乙肝患者自身CD3AK细胞抗病毒近期疗效观察

目的　观察抗CD3单克隆抗体激活的杀伤 (CD3AK)细胞过继回输治疗乙型肝炎的近期治疗效果。方法　从乙肝病人外周血获得单个核细胞 (PBMCs) ,用抗CD3单抗和IL_2体外诱导培养 ,7天后将培养的CD3AK细胞回输给病人 ;平均 1个疗程回输细胞数为 8～ 10× 10 9;检测T细胞亚群和HBVDNA含量变化情况。结果　CD3AK细胞过继回输治疗后 ,CD3 + 、CD4+ 、CD8+ 细胞均比治疗前明显增高 ;随着免疫治疗时间的延长 ,HBVDNA含量呈下降趋势。结论　CD3AK细胞过继免疫治疗可增强患者的细胞免疫功能 ,降低血清病毒含量 ,是一种安全有效的乙肝治疗方法。     

原发性肝癌肿瘤浸润性淋巴细胞的细胞表型及杀伤活性

本文用间接免疫荧光染色流式细胞计数分析技术和LDH释放法检测了11例肝癌患者肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的细胞表型及杀伤活性。结果培养初期TIL细胞特征是以CD3为主，CD4／CD8为0．83，NK细胞23．3±3．6％。经重组白细胞介素2（rIL—2）激活20天后，CD3减少，CD4／CD8为1.85，NK细胞数量增至39．2±9．8％，P＜0．01。激活后的TIL对自体肝癌细胞杀伤率比培养初期高3．74倍，亦比对同时培养的BEL—7204肝癌细胞杀伤率高1．75倍。对自体和异体肝癌细胞杀伤作用均显著高于LAK细胞，且具有靶细胞特异性。结果表明肝癌TIL对肝癌细胞杀伤作用，可能与NK细胞数量增多，导致肝癌细胞凋亡有关。     

自体血回输对外伤性多脏器损伤患者免疫功能指标的影响

目的:探讨自体血回输对外伤性多脏器损伤患者免疫功能指标的影响。方法:以2011-03-2015-09在急诊科接受术中自体血回输治疗的56例外伤性多脏器损伤患者为自体血回输组,对照组为同期单纯输注异体血的同类型患者73例。记录围手术期失血量、异体血输入量、回收血量、输血不良反应及术后感染发生率。应用流式细胞仪测定术前、术后3d及10dT细胞亚群(CD3~+、CD4~+、CD8~+)与NK细胞含量;应用酶标仪测定术前、术后3d与术后10dIgG、IgM和补体C3水平。结果:(1)自体血回输组异体血输入量、输血不良反应和术后感染发生率低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。(2)对照组术后3d、10d与术前比较,CD3~+、CD4~+、NK细胞、IgG、IgM水平下降(P0.05),CD8~+水平上升(P0.05);自体血回输组术后3d、10d与术前比较,C3水平上升(P0.05);自体血回输组术后3d、10dCD3~+、CD4~+、CD8~+、NK细胞、IgG、IgM、C3水平与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论:自体血回输对外伤性多脏器损伤患者免疫功能指标的影响较小。     

低剂量辐射后自然杀伤细胞活性对大鼠肝癌细胞的影响

目的探讨低剂量辐射（LDR）后自然杀伤细胞（NK）抗大鼠肝癌活性的影响。方法从大鼠脾脏提出的单个核细胞应用免疫磁珠的方法分离CD3^＋／CD16^＋／CD56^＋细胞，并进行体外扩增培养。将培养成功的NK细胞分成阴性对照组，照射后4h、24h、48h、72h组进行体外75mGy照射。应用流式细胞仪检测各组NK细胞的增殖指数，并应用H^3-TdR掺人方法检测其杀伤活性。同时将移植肝癌成功的大鼠分成对照组、NK细胞输入组和LDR后NK细胞输入组。观察NK细胞回输体内后的抑瘤效果、AFP变化和生存时间。结果体外LDR后可以增加NK细胞的增殖指数，并增强其对SMMC-7721细胞的杀伤活性。其中以照射后24h最为明显。回输到肝癌大鼠后，与NK细胞组比较，LDR后的NK细胞可以明显延长大鼠的生存时间，降低肿瘤体积和外周血中AFP浓度（P〈0．05）。结论LDR可以提高NK细胞体外和体内的杀伤活性。     

