霍乱毒素联合弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的GALT和NALT黏膜免疫应答

目的观察霍乱毒素(CT)联合弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫小鼠诱导的肠相关淋巴组织(GALT)和鼻相关淋巴组织(NALT)黏膜部位的免疫应答。方法将48只5~6周龄BABL/c小鼠随机均分为3组,分别用PBS、ESA和CT+ESA滴鼻免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后14 d,处死小鼠,ELISA测定小鼠粪便和鼻咽冲洗液sIgA抗体水平;计数派伊尔淋巴集结(PP)、肠上皮淋巴细胞(IEL)、NALT和鼻通道(NC)淋巴细胞数,免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群水平。结果免疫后14 d,CT+ESA组小鼠鼻咽冲洗液和粪便sIgA水平显著高于ESA组和PBS组(P<0.01);CT+ESA和ESA组小鼠GALT部位的PP淋巴细胞显著增生,主要以CD4+T细胞为主;而IEL以CD8+T细胞增生为主,CD4+/CD8+比值降低(P<0.05)。CT+ESA NALT内淋巴细胞明显增生。CT+ESA组NC淋巴细胞显著升高(P<0.01),以CD4+T细胞增生为主。结论 CT佐剂联合ESA滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导GALT和NALT黏膜部位免疫应答。     

弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠抵抗弓形虫感染作用的观察

目的 观察弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠诱导的肠黏膜和系统免疫应答及其抗弓形虫感染作用。方法 BALB/c小鼠52只随机分为两组（每组26只），免疫组小鼠用弓形虫复合黏膜疫苗（每毫升含可溶性速殖子抗原1 mg， 霍乱毒素50 μg） 20 μl/只滴鼻免疫2次，间隔2周；对照组用等剂量PBS滴鼻。末次免疫后14 d，各组处死6只，摘眼球取血（0.5～1 ml）；取直肠内粪便（4～5粒），ELISA测定血清IgG和粪IgA抗体；分别计数脾组织、派伊尔集合淋巴结（PP）和肠上皮淋巴细胞（IEL），免疫细胞化学法检测各组织中CD4⁺、CD8⁺ T细胞亚群水平。用RH株弓形虫速殖子（4×10⁴个/只）灌胃攻击感染各组其余小鼠，30 d后颈椎脱位处死，计数肝、脑组织速殖子虫荷。 结果 免疫后14 d，免疫组小鼠血清IgG和粪IgA抗体水平（分别为0.224和0.371），显著高于对照组（分别为0.041和0.037）（P<0.05），脾、PP和IEL中T淋巴细胞与对照组相比明显增生（P<0.01），其中脾、PP中CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞增殖显著（P<0.05），IEL中以CD8⁺ T细胞为主，增殖显著（P<0.01），CD4⁺/CD8⁺ 比值降低（P<0.05）。攻击后30 d，免疫组小鼠存活率（85.0%）显著高于对照组（45.0%）（P<0.05）。免疫组肝、脑组织速殖子数比对照组分别减少86.3%、86.7%，两组差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠，能有效诱导黏膜和系统免疫应答，小鼠存活率显著提高，肝、脑组织虫荷显著降低。     

刚地弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的免疫应答

目的 观察刚地弓形虫排泄-分泌抗原（ESA）鼻内免疫小鼠后对不同黏膜部位和系统的免疫效应。方法 用Vero细胞培养刚地弓形虫,提取ESA抗原;将5—6周龄BALB／c小鼠随机分为6组,每组10只,实验组分别用培养5、7、9、11和14d提取的ESA20μg/只鼻内免疫小鼠2次,间隔为2周;对照组用无攻虫的细胞培养上清液滴鼻。观察小鼠健康和死亡情况,记录体重。在末次免疫后第3周处死小鼠,分别分离派伊尔结（PP）、脾淋巴细胞、肠上皮内淋巴细胞（IEL）、肠系膜淋巴结淋巴细胞（MLNL）,并加以计数。收集粪便和眶血样本,ELISA检测粪内sIgA水平及血清IgG特异抗体。结果 实验期间小鼠健康状况良好,对照组和实验组小鼠体重均不同程度增加;末次免疫后第3周,实验组粪便sIgA、血清IgG、PP细胞、脾淋巴细胞、MLNL、IEL的数量均高于对照组,14d组（P〈0．01）的抗体滴度和各淋巴细胞计数最高。结论 用刚地弓形虫速殖子与Vero细胞共培养5—14d提取的ESA鼻内免疫小鼠均可诱导黏膜及系统特异性的免疫应答,共培养第14天提取的ESA免疫效果优于其他时间组。     

