ZIPK在PKCα、PKCε调节失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用

目的： 观察失血性休克后,Zipper相互作用蛋白激酶（ZIPK）在蛋白激酶Cα（PKCα）、蛋白激酶Cε（PKCε）调节失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用。方法： 采用离体微血管环张力测定技术,观察褪膜后抑制ZIPK对PKCα、PKCε激动剂增高失血性休克肠系膜上动脉（SMA）一级分支微血管钙敏感性作用的影响;同时观察缺氧血管平滑肌细胞（VSMCs）在PKCα、PKCε激动剂作用下ZIPK蛋白表达、活性的变化。结果： （1）失血性休克后SMA钙敏感性明显降低,PKCα、PKCε激动剂可显著增高休克后的SMA钙敏感性,使Ca2+的Emax由正常对照的47.2％分别增高至66.5％（P<0.01）和66.3％（P<0.01）;抑制ZIPK,可显著降低PKCα激动剂和PKCε激动剂的增高休克SMA钙敏感性的作用,Ca2+的Emax降低至正常对照组的42.6％（P<0.01）和47.5％（P<0.01）。（2）缺氧2 h的VSMCs中,ZIPK蛋白表达降低,活性降低,PKCα、PKCε激动剂可增高缺氧VSMCs的ZIPK蛋白表达和活性。结论： PKCα、PKCε可能通过改变ZIPK的蛋白表达和活性,来调节失血性休克后血管的钙敏感性。     

吡那地尔预处理提高失血性休克血管的反应性和钙敏感性

目的:观察吡那地尔预处理诱导对失血性休克血管反应性和钙敏感性的保护作用以及与蛋白激酶C(PKC)α、ε的关系。方法:观察不同剂量吡那地尔在休克前不同时间预处理,对失血性休克大鼠去甲肾上腺素(NE)的升压效应[平均动脉压(MAP)增幅]和收缩血管效应[肠系膜上动脉(SMA)管径变化]的影响,以及对SMA一级分支微血管环血管反应性和钙敏感性的影响;观察PKCα、PKCε抑制剂对吡那地尔预处理诱导保护效应的影响,以及吡那地尔预处理对PKCα、PKCε蛋白转位的影响,证实PKCα和PKCε的作用。结果:(1)失血性休克2 h后,NE的升压效应和收缩血管效应、SMA血管反应性和钙敏感性较正常组均显著降低(P0.01),25μg/kgBW吡那地尔休克前30 min预处理可改善休克后的上述变化;(2)PKCα和PKCε的拮抗剂可以消除25μg/kg BW吡那地尔休克前30 min预处理诱导的失血性休克血管反应性和钙敏感性保护,使NE的Emax分别降低42.9%和62.9%(P0.01),使Ca2+的Emax分别降低31.1%和56.1%(P0.01);25μg/kg BW吡那地尔休克前30 min预处理使PKCα和PKCε的胞膜表达较休克2 h增高,胞浆表达较休克2 h降低(P0.01)。结论:吡那地尔预处理可通过诱导PKCα和PKCε的转位和活化,提高大鼠失血性休克后血管的反应性和钙敏感性。     

