自体激活雪旺细胞联合胚胎脊髓细胞悬液修复脊髓损伤中的突触发育过程

 目的观察分析胚胎脊髓细胞悬液(fetal spinal cord cell suspension, FSCS)联合自体激活 雪旺细胞(autologus activated Schwann cells, AASCs)在损伤脊髓移植区中的突触发育过程。方法 42只 Wistar成年大鼠结扎单侧隐神经, 1周后取出结扎远端神经组织, 分离、培养、纯化 AASCs。以改良 Allen 法(10g x 5 cm)打击脊髓, 3天后将孕 14天(E₁₄) FSCS 20μl联合 AASCs植入损伤空腔, 移植后 2、4、6、 8、10和 12周, 以光学显微镜、电镜、免疫组织化学观察移植物成活、分化及其与宿主之间关系。结果 移植区 AASCs生长分化良好, 胶质瘢痕少。成神经细胞最先展示了胞质突起, 随之出现低电子密度的突 触前、后膜, 突触前、后膜电子密度逐渐增高形成良好的致密突起。突触小泡数量和种类逐渐增多, 突触 小泡有圆形清亮小泡、椭圆形小泡、颗粒状小泡和扁平小泡-f型。突触的连接方式由单个的胞体-树突 突触, 出现多个的胞体-树突和树突-树突突触。同时, 移植成神经细胞、成少突胶质细胞、成星形细胞的 细胞器日渐完善, 细胞功能活跃。血脑屏障也随之出现。移植区可见神经微丝、组织胺、降钙素基因相关 肽、胶原纤维酸性蛋白阳性纤维。结论 (1) AASCs辅助下 FSCS在成年大鼠损伤脊髓内可发育为成熟 的突触; (2) FSCS与宿主脊髓重建突触方式的信息交换具有潜在可行性。     

胚胎脊髓细胞悬液植入急性成年大鼠损伤脊髓

目的：建立胚胎脊髓细胞悬液移植于脊髓损伤模型，以评价其治疗脊髓损伤的可能性。方法：４２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠以改良Ａｌｅｎ法（５０ｇｃｍ）打击脊髓，３天后将孕１４天（Ｅ１４）ＦＳＣＳ２０μｌ植入损伤空腔，移植后２、４、６、８、１０、１２周，以光、电镜、免疫组织化学观察移植物存活、分化及其与宿主之间关系。结果：移植细胞逐渐长大。充满不规则空腔，宿主ＮＦ、５－ＨＴ、ＣＧＲＰ纤维分别出现于移植物，ＧＦＡＰ纤维于宿主移植物交界处适量存在。移植成神经细胞、成少突胶质细胞、成星形细胞的细胞器日渐完善，细胞功能活跃。复杂及多样突触与细胞连接，将上述细胞与神经纤维、胶质纤维、毛细血管网在三维空间内连接成一体，并与宿主紧密嵌合。结论：（１）成年大鼠脊髓损伤３天后植入ＦＳＣＳ可以存活。（２）移植物进入宿主后，出现再分布，继而器官样分化。（３）长、短传导束进入移植物，显示了移植物的桥作用。（４）成少突胶质细胞的神经营救作用。（５）移植区内出现多种突触，提示移植物中继作用的可能性。     

