常肝细胞脂肪变模型,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测OGT及O-连接糖基化(O-GlcNAc)表达。建立L02细胞OGT敲减细胞系,油酸诱导后检测其脂质形成能力。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测脂肪合成相关酶的mRNA和蛋白表达。采用独立样本t检验。结果Western blot显示L02细胞脂肪变后OGT及O-GlcNAc表达均升高(P<0.05)。shOGT慢病毒感染L02细胞后,OGT mRNA相对表达水平明显下调(P<0.01)。油红O染色显示,L02 shOGT细胞内脂质减少,qRT-PCR显示系列脂肪合成酶:乙酰辅酶A羟化酶、脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶mRNA相对表达水平均降低,差异具统计学意义(P值均<0.05),蛋白水平与mRNA相对表达量一致。结论敲减OGT后可通过降低O-GlcNAc水平抑制肝细胞脂肪合成。     

TPT1表达载体的构建及在肝细胞系L-02中的表达

目的构建肝细胞癌高表达基因TPT1真核表达载体,并转导肝细胞系L-02,为进一步研究其在肝细胞癌发生、发展过程中的作用奠定基础。方法通过PCR方法在TPT1 ORF两侧添加EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列而将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中,构成pEGFP-N3TPT1重构体,卡那霉素筛选阳性克隆,碱裂解法抽提质粒,Sanger法测序,VecScreen和BLAST分析测序结果,lipofectAM INE转导肝细胞系L-02,荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达情况。结果将TPT1成功插入pEGFP-N3中,转导L-02后,在荧光显微镜下,可见明亮的绿色荧光。pEGFP-N3TPT1转导的细胞,TPT1 mRNA水平较对照高1.59倍(P<0.05)。结论成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1,pEGFP-N3TPT1可在L-02细胞内高效表达。     

乙型肝炎病毒X蛋白对人肝L-02细胞中COX-2表达的影响

目的:研究在人肝细胞L-02中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对环氧化酶2(COX-2)表达的影响.方法:构建HBx基因表达载体pIRES2-AcGFP-HBx,转染入人肝细胞L-02中,RT-PCR和Westernblot检测HBx对COX-2表达的影响;通过细胞生长曲线和细胞周期变化,检测HBx蛋白对细胞分裂增殖的作用.同时将含有COX-2启动子核心片段的荧光素酶报告载体pGL3-COX-2转染入上述转染细胞,检测细胞荧光素酶荧光值以观察HBx蛋白对COX-2启动子活性的影响.结果:RT-PCR结果显示仅在HBx基因转染组细胞中有HBxmRNA的表达,且该组细胞中COX-2mRNA相对表达量显著高于空载体对照组和空白对照组(0.76±0.12vs0.28±0.04,0.25±0.03,均P<0.01);Westernblot结果显示,仅HBx基因转染组可见HBx蛋白有明显印迹条带,且该组细胞中COX-2蛋白免疫印迹较两对照组深;细胞生长曲线测定表明HBx基因转染组细胞在第3、4、5天的生长较两对照组显著加快(P<0.05);细胞周期测定显示与两对照组相比,HBx基因转染组G0-G1期比例显著降低,S期和G2-...