Rho激酶在阻断休克肠淋巴液回流、提高大鼠血管钙敏感性中的作用

目的: 观察Rho激酶在肠淋巴管结扎或肠淋巴液引流提高失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用。方法: Wistar雄性大鼠随机分为假手术组(sham)、失血性休克组(shock)、休克肠淋巴管结扎组(shock+ligation,行肠淋巴管结扎)、休克肠淋巴液引流组(shock+drainage,行肠淋巴液引流),在休克3 h或sham组的相应时点,制备肠系膜上动脉(SMA)血管环,采用离体血管环张力测定技术,观察SMA血管环对梯度钙离子收缩性的变化;shock+ligation与shock+drainage组SMA血管环分别与Rho激酶激动剂血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)、抑制剂fasudil孵育后,观察钙敏感性变化。结果: Shock组SMA血管环的钙敏感性显著低于sham组;shock+ligation组与shock+drainage组SMA血管环钙敏感性显著高于shock组,但低于sham组。Shock+ligation组与shock+drainage组SMA血管环与AngⅡ或fasudil孵育后,AngⅡ不同程度地提高了shock+ligation组与shock+drainage组大鼠SMA血管环对梯度钙离子的收缩性与pD₂;fasudil显著降低了两组大鼠SMA血管环对梯度钙离子的收缩性与最大收缩力E_max,降低了shock+ligation组的pD₂。结论: Rho激酶在阻断休克肠淋巴液回流提高血管钙敏感性中发挥重要作用。     

MCI—154抗休克效应的血管机制

目的我们以前的研究已证明MCI-154抗休克效应的心脏机制为增加肌钙蛋白对Ca2+的敏感性.本文进一步研究MCI-154抗休克效果的血管机制.本实验分2部分.方法1.MCI-154扩血管作用的体外研究制备正常大鼠的胸主动脉环,观察10-8-10-10的MCI-154对不同浓度的NE,80mmol/L的KCl,3×10-6MPE及20mmol/L的caffiene收缩血管的影响,制备蜕膜胸主动脉环,观察在Pca为6的溶液中,MCI-154对Ca2+收缩血管的影响.结果(1)MCI-154剂量依赖性方式抑制NE及KCl的缩血管作用,证明对电压依赖性及受体依赖性钙通道有抑制作用;(2)MCI-154剂量依赖性抑制PE及caffiene的缩血管作用,证明对肌浆网上IP3敏感性及IP3非敏感性钙池有抑制作用;(3)在蜕膜VSM中,MCI-154抑制Ca2+的缩血管作用,证明MCI-154降低VSM收缩系统对Ca2+的敏感性.方法2.按以前方法复制失血性休克模型,测VSMC胞浆游离Ca2+肖度,CaM活性,血管组织中CaM、cPKC、calponin在胸主动脉平滑肌中表达,用Westernblot杂交分析法进行.结果本实验证明MCI-154抗失血性休克的血管机制为(1)降低休克后VSMC胞浆内超载的[Ca2+]i;(2)较早恢复休克后降低的VSMC游离CaM活性;(3)较早恢复休克后降低的VSM组织中cPKC表达水平;(4)抑制PKC-ζ活化和相对增加calponin-α表达.结论MCI-154通过抑制PKC活化发挥心肌钙增敏和血管平滑肌钙失敏效应.     

Rho激酶和PKC在环孢素A改善休克血管反应性中的作用及与MPTP的关系

目的：观察Rho激酶和PKC在环孢素A( CsA)改善创伤失血性休克大鼠血管反应性中的作用及与线粒体通透性转换孔(MPTP)开放的关系。方法采用创伤失血性休克大鼠模型和缺氧培养的血管平滑肌细胞(VMSC),观察了Rho激酶和PKC在CsA调节休克血管反应性中的作用,以及对血管平滑肌细胞线粒体MPTP开放的影响,同时观察CsA对休克动物炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响。结果 CsA明显改善了休克血管反应性,Rho激酶抑制剂Y27632可显著拮抗CsA恢复休克血管反应性的作用,但是PKC抑制剂staurosporine对CsA的作用无明显影响。 CsA和Rho激酶激动剂U46619都可抑制缺氧后线粒体MPTP的开放程度。休克后大鼠血液中TNF-α和IL-1β的浓度均显著增加,但CsA处理仅使其轻微减少。结论 CsA可以通过抑制线粒体MPTP开放改善休克后血管的低反应性,发挥对创伤休克的治疗作用。 Rho激酶参与了这其中的调节过程。     

