Notch3及Notch基因细胞内区在卵巢上皮性癌组织中的表达及DAPT对卵巢上皮性癌细胞的作用

目的 了解卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中Notch3及Notch基因细胞内区(NICD)蛋白的表达水平及其临床意义,探讨γ分泌酶抑制剂--氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT)对卵巢癌细胞系OVCAR3、A2780细胞的作用.方法 (1)选取2006年7月到2009年6月在北京大学第一医院因卵巢癌接受手术治疗且临床病理资料完整的患者共58例,选取同期因子宫肌瘤或子宫腺肌病及其他非卵巢病变行子宫全切除+双侧附件切除术者共21例作为对照,采用蛋白印迹法检测卵巢癌及正常卵巢组织中NICD蛋白的表达水平,免疫组化法检测卵巢癌及正常卵巢组织中Notch3蛋白的阳性表达率,并对不同临床病理特征的卵巢癌组织中NICD和Notch3蛋白表达进行比较.(2)体外培养卵巢癌OVCAR3、A2780细胞,加入不同浓度(分别为0.1、1、5、10μmol/L)的DAPT,设仅加溶剂二甲基亚砜(DMSO)者为空白对照,采用蛋白印迹法检测DAPT处理后卵巢癌OVCAR3、A2780细胞中NICD蛋白表达水平的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测卵巢癌细胞的生长情况,流式细胞仪检测细胞增殖指数(PI)、S期细胞比例(SPF)和细胞凋亡率的变化.结果 (1)卵巢癌、正常卵巢组织中Notch3蛋白的阳性表达率分别为78%(45/58)、24%(5/21),两者比较,差异有统计学意义(P<0.01).卵巢癌、正常卵巢组织中NICD蛋白的表达水平分别为1.64±0.19、0.98±0.20,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).卵巢癌组织中,NICD蛋白的表达水平,病理分化程度为低分化者(1.90±0.22)明显高于高～中分化者(1.25±0.21,P<0.05),手术病理分期为Ⅲ～Ⅳ期者(1.80±0.21)明显高于Ⅰ期者(1.21±0.15,P<0.05),而不同病理类型和是否行新辅助化疗间比较,差异则无统计学意义(P>0.05);Notch3蛋白的阳性表达率,不同病理类型、手术病理分期、病理分化程度及是否行新辅助化疗间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(2)DAPT(5 μmol/L)处理不同时间(分别为24、48、72 h)后,OVCAR3、A2780细胞中NICD蛋白的表达水平均明显低于空白对照(P<0.05).不同浓度(分别为0.1、1、5、10 μmol/L)的DAPT处理不同时间(分别为0、6、12、24、36、48、72 h)后,OVCAR3、A2780细胞的生长均明显受抑制,分别与空白对照比较,差异均有统计学意义(P<0.05).不同浓度(分别为0.1、1、5、10 μmol/L)的DAPT处理不同时间(分别为24、48、72 h)后,OVCAR3、A2780细胞的SPF、PI明显下降,细胞凋亡率明显升高,分别与空白对照比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且随着药物浓度的升高,出现这种作用的时间越早.结论 Notch3、NICD蛋白可能在卵巢癌的发生、发展中起一定的促进作用;DAPT能抑制卵巢癌细胞的增殖,促进卵巢癌细胞的凋亡,其机制可能与抑制NICD蛋白的生成有关.     