神经生长因子和脑源性神经营养因子基因修饰的雪旺细胞和胚胎脊髓细胞悬液植入促进大鼠脊髓损伤修复的研究

目的从转基因角度探讨治疗脊髓损伤的有效性。方法用改良Allen打击法制作脊髓损伤动物模型,1周后将神经生长因子nervegrowthfactorNGF和脑源性神经营养因子brainderivedneurotrophicfactorBDNF基因修饰的雪旺细胞(Schwanncells,SCs)和胚胎脊髓细胞悬液(fetalspinalcordcellsuspension,FSCS)移植联合植入脊髓损伤部位,1个月和3个月后用免疫组化方法观察神经丝蛋白NF、胶质纤维酸性蛋白GFAP、髓基质蛋白MBP、5-羟色胺5HT、NGF和BDNF的变化,并根据图像分析各实验组的免疫阳性反应变化;通过光电镜观察脊髓组织形态学改变。结果将转NGF和BDNF基因的SCs与FSCS联合植入脊髓损伤部位有以下优点:1移植物能很好地与宿主融合和存活,2能发挥FSCS的“桥接”、“中介”作用,3SCs可以起到神经轴突的“导管”、“导向”作用,4神经营养因子(neurotrophicfactors,NTFs)NGF和BDNF可以刺激轴突的生长和挽救受损的神经元。结论将NGF和BDNF基因修饰的SCs和FSCS移植联合起来,让局部释放的NTFs不断刺激、引导宿主纤维和移植物的整合与联系,以促进脊髓损伤的修复。此方法为将来治疗脊髓损伤提供线索。     

新生鼠和成年鼠脊髓损伤后胚胎脊髓移植对大鼠损伤脊髓功能恢复的影响

目的研究新生鼠和成年鼠脊髓损伤后胚胎脊髓移植对大鼠损伤脊髓功能恢复的影响。方法将新生鼠和成年鼠腰段脊髓半切洞损伤,取E14胚胎脊髓组织移植到损伤区,手术后4、8、12周,进行组织学检查,联合行为评分,感觉诱发电位,运动诱发电位检查。结果组织学检查发现移植的胚胎脊髓在宿主脊髓中存活。联合行为评分,感觉诱发电位,运动诱发电位潜峰时的恢复,新生鼠移植组均优于成鼠移植组(P<0.05)。结论通过各种功能检查(CBS,SEP,MEP)表明胚胎脊髓移植能够促进脊髓损伤后新生鼠和成鼠运动功能的恢复。     

大鼠胚胎脊髓组织移植的实验研究

为研究大鼠胚胎脊髓组织至成鼠后影响移植存活、生长、再生及与宿主神经元功能联络的的因素，采用快速提取、移植胚胎脊神经元细胞悬液（ＥＴ），并设加入自体现周围神经雪旺氏细胞（ＳＣ）悬液移植组（ＥＳＴ）对照。结果两组移植神经元均有不同程度存活。ＥＴ组存活数最多（Ｐ〈０．０１），ＥＳＴ组分化最好（Ｐ〈０．０１），术后１０周辣根过化酶（ＨＲＰ）逆行示踪有神经功能联络。认为移植的胚胎脊髓神经元可存活、分化，并与     

胚胎脊髓组织移植促进成年宿主损伤脊髓功能恢复的研究

目的 探讨胚胎脊髓组织移植促进成年宿主损伤脊髓功能恢复的作用。方法 采用成年大鼠脊髓半切洞损伤模型，移植胚胎大鼠脊髓组织，术后进行联合行为计分（CBS)、体感诱发电位(SEP）、运动诱发电位(MEP）和性行为及生育机能检查。结果 移植组CBS与对照组比较相差显著（P＜0.05)，移植术后4周以内两者相差非常显著(P＜0.01）；移植组SEP、MEP早期反应的峰潜伏时恢复优于对照组(P＜0.05)；术后4～12周75%的雌鼠阴道涂片检出精子并能正常生育。结论 胚胎脊髓移植能促进成年宿主损伤脊髓的功能恢复。     

移植胚胎脊髓促进宿主损伤脊髓的组织形态重建

近年来胚胎脊髓移植研究取得了不少进展.然而移植后宿主损伤脊髓的形态结构得到明显改善的报道并不多.我们采用大鼠脊髓半切洞损伤模型,借助显微外科技术.严格控制移植的技术环节.进行大鼠同种胚胎脊髓移植研究,结果表明胚胎脊髓组织移植物较理想地促进了成年大鼠损伤脊髓的组织形态重建.     