Rho激酶、PKC、PKG对休克大鼠血管钙敏感性的作用

<正>目的:探讨Rho激酶、蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)、蛋白激酶G(Protein Kinase G,PKG)在阻断休克淋巴液回流及提高大鼠血管钙敏感性中的作用机制。方法:54只Wistar雄性大鼠,随机分为假手术组(Sham组,n=6)     

血管平滑肌细胞钙库Ca~(2+)动员的变化在休克血管低反应性形成中的作用

目的:探讨大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)在缺氧培养时胞内钙库钙释放的变化情况,并探讨胞内钙库钙释放在休克血管对去甲肾上腺素(NE)低反应性中的可能作用,为进一步阐明休克血管低反应性的发生机制提供依据。方法:建立大鼠失血性休克(40mmHg,2h)的在体模型及大鼠VSMCs缺氧细胞模型;采用Fura-3/AM钙离子成像方法测定VSMCs胞浆钙离子浓度([Ca2+])的变化情况及其与IP3受体(IP3R)及雷诺定受体(RyR)介导的钙释放通道的关系;采用离体器官张力测定技术,检测不同内钙释放依赖信号通路在休克血管低反应性形成中的可能作用。结果:在细胞外液无Ca2+的前提下,NE可通过动员内钙释放引起VSMCs胞浆[Ca2+]的明显升高;缺氧培养后VSMCs胞浆[Ca2+]较正常对照组有所升高,由NE诱导的VSMCs胞浆[Ca2+]较对照组有所降低,但均无显著差别;但在缺氧培养的VSMCs,细胞内钙库钙释放功能明显改变,表现为与正常对照组比较,缺氧VSMCs由IP3R敏感钙释放通道开放剂adenophostinA(10-5mol/L)及ATP-Na2(10-4mol/L)诱导的VSMCs胞浆[Ca2+]升高不显著,但RyR敏感钙释放通道开放剂caffeine可诱导缺氧VSMCs胞浆[Ca2+]的明显升高;失血性休克(40mmHg,2h)可引起大鼠腹主动脉血管对由NE诱导的收缩反应性明显降低,IP3R激动剂ATP-Na2(10-4mol/L)并不明显提高休克血管对NE的收缩反应性,但IP3R阻断剂heparin(104U/L)可明显抑制休克血管对NE的收缩反应性;此外,在无钙及含钙的K-H液中,RyR阻断剂ryanodine(10-5mol/L)可部分恢复休克血管对NE的收缩反应性,而RyR激动剂caffeine(10-3mol/L)可进一步降低休克血管对NE诱导的收缩反应性。结论:失血性休克后由RyR介导的内钙释放被激活部分参与了休克血管低反应性的形成。     

失血性休克大鼠淋巴管低反应性的钙敏机制

目的:观察失血性休克(HS)大鼠离体淋巴管对去甲肾上腺素(NE)反应性以及钙敏感性的变化,探讨淋巴管低反应性的钙敏机制。方法:Wistar雄性大鼠随机均分为sham组(仅手术)和HS组(复制HS模型,分为休克1 h、休克2 h亚组),制备胸导管环(每组均n=48)。采用离体淋巴管张力测定技术,观察淋巴管环对NE反应性以及钙敏性[梯度Ca2+与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和胰岛素(Ins)分别孵育]变化。结果:与sham组相比,HS1 h组、HS 2 h组大鼠离体淋巴管对NE反应的量效曲线以及HS 2 h组淋巴管对Ca2+的量效曲线明显右移,对NE多个浓度的反应性以及不同Ca2+浓度的收缩力、最大收缩力(Emax)、亲和力指数(pD2)均显著降低。HS大鼠离体淋巴管环与钙敏感性增强剂AngⅡ孵育后,对NE的反应性以及钙敏感性均显著升高,但仍低于sham组;与钙敏感性抑制剂Ins孵育后,对NE的反应性以及钙敏感性均显著降低。结论:HS大鼠离体淋巴管的低反应性与钙失敏有关,这是休克时淋巴管收缩性降低的机制之一。     