DC、CIK白体回输对化疗后胃癌患者T淋巴细胞亚群及NK细胞的影响

目的研究树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）自体回输对化疗后胃癌患者T淋巴细胞亚群及NK细胞的影响。方法将92例胃癌患者随机分为观察组及对照组各46例,两组均行常规化疗,观察组于化疗结束后1个月实施DC、CIK自体回输治疗,治疗时间〉2个疗程。采集两组化疗前后及观察组DC和CIK自体回输之后4周的外周血,以流式细胞仪对外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞进行检测。结果两组化疗后CD;、CD4＋、CD4＋／cDf、NK水平均明显降低,观察组DC与CIK回输后CD^＋3、CD^＋4、CD^＋4／co^＋8、NK水平明显高于本组及对照组化疗后,P均〈0．05。结论化疗后胃癌患者DC、CIK白体回输后CD^＋3、CD4^＋4、CD^＋4／CD^＋8、NK水平升高,即细胞免疫功能得到改善。     

从健康人外周血单个核细胞中分离出高纯度的CD3~-CD56~+CD16~+NK细胞对肝癌细胞的杀伤作用分析

目的观察经IL-2/IL-15/SCF诱导的CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞体外扩增能力、NKG2D表达变化及其对肝癌细胞的杀伤作用。方法应用免疫磁珠分选法(MACS)从健康人外周血单个核细胞中分离出高纯度的CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8等方法比较IL-2/IL-15/SCF对NK细胞扩增倍数、NKG2D表达及对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞株杀伤活性的影响;同时观察封闭NKG2D受体对CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞杀伤活性的影响。结果 IL-2/IL-15/SCF培养14 d后,CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞扩增倍数、NKG2D表达以及对HepG2和SMMC-7721的杀伤活性显著增强,与对照组、IL-2组和IL-15组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。NKG2D单抗可以下调其对HepG2细胞的杀伤效应,但对SMMC-7721的杀伤无明显影响。结论 IL-2/IL-15/SCF诱导后CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性增强,NKG2D途径是NK细胞杀伤肝癌细胞的重要机制之一。     

同种异体NK细胞对CD+34早期急性髓系白血病细胞的杀伤活性

目的探讨同种异体NK细胞对CD3+4早期急性髓系白血病(AML)细胞的体外杀伤活性。方法免疫磁珠法分离5例健康个体NK细胞,以NK杀伤敏感细胞株K562作为对照,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定不同效靶比时NK细胞对CD3+4早期AML细胞KG1a的杀伤活性。结果AML细胞株KG1a中CD34抗原表达率为98.0%±1.1%,分选后的NK细胞纯度为93.2%±3.7%。不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞均有杀伤活性,且随着效靶比的增高,其杀伤活性增高(P<0.05)。结论同种异体NK细胞对CD34+早期AML细胞具有一定的杀伤活性。     