胎鼠脊髓对成鼠急性脊髓损伤的修复作用——光镜CB—HRP示踪与还原银染色

把Ｅ１４胎鼠脊髓植入成鼠损伤脊髓后，分别在术后７、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 １２０天，用 ＣＢ－ＨＲＰ和还原银染色显示了宿主脊髓和移植物内的神经元及神经纤维。结果表明，虽然术后７天就可见宿主神经纤维再生进入移植物，但两种方法均不能显示移植的胚胎神经元及其突起。自术后３０天起，移植物内神经元可被标志，但神经元的体积小，突起数目也短而少。随着神经元体积的逐渐增大和突起数目的不断增多延长，可见宿主神经元向移植物内投射突起，并和后者神经元相互联系。作者认为，胚胎脊髓虽可在术后早期机械修补成鼠脊髓损伤，但并不能与宿主脊髓组织发生广泛的有机纤维联系，这和胚胎脊髓移植后，神经元的缓慢分化发育有关。     

脊髓损伤两种修复方法的比较研究

目的：比较脊髓损伤后两种修复方法的效果。方法：损伤成鼠胸髓左后术,移植孕１４ｄ３胚胎脊髓（Ｆ组）,胚胎脊髓加自体带蒂正中神经（Ｖ＋Ｆ组）及不移植（对照组）,观察胚胎脊髓的生长、分化情况及对宿主的修复能力。结果：Ｖ＋Ｆ组胚胎脊髓体积增长速度、神经纤维数量和神经元密度显著高于Ｆ组（Ｐ〈０．０１）,细胞分化较好,突触较成熟,界面区无明显的胶质增生。Ｖ＋Ｆ组ＳＥＰ的Ｐ１、Ｎ１波潜伏期显著缩短（Ｐ〈０．０１     

不同的组织移植到宿主脊髓组织病理学观察

目的：研究胚胎脊髓,肋间神经,大网膜,椎旁肌移植到宿主脊髓后发育过程中形态变化。方法：应用脊髓半切洞模型,移植后１,２,４,１２周,进行ＨＥ、Ｎｉｓｓｌ、嗜银染色和电镜检查,观察移植植物存活、分化及其与宿主之间的关系。结果：胚胎脊髓移植到损伤的脊髓后,可在宿主脊髓内继续分化发育,与宿主脊髓形成部分纤维连接;助间神经移植后,可能通过存活的雪工细胞与宿主脊髓建立一定的结构联系;带蒂的大网膜移植后,可与宿主脊髓形成血管连接;带蒂的椎旁肌移植最终形成瘢痕组织。结论：胚胎脊髓组织能较好地修复损伤的脊髓。     

活性巨噬细胞移植治疗实验动物脊髓损伤的疗效分析

目的　研究活性巨噬细胞在脊髓损伤早期移植后对星形胶质细胞和神经轴突的作用 ,明确该细胞对脊髓损伤的作用效果。方法　将 48只SD大鼠采用随机配对的方法分为 2 4组 ,每组大鼠分别行T1 0 段脊髓撞击性损伤和伤后巨噬细胞悬液髓内注射。术后 1、 4d和 1、 2、 3、 4周收集脊髓标本并冰冻切片、免疫组化染色 ,显微镜下巨噬细胞、星形胶质细胞及神经纤维计数。结果　移植组术后 4周时BBB运动功能评分无明显提高 ,镜下观察见移植组大鼠在伤后 3周内巨噬细胞数目高于对照组 ,星形胶质细胞在损伤早期的反应较轻 ,但单位截面积上的神经轴突数目少于对照组。结论　活性巨噬细胞在撞击性脊髓损伤早期移植可加重神经轴突的继发性损伤 ,影响预后     