小鼠腹水中弓形虫排泄分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的免疫应答

目的观察弓形虫感染小鼠腹水中分离的排泄-分泌抗原（excreted/secreted antigens,ESA）鼻内免疫小鼠对不同粘膜部位和系统的免疫效应。方法将5～6周龄BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,实验组分别用从感染弓形虫后24、48、72 h小鼠腹水中提取的ESA 20μg/只鼻内免疫小鼠2次,间隔2周;对照组用20μl/只PBS滴鼻。观察小鼠健康和死亡情况,记录体重。末次免疫后第3周处死小鼠,计数PP（Peyer’s patches）个数;分离PP淋巴细胞、脾淋巴细胞、小肠上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte,IEL）及肠系膜淋巴结细胞（mesenteric lymph node lympho-cyte,MLNL）并计数。眼眶采血和收集直肠内粪便,ELISA检测血清特异性IgG水平及粪便sIgA。结果72 h ESA组小鼠免疫后健康状况较差,体重逐渐降低,死亡4只;其他组小鼠体重仍呈增高趋势。各实验组小鼠IEL、MLNL、脾淋巴细胞以及PP淋巴细胞的增殖活性均高于对照组（P〈0.05）,72 h和48 h ESA组高于24 h ESA组（P〈0.01）。免疫后第3周,各实验组小鼠血清IgG、粪便sIgA水平均高于对照组（P〈0.05）,72 h和48 h ESA组高于24 h ESA组（P〈0.01）。结论感染后不同时间提取的腹水弓形虫ESA鼻内免疫小鼠均可诱导不同粘膜部位及系统特异性的免疫应答,48 h ESA的免疫效果最好。     

弓形虫可溶性抗原联合γ干扰素鼻内免疫小鼠的抗弓形虫感染作用

目的探讨弓形虫可溶性抗原(STAg)和γ干扰素(IFN-γ)联合鼻内免疫对小鼠的保护作用及IFN-γ作为佐剂鼻内免疫抗弓形虫感染的最佳剂量。方法将5~6周龄BALB/c小鼠70只随机分为5组,每组14只,分别用20μgSTAg、20μgSTAg 250UIFNγ-、20μgSTAg 500UIFNγ-、20μgSTAg 1000UIFN-γ和20μgSTAg 2000UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔14d,末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击,逐日观察小鼠健康存活情况。攻击后第29天处死全部小鼠,分离计数脑、肝组织速殖子;计数肠系膜淋巴结(MLN)和脾T淋巴细胞。结果随着佐剂IFN-γ剂量的增加,小鼠存活率有升高趋势,1000UIFN-γ剂量组小鼠存活率最高达93%;肝、脑速殖子数呈下降的趋势,其中STAg 1000UIFN-γ、STAg 2000UIFN-γ组显著低于STAg组;MLN和脾T淋巴细胞发生了增殖性应答,其中STAg 1000UIFNγ-、STAg 2000UIFN-γ组MLN细胞显著高于STAg组。结论STAg 1000UIFNγ-、STAg 2000UIFN-γ鼻内免疫明显优于其它小剂量佐剂及单独抗原免疫,能有效诱导黏膜免疫应答。     

不同剂量弓形虫ESA鼻内免疫小鼠诱导的粘膜及系统免疫应答

目的观察不同剂量弓形虫排泄一分泌抗原（excreted／secreted antigens，ESA）鼻内免疫小鼠诱导的粘膜及系统免疫应答，确定适宜免疫剂量。方法40只BALB／c小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组8只。分别用5、10、20和30μg ESA滴鼻免疫小鼠2次，间隔14d，对照组用20μl/只PBS滴鼻。于末次免疫后第14d，颈椎脱臼处死小鼠，ELISA法检测鼻咽冲洗液和小肠冲洗液sIgA、血清IgG抗体水平，分离并计数肠上皮内淋巴细胞（intest inalintraepithelial lymphocytes，iIEL）、肠系膜淋巴结淋巴细胞（mesenteric lymph node lymphocytes，MLNL）及脾淋巴细胞。结果实验期间，小鼠健康状况良好。随鼻内免疫ESA剂量的增加，特异性抗体水平不同程度的升高，MLNL、iIEL及脾淋巴细胞也显示不同程度的增生性应答。其中，30μg组小鼠血清IgG、脾淋巴细胞数量与10μg组、5μg组和PBS组比较，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）；30μg组小肠冲洗液sIgA、鼻咽冲洗液sIgA、iIEL和MLNL数量，20μg组小肠冲洗液sIgA和MLNL数量与5／2g组及PBS组比较，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）；20μg组血清IgG与PBS组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论20μg和30μg ESA鼻内免疫能有效诱导粘膜及系统免疫应答。     