DC-CIK细胞治疗自体外周血造血干细胞移植后急性髓性白血病的临床研究

目的 采用体外培养的树突状细胞（DC）致敏、细胞因子诱导激活的杀伤细胞（CIK）治疗自体外周血造血干细胞移植后的急性髓性白血病患者,探讨该方法降低自体造血干细胞移植后复发的作用及其临床应用的安全性.方法 将体外培养、扩增的DC-CIK细胞分两次回输给患者.随后给予白细胞介素-2皮下注射,100万U/天,连续10天.观察用药期间的不良反应,治疗结束后定期复查患者血液学及遗传学缓解情况.结果 ①安全性：4例患者9例次治疗均能顺利进行.DC-CIK细胞回输过程中有3例次出现寒战、发热,经对症处理能迅速缓解.治疗过程中未见其它不适反应,心电图、肝肾功能无明显变化;②疗效观察：1例患者在治疗前存在染色体异常（46,xy,inv（16））,一个疗程后染色体检查正常.4例患者治疗结束后均处于持续血液学及遗传学缓解状态.随访至今,4例患者已分别无病生存2年半、2年、2年、1年.结论 DC-CIK细胞治疗急性髓性白血病的安全性较好,不良反应轻微,短期具有一定疗效.是否能有效降低自体外周血造血干细胞移植后急性髓性白血病的复发尚待更多病例的积累,值得开展临床随机对照研究.     

LAK细胞治疗对肝癌患者免疫功能影响的研究

目的:研究LAK细胞治疗前后免疫功能的改变。方法:应用人胚胎脾脏及胸腺制备同种异体LAK细胞治疗晚期肝癌30例。在治疗前及治疗10d后检测末梢T细胞亚群、mIL—2R表达(间接免疫荧光法).NK细胞活性(~(125)I—UdR释放法)及血清sIL-2R水平(ELISA法)。结果:治疗后患者末梢血CD_4/CD_8比值增加(1.11± 0.24→1.31±0.25,P<0.01)NK细胞活性提高(36.4％→24.3％→47.6％±25.1％,P<0.01)、mIL-2R表达阳性率增高(33.3％±7.2％→±39.5％±8.4％,P<0.05)、而血清中sIL-2R含量降低[280.8±96.5→248.4±89.4(×10~3U/L)P<0.05]。结论:LAK细胞治疗可增强肝癌患者的免疫功能。     

肝癌患者外周血自然杀伤细胞的功能分析

目的 探讨肝癌患者外周血自然杀伤 (NK) 细胞的数目和功能,以进一步了解肝癌的发病机制. 方法 入选35例肝癌患者和24名健康人,用流式细胞仪检测外周血NK细胞亚群频率;通过检测NK细胞分泌干扰素(IFN) γ的能力和杀伤K562细胞的能力,评价NK细胞的功能.数据用均数±标准差(χ±s)表示,不同组间的比较采用SPSS13.0进行Mann-Whitney非参数检验分析.结果 与健康对照组相比,肝癌患者外周血NK细胞的频率明显降低 (12.19%±10.85%与24.01%±8.78%,u=4.01,P<0.01);其中CD56~(bright)CD16~(neg) NK细胞频率增加 (0.62%±0.39%与0.48%±0.28%,u=1.96,P<0.05),而CD56~(dim)CD16~(pos).NK细胞频率明显降低(11.59%±7.49%与22.66%±8.84%,u=3.92,P<0.01).肝癌患者外周血NK细胞经过佛波酯刺激后分泌IFN γ的能力降低 (有效细胞13.31%),并且对K562细胞的杀伤活性明显降低,以30:1、10:1、1:1与K562细胞混合后,其杀伤效率在肝癌组与对照组分别为16.72%±7.33%与26.29%±12.36%(u=2.52,P<0.05)、8.01%±4.40%与13.09%±5.03%(u=3.32,P<0.05)、3.51%±2.82%与3.42%±1.64%(u=1.56,P>0.05).结论 肝癌患者体内NK细胞功能受损,抗肿瘤能力下降,这可能是肝癌患者抗肿瘤免疫应答缺陷的机制之一.     