神经生长因子基因转染间充质干细胞移植对损伤脊髓保护的实验研究

目的 探讨神经生长因子(NGF)基因转染间充质干细胞(MSCs)移植对损伤脊髓的保护作用.方法 近交系Wistar大鼠(n=56),随机分为治疗组、空白组、对照组,采用改良的Allen打击法造成脊髓损伤(SCI)的模型;分离培养同种异体MSCs,纯化、扩增后,MSCs经绿色荧光蛋白(GFP)标记并被NGF基因转染后重新悬垂(1×108/ml)于SCI 7 d后移植入受损硬脊膜下.对照组注射等量的磷酸盐缓冲液(PBS),分别在MSCs移植后24 h和1、2周后取损伤脊髓段冰冻切片,.在荧光显微镜下观测移植细胞的分布情况;观测MSCs移植后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和NGF表达的变化;进行神经功能(BBB)评价. 结果 MSCs移植后可向损伤脊髓中心聚集,SCI后.治疗组GFAP和NGF的表达明显高于对照组(P<0.05);BBB评分显示治疗组和对照组神经功能差异有统计学意义. 结论 NGF基因转染的MSCs移植促进了脊髓神经功能的恢复,移植后具有一定的分布规律.     

The recovery of 5-HT transporter and 5-HT immunoreactivity in injured rat spinal cord

Study design  Experimental spinal cord injury. Objective  To determine the role of serotonin (5-HT) and 5-HT transporter in recovery from spinal cord injury. Method  We examined 5-HT and 5-HT transporter of spinal cord immunohistologically and assessed locomotor recovery after extradural compression at the thoracic (T8) spinal cord in 21 rats. Eighteen rats had laminectomy and spinal cord injury, while the remaining three rats received laminectomy only. All rats were evaluated every other day for 4 weeks, using a 0–14 point scale open field test. Results  Extradural compression markedly reduced mean hindlimbs scores from 14 to 1.5 ± 2.0 (mean ± standard error of mean). The rats recovered apparently normal walking by 4 weeks. The animals were perfused with fixative 1–3 days, 1, 2 and 4 weeks (three rats in each) after a spinal cord injury. The 5-HT transporter immunohistological study revealed a marked reduction of 5-HT transporter-containing terminals by 1 day after injury. By 4 weeks after injury, 5-HT transporter immunoreactive terminals returned to the control level. The 5-HT immunohistological study revealed a reduction of 5-HT-containing terminals by 1 week after injury. By 4 weeks after injury, 5-HT immunoreactive fibers and terminals returned to the control level. Conclusion  We estimated the recovery of 5-HT transporter and 5-HT neural elements in lumbosacral ventral horn by ranking 5-HT transporter and 5-HT staining intensity and counting 5-HT and 5-HT transporter terminals. The return of 5-HT transporter and 5-HT immunoreactivity of the lumbosacral ventral horn correlated with locomotor recovery, while 5-HT transporter showed closer relationship with locomotor recovery than 5-HT. The presence of 5-HT transporter indicates that the 5-HT fibers certainly function. This study shows that return of the function of 5-HT fibers predict the time course and extent of locomotory recovery after thoracic spinal cord injury.     

自组装peptide胶对神经干细胞在大鼠急性损伤脊髓中细胞分化的影响

目的 观察自组装peptide胶对神经干细胞(NSCs)在大鼠急性期损伤脊髓中的细胞分化的影响.方法 分离、培养和鉴定大鼠NSCs与自组装peptide胶共培养;SD大鼠25只采用NYU-Ⅱ型脊髓打击器制作T10脊髓损伤模型;急性期于损伤脊髓区分别行注射移植,其中联合细胞移植组(n=10)、单纯细胞移植组(n=10)及对照组(n=5).术后第2、4、8周取损伤部位脊髓,免疫组织化学染色检测移植细胞的分化.结果 成功建立大鼠NSCs的体外培养体系;移植的NSCs在大鼠脊髓内存活超过8周,单纯移植组、细胞分化比例较低,分化的NSCs主要为表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原细胞,未见NSCs分化为表达微管相关蛋白(MAP2)标志抗原细胞;联合移植组,细胞分化比例较高;NSCs可分化为表达MAP2、Oligo、GFAP标志抗原细胞.结论 自组装peptide胶能够提高神经干细胞在大鼠急性期损伤脊髓中的分化比率,并有部分细胞可分化为表达神经元特异抗原的细胞.     