GPR30在宫颈癌细胞生长中的作用及其机制研究

目的:体外研究雌激素膜受体GPR30对宫颈癌细胞生长的影响及其作用机制。方法:选择宫颈腺癌HeLa和宫颈鳞癌SiHa细胞株,分别用GPR30特异性激动剂G1和拮抗剂G15处理宫颈癌细胞株。RT-PCR、Western blot法检测处理前后宫颈癌HeLa与SiHa细胞中GPR30、TLR3 mRNA及其蛋白表达变化;MTT法检测G1、G15及Poly I:C处理对宫颈癌细胞生长的影响。结果:(1)HeLa细胞中GPR30表达量高于SiHa细胞。G1处理后HeLa、SiHa细胞中GPR30 mRNA及其蛋白表达水平增高,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05;P0.05);G15处理后,HeLa、SiHa细胞中GPR30 mRNA及其蛋白表达水平降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05;P0.05)。(2)HeLa、SiHa细胞中TLR3 mRNA表达量分别为(0.5327±0.05373)、(0.3526±0.05774),蛋白表达量分别为(0.3572±0.097039)、(0.5002±0.09718)。G1能降低He La、Si Ha细胞中TLR3mRNA及其蛋白表达水平,G1 10-6mol/L处理组与对照组比较差异有统计学意义(P均0.05)。G15能增高HeLa、SiHa细胞中TLR3 mRNA及其蛋白表达水平,G15 10-5mol/L处理组与对照组比较,差异有统计学意义(P均0.05),与Poly I:C处理组比较差异无统计学意义(P0.05)。(3)10-6mmol/L、10-5mmol/L G1分别处理后,宫颈癌HeLa、SiHa细胞生长增殖率分别为(16.68±5.86)%、(26.67±3.25)%及(14.99±6.43)%、(22.72±1.77)%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P均0.05)。10-6mmol/L、10-5mmol/L G15分别处理后,宫颈癌HeLa、SiHa细胞的生长抑制率分别为(21.09±2.32)%、(22.99±3.15)%及(15.86±6.49)%、(19.18±2.61)%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P均0.05)。结论:宫颈癌细胞中存在雌激素膜受体GPR30表达,宫颈腺癌细胞中GPR30表达量高于宫颈鳞癌细胞,体外调节GPR30表达可影响宫颈癌细胞生长。抑制GPR30表达可通过上调TLR3表达而抑制宫颈癌细胞生长,GPR30可能成为宫颈癌治疗的新靶点。     

miR-617在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响

目的:探讨miR-617在宫颈癌组织中的表达及其过表达对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡、迁移等细胞生物学行为的影响。方法:采用实时定量PCR法检测宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织中miR-617表达。宫颈癌SiHa细胞中转染miR-617模拟物使其过表达,采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,平板克隆实验检测细胞克隆形成率,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot法检测靶基因C-末端结合蛋白1(Ct BP1)蛋白表达水平。结果:miR-617在宫颈鳞癌组织中表达下调,过表达miR-617可抑制宫颈癌SiHa细胞增殖,促进SiHa细胞凋亡,抑制SiHa细胞的克隆形成能力,抑制细胞的迁移,过表达miR-617可降低CtBP1蛋白表达。结论:miR-617在宫颈鳞癌中表达下调,可抑制SiHa细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制克隆形成和迁移,其作用机制可能与CtBP1蛋白下调有关。     

HeLa和SiHa细胞中Skp2、p27和C-myc的表达

目的:检测S期激酶相关蛋白2(Skp2)、C-myc、p27在宫颈癌HeLa及SiHa细胞系中的表达,明确这些指标在宫颈癌细胞系表达的意义。方法:通过细胞免疫组化、Westernblot、RT-PCR技术分析Skp2、p27和C-myc在蛋白和mRNA水平表达的差异。结果:免疫组化显示:He-La细胞中Skp2和C-myc表达强度高于SiHa细胞(P=0.032和P=0.026),而HeLa细胞中p27蛋白表达弱于SiHa细胞(P=0.035)。Westernblot显示:在HeLa细胞中Skp2和C-myc蛋白表达分别是SiHa细胞表达量的2.8倍和1.5倍;而SiHa细胞中的p27蛋白的表达水平是HeLa细胞中表达的2.7倍。RT-PCR结果显示:HeLa细胞中内源Skp2和C-myc的mRNA表达水平高于SiHa细胞(P=0.034和P=0.028),而SiHa细胞中的p27的mRNA表达水平高于HeLa细胞的表达水平(P=0.002)。结论:Skp2及C-myc在HeLa细胞中的表达水平高于SiHa细胞中的表达水平,而p27在HeLa细胞中的表达水平低于SiHa细胞中的表达水平。     

miR-186通过下调EGFR表达对宫颈癌细胞增殖与侵袭的影响

目的:探讨miR-186与EGFR在宫颈癌组织和细胞中的表达及作用机制。方法:RT-PCR与Western blot法分别检测30例宫颈癌组织与30例正常宫颈组织中miR-186与EGFR表达,分析其与宫颈癌临床病理之间的关系。增殖侵袭实验检测SiHa和HeLa细胞增殖与侵袭;双荧光素酶实验明确EGFR的3'-非翻译区(3'-UTR)是否为miR-186的直接靶点。结果:与正常宫颈组织比较,宫颈癌组织中miR-186呈低表达,EGFR呈高表达,两者均与宫颈癌分化程度、淋巴转移密切相关。宫颈癌组织中miR-186表达与EGFR表达均呈负相关(EGFR mRNA:R~2=0.865,P0.001;EGFR蛋白:R~2=0.832,P0.001)。上调miR-186表达能抑制SiHa和HeLa细胞的增殖与侵袭。双荧光素酶实验明确miR-186靶定了EGFR的3'UTR并影响了EGFR的蛋白表达。EGFR过表达逆转了miR-186抑制的细胞增殖和侵袭。结论:miR-186通过靶定EGFR的3'-UTR抑制EGFR表达进而抑制宫颈癌SiHa和HeLa细胞的增殖与侵袭。     