霍乱毒素作为黏膜佐剂的研究进展

霍乱毒素(cholera toxin,CT)是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,既是强黏膜免疫原,又具有很强的黏膜佐剂活性,是当今研究最多且最深入的黏膜免疫佐剂之一。然而,由于CT其毒性,限制了在人体的使用。很多研究致力于使CT的佐剂性与毒性分离,CT亚基的佐剂性的研究就是方向之一。困扰黏膜疫苗的一个重要问题是很多抗原的黏膜免疫原性较弱,不能刺激有效的免疫反应,这也与黏膜免疫耐受有关,以CT为佐剂能消除机体对这些共免疫原的耐受。     

弓形虫STAg不同途径免疫小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答动态变化

目的动态观察弓形虫可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)滴鼻和皮下免疫小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答。方法6周龄BALB/c小鼠90只随机分为3组,分别以20μg STAg滴鼻或皮下注射免疫小鼠2次,间隔2周,对照组不做处理。末次免疫后1、2、3、4和5周,每组随机处死6只小鼠。ELISA法测定小肠冲洗液sI-gA和血清IgG,分离并计数小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)和脾淋巴细胞。结果对照组小鼠小肠冲洗液sIgA水平和IEL数及血清IgG水平和脾淋巴细胞数均维持在较低水平。滴鼻免疫组小鼠小肠冲洗液sIgA水平升高,与对照组比较差异有统计学意义(FsIgA=10.074,FIEL=14.747,P0.01),其中第5周sIgA水平、第2~5周IEL数量与皮下免疫组比较差异有统计学意义(FsIgA=7.862,FIEL=9.807,P0.05)。皮下免疫组小鼠血清IgG水平和脾淋巴细胞数均升高,与对照组比较差异有统计学意义(FIgG=8.207,F脾细胞=11.209,P0.05),第5周脾淋巴细胞数与滴鼻组比较差异有统计学意义(F=6.826,P0.05)。结论20μg STAg滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜免疫应答水平优于同剂量的皮下免疫,同时也诱导了较高水平的系统免疫应答。皮下免疫可诱导较高水平的系统免疫应答,但其诱导的黏膜免疫应答较弱。     

重组人IL-2联合STAg鼻内免疫BALB/c小鼠诱导的免疫应答

目的观察重组人白细胞介素-2（rhuIL-2）联合弓形虫可溶性速殖子抗原（STAg）滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答,探讨rhuIL-2的佐剂效应及适宜剂量。方法5～6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为6组,每组10只。实验组以STAg20μg或分别加rhuIL-2250、500、1000、2000 IU滴鼻免疫,抗原与佐剂溶于20μlPBS中,对照组以PBS滴鼻,免疫2次,间隔2周。末次免疫后30d,颈椎脱臼处死全部小鼠,ELISA法检测血清IgG和粪便sIgA水平;分离脾淋巴细胞、肠上皮内淋巴细胞（iIEL）,并计数。结果与PBS组相比,各佐剂组血清IgG水平都有增高,其中STAg＋500 IU IL-2组IgG水平增高最显著（P〈0.01）;STAg＋500 IU IL-2组和STAg＋1000 IU IL-2组粪便sIgA抗体水平显著高于PBS组和STAg组（P〈0.05）。联合IL-2佐剂免疫小鼠脾淋巴细胞和产生了增殖性应答,其中STAg＋500 IU IL-2组和STAg＋1000 IU IL-2组脾淋巴细胞数显著高于PBS组和STAg组（P〈0.05）;TAg＋500 IU IL-2组iIEL高于PBS组（P〈0.05）。结论rhuIL-2作为佐剂联合STAg鼻内免疫小鼠可有效诱导粘膜免疫、系统的细胞免疫和体液免疫应答;500 IU IL-2为鼻内免疫小鼠的适宜剂量。     

弓形虫STAg联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫小鼠诱导不同黏膜部位抗体水平动态观察

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen,STAg）联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠后不同黏膜部位抗体水平及其持续时间,为黏膜疫苗研制提供实验依据。方法 84只5~6周龄BALB/c小鼠随机分为免疫组和对照组,每组42只。免疫组以STAg（20μg/只）为抗原加IFN-γ（1 000 U/只）为佐剂滴鼻免疫,对照组以PBS 20μl滴鼻。共滴鼻2次,间隔2周。首次免疫后第0、2、4、6、8、10、12周每组处死6只小鼠,ELISA法测定鼻咽、肺和小肠冲洗液sIgA、IgG水平。结果小鼠用弓形虫STAg联合IFN-γ首次免疫后鼻咽冲洗液sIgA和IgG水平均增高,其中第2、4、6、8周sIgA水平显著高于对照组（P〈0.05）,第2、4、6周IgG水平高于对照组（P〈0.05）;首次免疫后第6、8周小鼠肺冲洗液sIgA水平显著高于对照组（P〈0.05）,第4、6、8周IgG水平高于对照组（P〈0.05）;首次免疫后第2、4、6周小肠冲洗液sIgA水平高于对照组（P〈0.05）,第2、4、6、8周IgG水平高于对照组（P〈0.05）。免疫后不同黏膜部位抗体均以sIgA为主,且以肠道冲洗液最高。结论 STAg联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导鼻咽、肺和小肠黏膜部位产生高水平sIgA和IgG抗体应答,并可持续6~8周。表明滴鼻免疫是弓形虫疫苗的适宜接种途径。     

弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的Peyer’s patches持续性细胞免疫应答

目的以可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen，STAg）和霍乱毒素（choleratoxin，CT）佐剂制备的弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠，观察肠粘膜诱导部位Peyer’s patches（PP）的细胞免疫应答及持续时间，探讨其免疫机制。方法BALB／c小鼠96只，随机分为实验组和对照组，实验组以STAg（20μg／只）为抗原，CT（1／μg／只）为佐剂滴鼻免疫，对照组PBS滴鼻。滴鼻2次（间隔2周）后，每组6只小鼠分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死。计数PP个数，制备PP淋巴细胞悬液，计数并涂片；免疫细胞化学法检测CD4^＋、CD8^＋T细胞亚群。结果实验期间两组小鼠PP数目均无明显变化；实验组免疫后PP淋巴细胞数量明显增生，第2周达高峰，第1、2、3周显著高于对照组（P〈0.05），其中以CD4^＋T细胞增生为主，第1周～第8周高于对照组（P〈0.01），CD8^＋T细胞第1周～第4周显著增高（P〈0.01），CD4^＋／CD8^＋比值无显著变化（P〉0．05）。结论弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫BALB／c小鼠可有效诱导肠PP部位持续性的免疫应答，从而激活肠粘膜效应部位淋巴细胞的抗弓形虫感染作用。     

重组刚地弓形虫抑制蛋白滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞免疫应答

目的 观察不同浓度重组刚地弓形虫抑制蛋白（rTgPRF）滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞免疫应答,探讨其最佳免疫剂量。方法 50只雌性BALB/c小鼠随机分为5组,免疫组分别用10、20、30 μg和40 μg rTgPRF溶于20 μl磷酸盐缓冲液（PBS）后滴鼻免疫,对照组用20 μl PBS。分别于第0、14和21 天滴鼻免疫小鼠,末次免疫后2周,颈椎脱臼处死小鼠。无菌取脾,采用CCK?8法测定脾淋巴细胞刺激指数（SI）,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定脾淋巴细胞上清液中IFN?γ、IL?2、IL?4和IL?10浓度。结果 经rTgPRF刺激,30 μg和40 μg免疫组小鼠脾淋巴细胞SI均高于对照组（P均< 0.05）,且30 μg组显著高于40 μg组（P < 0.05）。与对照组比较,所有免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN?γ含量升高（P均< 0.05）,20、30 μg和40 μg组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL?2含量增加（P均< 0.05）,其中30 μg组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN?γ（P均< 0.01）和IL?2含量最高（P均< 0.01）;所有免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL?4和IL?10含量与对照组比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。结论 rTgPRF滴鼻免疫小鼠可诱导脾淋巴细胞增殖和Th1型细胞免疫应答,以30 μg剂量免疫效果最佳。     

可溶性弓形虫速殖子抗原联合蜂胶和IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

目的比较蜂胶、IFN-γ佐剂以及两种佐剂混合鼻内免疫辅助STAg增强机体细胞免疫应答的水平,探讨两种佐剂联合应用的免疫效果。方法将5~6周龄雌性BALB/c小鼠60只随机分为4组:20μg STAg组,20μg STAg+40μg蜂胶组,20μg STAg+1 000 U IFN-γ组和20μg STAg+40μg蜂胶+1 000 U IFN-γ组。将抗原和佐剂溶于20μl PBS中,双侧鼻孔(10μl/鼻孔)滴鼻免疫。免疫2次,间隔14 d,末次免疫后第10 d用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。逐日观察小鼠存活情况。攻击后第43 d处死全部存活小鼠,免疫细胞化学(ICC)法检测小鼠PP结、IEL和脾T淋巴细胞亚群水平。结果与STAg组相比,各佐剂组小鼠T淋巴细胞亚群比例有升高的趋势,其中IFN-γ、蜂胶+IFN-γ佐剂组小鼠PP结CD4+、CD8+T淋巴细胞,IEL、脾CD8+T淋巴细胞数显著高于STAg组,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值倒置。结论在抗弓形虫感染中,IFN-γ的佐剂作用优于蜂胶,有效激发机体细胞免疫应答,可用作鼻内免疫抗弓形虫感染的粘膜佐剂。IFN-γ+蜂胶佐剂鼻内免疫效果优于单独蜂胶、IFN-γ佐剂,应用联合佐剂是抗弓形虫感染免疫的一个新思路。