自体移植的大鼠骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处的存活及分化

目的观察自体移植的骨髓间充质干细胞(BMSC)在脊髓损伤(SCI)处的存活及向神经细胞分化情况。方法将36只雄性SD大鼠随机分为PBS注射组(PBS组)和BMSC自体移植组(BMSC组)。BMSC组大鼠在术前均进行自体BMSC分离培养。2组大鼠均采用改良Allen撞击装置制备T9水平的SCI模型,PBS组于损伤处注射PBS,BMSC组注射第4代自体BMSC。于移植后2、3、5周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法进行运动功能评分;移植后2、3、5周取损伤部位脊髓,采用Hoechst33342染色法观察移植细胞存活情况,同时行免疫荧光化学染色检测自体移植的BMSC中微管相关蛋白2(MAP-2)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果移植后2、3、5周,BMSC组大鼠BBB评分均高于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植后2、3、5周,BMSC组大鼠损伤处脊髓有不同数量Hoechst33342标记细胞存活,其中2周时细胞存活较多,5周时细胞存活较少;移植后2、3周,未检测到移植细胞表达MAP-2及GFAP,5周时检测到部分移植细胞表达MAP-2和GFAP。结论SCI后立即进行移植的自体BMSC可在损伤处存活,部分存活细胞可向神经元和星形胶质细胞方向分化,促进大鼠后肢运动功能的恢复。     

Influence of cryopreserved olfactory ensheathing cells transplantation on axonal regeneration in spinal cord ofadult rats

Objective: To observe the effects of cryopreserved olfactory ensheathing cells (OECs) transplantation on axonal regeneration and functional recovery following spinal cord injury in adult rats. Methods : Twenty-four rats were divided into experimental and control groups, each group having 12 rats. The spinal cord injury was established by transecting the spinal cord at T10 level with microsurgery scissors. OECs were purified from SD rat olfactory bulb and cultured in DMEM ( Dulbecco‘s minimum essential medium) and cryopreserved (-120~C) for two weeks. OECs suspension I (1-1.4) x 105/ul ] was transplanted into transected spinal cord, while the DMEM solution was injected instead in the control group. At 6 and 12 weeks after transplantation, the rats were evaluated with climbing test and MEP ( moter evoked potentials) monitoring. The samples of spinal cord were procured and studied with histological and immunohisto chemical stainings. Results: At 6 weeks after transplantation, all of the rats in both transplanted and control groups were paraplegic, and MEPs could not be recorded. Morphologyof transplanted OECs was normal, and OECs wereinterfused with host well. Axons could regrow into gap tissue between the spinal cords. Both OECs and regrown axons were immunoreactive for MBP. No regrown axons were found in the control group. At 12 weeks after transplantation, 2 rats (2/7) had lower extremities muscle contraction, 2 rats (2/7) had hip and/or knee active movement, and MEP of 5 rats (5/7) could be recorded in the calf in the transplantation group. None of the rats (7/7) in the control group had functional improvement, and none had MEPs recorded. In the transplanted group,histological and immunohistochemical methods showed the number of transplanted OECs reduced and some regrown axons had reached the end of transected spinal cord. However, no regrown axons could be seen except scar formation in the control group. Conclusions: Cryopreserved OECs could integrated with the host and promote regrowing axons across the transected spinal cord ends.     

X线照射促进损伤脊髓组织修复的实验研究

目的 探讨X线照射对大鼠脊髓损伤(SCI)区组织结构及神经功能恢复的作用.方法 采用Allen打击法建立大鼠SCI模型,46只雌性Spragne-Dawley大鼠均接受T<,11-12>节段SCI.所有人组实验动物随机分为空白组、10 Gy照射组、20 Gy照射组,照射组于SCI后2周接受X线照射,空白组不予照射.各组实验动物分别于SCI后6周、14周处死半数,期间进行运动学、电生理学检测,大鼠处死后取出损伤区脊髓组织进行组织学检查,并对结果进行统计学分析.结果 SCI后6周、14周时照射组(10 Gy、20 Gy)神经丝(NF)计数均较空白组显著增多(P<0.05).各组髓鞘碱性蛋白(MBP)计数14周时较6周显著数少(P<0.05),14周时照射组(10 Gy、20 Gy)较空白组显著减少(P<0.05).各组胶原纤维酸性蛋白(GFAP)、Nngo-A计数14周时较6周时显著增多,照射组与空白组计数差异无统计学意义.运动学、SEP检测结果各组间差异无统计学意义.结论 大鼠SCI后脊髓中枢神经组织结构及功能具有自我修复机制,该进程至少持续14周,X线照射对其具有一定的促进作用.     

巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白在成年大鼠脊髓损伤后不同时期的表达变化

目的 探讨成年大鼠脊髓损伤后不同时期、不同部位巢蛋白(nestin)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达变化。方法 8周龄SD大鼠72只，雌雄各半；体重180～220g。随机分为实验组66只(n=6)，对照组6只(n=6)。实验组：用动脉夹压迫法建立动物模型，于造模后1、3、5d，1，2．3．4、5、6、7和8周各时间点，分别在脊髓损伤部位和损伤邻近部位取材，进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光染色，随机选取不同时间点的组织片，用LeicaQ5001W图像处理系统观察脊髓损伤后不同时期、不同部位(损伤部位和其周围)nestin和GFAP的表达变化。对照组：打开椎管，暴露脊髓相应节段，不压迫，彻底止血后缝合伤口，伤口愈合后，取材和检测同上。结果 甲苯胺蓝染色：对照组显示脊髓神经元胞体和突起轮廓清晰，胞核为深蓝色；实验组于脊髓损伤1d后，显示大、中型神经元数目明显减少，神经元胞浆呈深蓝色，尼氏体模糊，胞体塌陷皱缩或碎裂，胞核椭圆或三角形、染成淡蓝至深蓝色，2～8周胞核呈深蓝色。免疫荧光染色：对照组显示除脊髓中央管周围可见到少量nestin表达外，其它部位几乎不表达；GFAP在脊髓各个部位均有表达；实验组：脊髓损伤1d后，损伤区域nestin和GFAP表达增加，3～7d后，除损伤区域外，邻近及周边区域nestin和GFAP的表达显著增加，并逐渐达到高峰，随着时间的推移其表达逐渐下降，nestin和GFAP的表达于损伤2周后逐渐恢复到对照组水平。结论 成年大鼠脊髓损伤可诱导nestin表达，神经干细胞对脊髓损伤有反应，nestin表达和反应性星形胶质细胞增生呈正相关，并可能参与中枢神经系统损伤修复。     

嗅鞘细胞移植在大鼠截瘫模型中的应用

目的探讨嗅鞘细胞局部移植治疗脊髓损伤的可行性、安全性及细胞移植数量和时机与疗效的关系。方法应用改良Allen’s法制备大鼠T10脊髓损伤模型,第1部分：随机分4组,移植时间分别设定为手术即时0,1,2,3周,共分为上述4组（随机）,每组共10只,4周后进行CBS评分。第2部分：取40只大鼠,随机分为5组,A组：注细胞数量为5：〈10。个。B组：移植方法同A组。注入细胞数量为4×10^5个。C组：移植方法同A组,注入细胞数量为3×10^5个。D组：移植方法同A组,注入细胞数量为2×10^5个;E组：移植方法同A组,将20μlDMEM／F12培养液注入损伤部位。结果在移植细胞为固定的4×10^5个时,损伤后2周移植大鼠CBS评分（损伤后4周,20．12±5．23,P〈0．05）较其余时间好：而在移植时间均为损伤后两周的情况下。B、C两组大鼠CBS评分（损伤后4周,B：20．34±5．63,C：20．34±5．63,P〉0．05）无明显差别,但较其余各组好（P〈0．05）。结论嗅鞘细胞局部移植治疗脊髓损伤安全有效,移植细胞数量适中和移植时间在2周时脊髓神经功能恢复较好。