Ang-1、Ang-2差异表达在大鼠失血性休克血管反应性双相变化中的作用

目的:观察血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)在失血性休克后肠系膜上动脉中的表达变化,及其在失血性休克血管反应性双相变化中的作用。方法:采用离体微血管环张力测定技术和Western blotting技术,观察失血性休克后不同时点肠系膜上动脉(SMA)一级分支微血管环的血管反应性、SMA中Ang-1、Ang-2的蛋白表达变化;并观察在缺氧高血管反应期和低血管反应期,给予和抑制Ang-1、Ang-2对SMA一级分支血管环血管反应性的影响。结果:(1)失血性休克后,肠系膜上动脉血管反应性呈早期增高、晚期降低的双相变化,休克10min组NE的Emax最高,为正常的129.3%(P0.01);Ang-1的蛋白表达也呈早期增高、晚期降低的双相变化,休克10min组的Ang-1蛋白表达最高,为正常对照组的1.85倍;Ang-2的蛋白表达在休克早期变化不大,在休克后期逐渐增高,休克4h组的Ang-2蛋白表达最高,为正常对照组的2.90倍。(2)在高血管反应期(缺氧30min),外源性给予Ang-1对血管反应性影响不大,尽管NE的Emax增大,但无显著差异(P0.05),外源性给予Ang-2可降低血管反应性(P0.01);在低血管反应期(缺氧4h),外源性给予Ang-1可改善血管反应性(P0.01),外源性给予Ang-2可进一步降低血管反应性(P0.01)。结论:失血性休克后,肠系膜上动脉存在Ang-1、Ang-2的差异表达,这种差异表达参与了失血性休克血管反应性双相变化的形成。     

PKC和ROCK对硝苯地平舒张血管作用的影响

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)及Rho相关激酶(ROCK)对硝苯地平舒张大鼠离体胸主动脉血管环作用的影响。方法:采用离体血管环灌流装置观察硝苯地平对基础状态血管环及去甲肾上腺素(NE,10~(-6)mol/L)或KCl(60mmol/L)预收缩血管环的张力变化,并利用PKC抑制剂和ROCK抑制剂等工具药观察对硝苯地平舒血管作用的影响并探讨可能机制。结果:系列浓度硝苯地平对基础状态血管环张力无明显影响,对NE和KCl预收缩的血管环具有浓度依赖性舒张作用(P 0. 05),去内皮组舒张作用与内皮完整组比较无明显差异。预孵PKC抑制剂星孢菌素(STA,10~(-8)mol/L)及激动剂佛波酯(PMA,10~(-7)mol/L)后,STA能增强硝苯地平对血管的舒张作用,而PMA能减弱硝苯地平对血管的舒张作用(P 0. 05);预孵ROCK抑制剂法舒地尔(fasudil,10~(-6)mol/L)及激动剂血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ,10-9mol/L)后,fasudil能增强硝苯地平对血管的舒张作用,而Ang-Ⅱ能减弱硝苯地平对血管的舒张作用(P 0. 05);钾通道阻滞剂BaCl_2(10~(-4)mol/L)、四乙胺(10~(-3)mol/L)、格列本脲(10~(-5)mol/L)和4-氨基吡啶(10~(-3)mol/L)对硝苯地平的舒张血管作用无明显影响。在无钙且含高浓度KCl的溶液中,硝苯地平可浓度依赖性地抑制累积浓度的CaCl_2对大鼠离体主动脉环的收缩作用(P 0. 05)。在无钙液中,硝苯地平对NE所引起的收缩无明显影响。结论:硝苯地平能够呈浓度依赖性地舒张大鼠主动脉,其舒张血管作用为非内皮依赖性,且与抑制细胞外钙内流密切相关,其舒张血管作用部分与抑制PKC和ROCK作用相关。     

Myosin light chain kinase is necessary for post-shock mesenteric lymph drainage enhancement of vascular reactivity and calcium sensitivity in hemorrhagic-shocked rats