原发性肝癌患者外周血中NK细胞亚群及杀伤功能的研究

目的对原发性肝癌患者外周血NK细胞数目、亚群及其杀伤功能进行检测,分析原发性肝癌外周血中NK细胞的特点及机制。方法临床确诊原发性肝癌(HCC)患者110例,健康对照69例,采用流式细胞仪检测外周血NK细胞的数目及亚群;将IL-2活化的PBMC与CFSE标记的K562细胞混合,流式细胞仪检测NK细胞的杀伤活性。结果 1)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期原发性肝癌患者外周血NK细胞占淋巴细胞的比率均显著低于健康对照(P均<0.01);2)与健康对照相比,Ⅰ、Ⅱ期原发性肝癌患者外周血CD56bright NK细胞占淋巴细胞的比率无显著变化(P>0.05),Ⅲ期原发性肝癌患者CD56bright NK细胞占淋巴细胞的比率显著升高(P<0.05);3)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期原发性肝癌患者外周血CD56dimNK细胞占淋巴细胞的比率显著低于健康对照(P均<0.01);4)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期原发性肝癌患者外周血NK细胞CD56bright/CD56dim NK cells值显著高于健康对照(P均<0.01);5)原发性肝癌患者外周血NK细胞裂解杀伤靶细胞K562细胞的活性与健康对照相比显著降低(P<0.05)。结论原发性肝癌患者外周血NK细胞数量显著降低,可...     

稀释式自体输血与少白细胞红细胞输注对肿瘤患者围术期T淋巴细胞亚群、NK细胞影响的比较

目的　探讨输入异体全血、异体少白细胞红细胞和等容血液稀释自体输血对围术期 T淋巴细胞亚群、NK细胞的影响。方法　选择胃癌、结肠癌或直肠癌根治手术患者 60例 ,随机均分为 3组。1H1组 :术中输异体全血 40 0～ 60 0 m l;2 H2 组 :术中输异体少白细胞红细胞 2～ 3单元 ;3 A组 :于麻醉后手术切皮前经桡动脉放血 40 0～ 60 0 ml,同时经静脉输入相当容量的羟乙基淀粉 ,手术后半阶段将自体血回输。分别于术前、手术后即刻、术后 1天、术后 5天抽取静脉血 ,用流式细胞仪测定 T细胞亚群和 NK细胞的数量。结果　三组术后第 1天 CD3、CD4、 CD4/ CD8、 NK细胞较术前显著减少 (P <0 .0 5或 P <0 .0 1) ,其中 H1组和 H2 组较 A组减少更明显 (P <0 .0 5)。术后第 5天异体输血组 CD3、 CD4、 CD4/ CD8、 NK细胞仍较术前显著减少 ,而 H2 组和 A组均基本恢复正常 ,且 A组 CD3、 CD4、高于 H2 组 (P <0 .0 5)。结论　围术期异体输血严重抑制患者免疫功能 ,少白细胞红细胞和等容血液稀释自体输血对患者的免疫功能抑制轻 ,且术后恢复较快 ,自体输血更优于少白细胞红细胞     

柚皮素对人自然杀伤细胞杀伤肝癌细胞的影响及其机制

目的 将人外周血单个核细胞体外扩增为自然杀伤(NK)细胞,与肝癌细胞1∶1共培养。观察柚皮素对NK细胞杀伤率的影响并初步研究相关机制。方法 淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞,在体外经重组人白细胞介素2诱导培养NK细胞;0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L浓度柚皮素作用于人肝癌细胞0、24、48 h后CCK8检测肝癌细胞增殖情况;不同浓度柚皮素作用于人NK细胞24 h后,CCK8检测NK细胞增殖情况;柚皮素作用于NK-肝癌细胞1∶1共培养体系24 h后,CellTiter-LumiTM检测NK细胞杀伤率;实时荧光定量PCR法检测NK细胞中激活型受体NKG2D的基因表达,以及肝癌细胞中NKG2D配体的基因表达。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 经重组人白细胞介素2诱导培养后,NK细胞可扩增至人外周血单个核细胞的82.33%±0.70%;柚皮素作用24 h后,所有质量浓度组CLC5肝癌细胞的增殖率无明显差异(P值均>0.05),25及50μmol/L质量浓度组柚皮素对NK细胞的增殖有较明显的促进作用(P值均<0...     