Vascular hyporeactivity is an important factor in irreversible shock, and post-shock mesenteric lymph (PSML) blockade improves vascular reactivity after hemorrhagic shock. This study explored the possible involvement of myosin light chain kinase (MLCK) in PSML-mediated vascular hyporeactivity and calcium desensitization. Rats were divided into sham (n=12), shock (n=18), and shock+drainage (n=18) groups. A hemorrhagic shock model (40±2 mmHg, 3 h) was established in the shock and shock+drainage groups. PSML drainage was performed from 1 to 3 h from start of hypotension in shock+drainage rats. Levels of phospho-MLCK (p-MLCK) were determined in superior mesenteric artery (SMA) tissue, and the vascular reactivity to norepinephrine (NE) and sensitivity to Ca²⁺ were observed in SMA rings in an isolated organ perfusion system. p-MLCK was significantly decreased in the shock group compared with the sham group, but increased in the shock+drainage group compared with the shock group. Substance P (1 nM), an agonist of MLCK, significantly elevated the decreased contractile response of SMA rings to both NE and Ca²⁺ at various concentrations. Maximum contractility (E_max) in the shock group increased with NE (from 0.179±0.038 to 0.440±0.177 g/mg, P<0.05) and Ca²⁺ (from 0.515±0.043 to 0.646±0.096 g/mg, P<0.05). ML-7 (0.1 nM), an inhibitor of MLCK, reduced the increased vascular response to NE and Ca²⁺ at various concentrations in the shock+drainage group (from 0.744±0.187 to 0.570±0.143 g/mg in E_max for NE and from 0.729±0.037 to 0.645±0.056 g/mg in E_max for Ca²⁺, P<0.05). We conclude that MLCK is an important contributor to PSML drainage, enhancing vascular reactivity and calcium sensitivity in rats with hemorrhagic shock.     

缺血预处理对失血性休克大鼠血管反应性及钙敏感性的影响

目的：观察缺血预处理对失血性休克血管反应性和钙敏感性的影响。方法：通过观察不同缺血预处理方法对失血性休克大鼠存活时间和24 h存活率的影响,选择最适缺血预处理方法。在体实验,观察缺血预处理对失血性休克大鼠肠系膜上动脉（SMA）血管管径对去甲肾上腺素（NE）收缩反应性和NE升压反应的影响;离体实验,应用离体血管环张力测定技术,观察缺血预处理对失血性休克后大鼠SMA环血管反应性和钙敏感性的影响。结果：确定最适缺血预处理方法为：夹闭腹主动脉1 min,开放5 min,重复3次,2 h后复制失血性休克模型,这种方法可显著增加失血性休克大鼠的存活时间和24 h存活率。在体实验,缺血预处理可显著增加休克晚期NE的升压效应和在体SMA对NE的收缩反应（P<0.01）。离体实验,与失血性休克对照组比较,缺血预处理组SMA在休克早期(休克即刻)对NE的收缩反应性和钙敏感性明显下降（P<0.05）,但与正常对照组比较无显著差异（P>0.05）;在休克后期（休克2 h、3 h、4 h）,缺血预处理组SMA对NE的收缩反应性和钙敏感性显著增加（P<0.05）,且与正常对照组比较无显著差异（P>0.05）。结论：缺血预处理可能通过改善血管钙敏感性发挥对休克后期血管反应性的保护效应。     

Inhibition of the L-type calcium channel by the five muscarinic receptors (m1–m5) expressed in NIH 3T3 cells

 Modulation of L-type calcium channels by the five cloned muscarinic receptors was studied by expression of the receptors in NIH 3T3 cells. Application of acetylcholine (ACh) to cells transfected with m1–m5 resulted in a reduction in the L-type calcium current amplitude. Elevations in intracellular cAMP concentrations induced by 8-bromo-cAMP or forskolin resulted in no discernible change in the L-type calcium current. In addition, treatment with Rp-adenosine 3′,5′-cyclic monophosphothioate triethylamine (Rp-cAMPS), a protein kinase A (PKA) inhibitor, had no effect on the L-type currents. Conversely, application of phorbol dibutyrate, an activator of protein kinase C (PKC) or 8-bromo-cGMP, an activator of cGMP-dependent protein kinase (PKG), reduced the calcium currents. Incubation of the cells with KT5823, an inhibitor of PKG, resulted in a reduction of the response to 8-bromo-cGMP. The ACh-induced depression of L-type calcium current amplitude was sensitive to pertussis toxin (PTX) in cells transfected with the m2 or m4 receptor subtype. The m2-muscarinic-receptor-induced inhibition of the L-type calcium current was attenuated by preincubation of the cells with 8-bromo-cAMP and was unaffected by KT5823 or by calphostin C. The m1-muscarinic-receptor-induced inhibition of the L-type calcium conductance was insensitive to PTX treatment. However, the m1-induced response was blocked by preincubation of the cells with calphostin C. The present data indicate that the m2 (and possibly also the m4) muscarinic receptors inhibit the L-type calcium conductance by a reduction in cAMP concentration and that the m1 (and possibly also the m3 and m5) muscarinic receptors inhibit the L-type calcium channel via activation of PKC. Received: 2 September 1996 / Received after revision and accepted: 15 October 1996     

血管生成素1,2通过诱导型一氧化氮合酶调节失血性休克大鼠血管低反应性

目的:观察诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)调节失血性休克大鼠血管反应性双相变化中的作用。方法:采用WesternBlotting观察iNOS蛋白表达,同时采用离体微血管环张力测定技术检测血管反应性,以及细胞一氧化氮(NO)含量。结果:iNOS表达在失血性休克后逐渐增高;iNOS抑制剂可显著恢复缺氧4h的血管低反应性,抑制Ang-2进一步降低缺氧4h血管反应性的作用,去甲肾上腺素(NE)的最大收缩力(Emax)分别由5.875mN增高至8.937mN和由3.444mN增高至7.492mN(P<0.01);Ang-1,Tie-2、p38MAPK和Erk抑制剂可抑制缺氧4h的iNOS表达和增加NO生成(P<0.01)。结论:失血性休克晚期,Ang-1和Ang-2可通过p38MAPK和Erk调节iNOS蛋白表达,增加NO生成来调节血管低反应性。     

Cx40、43调节缺氧处理大鼠肠系膜上动脉收缩反应性的信号途径

目的： 研究连接蛋白（connexin,Cx)40或43对cAMP-PKA、cGMP-PKG和DG-PKC信号通路的影响及对缺氧处理大鼠肠系膜上动脉内膜依赖的血管收缩反应性的调节作用。方法: 以SD大鼠肠系膜上动脉（superior mesenteric artery,SMA）为研究对象,用Cx40或Cx43的反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxyribonucleotide,AODN）阻断SMA的Cx40或Cx43的表达,观察缺氧处理后血管的环一磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、环一磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)、二酰基甘油(diacylglycerol,DG)浓度和蛋白激酶A（protein kinase A,PKA)、蛋白激酶G（protein kinase G,PKG)、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC)活性的变化,以及这些变化与内膜依赖的血管收缩反应性变化的关系。结果: Cx40AODN可以降低血管cAMP、cGMP的浓度和PKA、PKG的活性,增加DG的浓度、PKC的活性和血管内膜依赖的收缩反应性;Cx43AODN可以增加血管cAMP、cGMP的浓度和PKA、PKG的活性,降低DG的浓度、PKC的活性和血管内膜依赖的收缩反应性。结论: Cx40、Cx43通过cAMP-PKA、cGMP-PKG、DG-PKC信号通路参与了休克后内膜依赖的血管收缩反应性的调节。