细胞因子诱导的自体杀伤细胞回输治疗慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能的研究

目的了解细胞因子诱导的自体杀伤（CIK）细胞回输治疗是否能恢复慢性乙型肝炎（CHB）患者树突状细胞（DC）的功能。方法12例CHB患者应用CIK细胞回输治疗,入组前6个月至CIK细胞治疗随访期间,患者未接受任何抗病毒及免疫调节治疗。观察24周后患者髓样树突状细胞（mDC）、浆细胞样树突状细胞（pDC）比例和功能变化,并对其变化结果进行分析。结果应用CIK细胞回输治疗24周后,病毒载量下降≥2个log或转阴的患者外周血mDC、pDC功能明显提高。病毒学应答患者（n=6）病毒载量下降水平与外周血DC功能的恢复密切相关。结论CHB患者接受CIK细胞回输治疗可以提高外周血mDC和pDC功能。     

自身γδT细胞的体外培养鉴定和治疗慢性乙型肝炎的临床观察

目的探讨采用异戊烯焦磷酸（IPP）刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）特异性扩增γδT细胞,观察其在体外对HBV复制和HBeA异表达的影响,并评估应用18T细胞过继回输治疗乙型肝炎的疗效。方法在体外应用IPP和IL-2刺激培养人外周血PBMCs8天,采用流式细胞术检测18T细胞百分率及细胞表面穿孔素、粒酶B、NKG2D和CD44表达量;采用ELISA法检测培养上清IFN-γ、TNF-α 和IL-12含量;将18T细胞与HepG2215细胞按比例共孵育后,检测上清HBeAg和HBVDNA水平。将培养成功的18T细胞回输治疗慢性乙型肝炎患者50例,12个月后观察疗效。结果人外周血PBMC8在培养前78T细胞数占5．12％,CD44表达5．13％。在培养8天后则分别升至91．27％和94．00％;18T细胞表面穿孔素、粒酶B、NKG2D受体表达量（分别为57．1％、71．6％和71．7％）明显高于培养前（分别为0．2％、1．1％和1．3％）;γδT细胞分泌IFN-γ和IL-12量明显增加;扩增的γδT细胞能够抑制HepG2215细胞HBV DNA复制和HBeAg的表达;18T细胞治疗慢性乙型肝炎患者,HBeAg转阴率为54．3％（25／46）,HBVDNA转阴率为66．0％（33／50）。结论乙型肝炎患者PBMC经刺激培养获得的78T细胞免疫功能增强,初步观察表明有一定的临床治疗作用。     

树突状细胞HBsAg疫苗抗乙型肝炎病毒免疫的体外研究

目的 研究人单核细胞来源的树突状细胞（DC）激活的HBsAg特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对表达HBsAg的HepG2/S靶细胞的杀伤效应，以探索DC-HBsAg疫苗在抗乙型肝炎病毒（HBV）中的作用。方法 从健康外周血中分离邮单核细胞，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）的作用下培养7d诱导出DC，然后以DC为刺激细胞在体外诱导出HBsAg特异性CTL；将携有HBV-S基因的pLXSN/S重组质粒电击导入肝癌细胞系（HepG2)，建立表达HBsAg的靶细胞模型HepG2/S；用染色法检测HBsAg特异性CTL对HepG2/S靶细胞的杀伤效应。结果 DC激活的HBsAg特异性CTL对HepG2/S靶细胞具有较强的杀伤效应，不同浓度HBsAg(0μg/L，50μg/L和100μg/L）诱导的CTL的杀伤率分别为3.8%,69.5%和85.1%，而CTL对HepG2细胞无明显杀伤效应。结论 由DC激活的HBsAg特异性CTL具有较强制 特异性抗HBV作用。     

心力衰竭患者白细胞介素6表达和自然杀伤细胞活性的变化

目的探讨充血性心力衰竭(CHF)患者自然杀伤(NK)细胞活性的变化.方法选择NYHA Ⅱ～Ⅳ级的CHF患者48例作为观察组,30例健康体检者作为对照组.应用流式细胞仪测定全血NK细胞数目,并应用酶联免疫吸附法测定血清、培养上清中白细胞介素6(IL-6)含量,应用改良MTT法测定NK细胞杀伤活性.结果①CHF患者循环NK细胞和NK细胞杀伤活性显著降低,并与CHF程度呈负相关(r=-0.873,-0.949,均P＜0.01);②CHF 患者血清、培养上清和IL-2刺激后上清中IL-6显著增加(均P＜0.01),并与CHF程度呈正相关(r=0.988,0.984,0.982;均P＜0.01);③IL-2 刺激可能使CHF患者NK细胞杀伤活性增强(P＜0.01).结论NK细胞数目和活性下降可能是CHF患者免疫功能异常的机制之一;IL-2刺激可使CHF患者NK细胞杀伤活性增强;调节细胞免疫功能治疗可能改善CHF患者预后.     

人脐血来源树突细胞抗乙型肝炎病毒细胞免疫的体外实验研究

目的借助DC的强大抗原呈递能力,使其负载HBsAg后以激活HBsAg特异性的CTL,从而探索一种可有效活化机体抗HBV细胞免疫的免疫方式。方法从健康产妇分娩的胎儿脐血中分离出单个核细胞,在细胞因子组合的作用下诱导出DC,于体外负载HBsAg后,激活自体T细胞成CTL,于体外培养环境下检测其对表达HBsAg的靶细胞HepG2-S的杀伤效应。结果人脐血来源的单个核细胞可在多种细胞因子的作用下,被诱导为DC。DC在负载HBsAg后可于体外活化HBsAg特异性的CTL。效应细胞为负载HBsAg的DC活化脐血单个核细胞,靶细胞分别为不表达和表达HBsAg的HepG2,当效应细胞和靶细胞比为1:1时出现最大的杀伤效率,CTL对靶细胞的杀伤率分别为(16.36±6.42)%和(78.09±9.66)%,差别有统计学意义(P<0.01)。结论健康人脐血来源的DC,具有较强的抗原呈递功能,可在体外激活产生HBsAg特异性CTL,在表达HBsAg的靶细胞模型上可观察到一定杀伤效果,为人脐血来源DC用于抗HBV治疗进行了有益的探索。     

异体输血对消化道出血患者凝血功能及部分免疫功能的影响

[目的]探讨异体输血对消化道出血患者凝血功能及部分免疫功能的影响。[方法]入选消化性溃疡出血、血红蛋白65~75g/L的患者40例,其中不给予输血治疗20例作为对照组,给予输注少白红细胞2~4U的20例作为输血组,并分别于输血组的输血前、输血后采取2组患者静脉血,检测其凝血功能及外周血中自然杀伤(NK)细胞、IgG、IgA、IgM、CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+/CD8~+的变化情况。[结果]输血组输血前与对照组各项指标均无显著差异,输血后NK细胞、CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+、IgG较输血前显著减少(P0.05),IgA、IgM与输血前变化不显著;输血组输血前、输血后1d凝血功能指标变化均差异不显著(P0.05)。[结论]异体输血对纠正患者失血性贫血有疗效,但对患者免疫功能抑制明显,对于异体输血量在一定范围内的患者凝血功能无明显影响。     

NK细胞过继免疫治疗HIV感染研究进展

NK细胞是天然免疫中的重要效应细胞,在机体早期抗病毒、抗肿瘤的免疫应答中起关键作用。NK细胞因其主要组织相容性复合体非限制性、泛特异性识别和杀伤靶细胞及快速应答等特点成为免疫治疗研究热点。随着对NK细胞表型、功能及作用机制研究的不断深入,NK细胞过继免疫治疗也被尝试应用于HIV感染治疗。本文从NK细胞生物学特性、NK细胞在HIV感染中的作用以及NK细胞过继免疫治疗等方面来阐述NK细胞过继治疗在HIV感染领域应用的机遇与挑战。