LONP1在SiHa细胞中的表达及临床意义

目的:探讨线粒体离子肽酶1(LONP1)在宫颈癌SiHa细胞中的表达及其对SiHa细胞增殖、迁移及线粒体功能的影响。方法:Western blot法检测宫颈癌SiHa细胞和正常宫颈上皮细胞中LONP1表达。通过小干扰RNA(siRNA)下调SiHa细胞中LONP1水平,分析其对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移及线粒体功能的影响。结果:宫颈癌SiHa细胞中LONP1表达较宫颈上皮细胞明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。降调LONP1表达后,SiHa细胞的增殖能力明显减弱,凋亡增加,迁移能力减弱,线体功能受到抑制(P0.05)。结论:下调SiHa细胞中LONP1表达可抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡,影响细胞的线粒体功能,从而参与宫颈癌的发展进程。     

nm23-H1基因表达对人宫颈癌细胞增殖的影响及与临床病理关系的研究

目的:探讨nm23-H1基因稳定表达对人宫颈细胞增殖能力的影响,及其表达与临床特点的关系。方法:用免疫组织化学法检测nm23-H1基因在宫颈癌组织的表达。将真核表达载体pcDNA3.1-nm23-H1转染入宫颈癌细胞系HeLa、SiHa,G418稳定筛选,用Western印迹法、免疫组化法鉴定转染前后细胞中nm23-H1基因的蛋白表达,噻唑蓝(MTT)法检测转染前后细胞体外增殖能力的变化。结果:在宫颈鳞癌组织中,nm23-H1基因阳性表达率随FIGO临床分期的升高有下降趋势,Ⅲ期nm23-H1阳性表达率明显低于Ⅱ期,Ⅱ期阳性表达率明显低于I期(P<0.01);分化程度高的组织阳性表达率显著高于分化程度低的组织(P<0.01);有淋巴结转移者其原发灶阳性表达率明显低于无淋巴结转移者(P<0.01)。宫颈腺癌组织中nm23-H1基因阳性表达率与FIGO临床分期,分化程度,淋巴结转移均无明显的相关性(P>0.05)。在pcDNA3.1-nm23-H1转染组中,Si-Ha、HeLa细胞nm23-H1蛋白表达水平明显增加,未转染组和空载体对照组未见nm23-H1高表达。MTT法所绘生长曲线显示,SiHa-nm23(转染组)细胞与SiHa-3.1(空载体组)、SiHa(空白组)细胞比较,生长速度明显抑制,差异均有统计学意义(P<0.01),而HeLa(空白组)、HeLa-nm23(转染组)、HeLa-3.1(空载体组)三组细胞生长速度均无明显变化(P>0.05)。结论:nm23-H1参与了宫颈鳞癌的发生、发展过程,是判断宫颈鳞癌淋巴结转移和预后的重要标志物,而nm23-H1基因对不同宫颈癌细胞体外增殖能力的影响有明显差异。     

ERBB3表达下调对宫颈癌细胞增殖迁移和侵袭的影响

目的探讨erb-b2受体酪氨酸激酶3(ERBB3)在调节癌细胞的迁移和侵袭及其在宫颈癌的发生和进展过程中的作用。方法收集2014年4月—2016年12月期间在本院接受治疗的25例宫颈鳞状细胞癌患者和25例宫颈腺癌患者。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了宫颈鳞状细胞癌和子宫颈腺癌患者体内肿瘤组织和癌旁组织中ERBB3 mRNA的表达水平。用siRNA转染宫颈鳞状细胞癌细胞沉默ERBB3的表达后,应用Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移和侵袭能力,利用CCK-8检测细胞增殖,应用Western blotting检测MTK-1蛋白的表达变化。结果宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌患者癌组织中ERBB3 mRNA水平均低于其正常组织(P=0.00,P=0.00)。HPV感染对ERBB3蛋白在宫颈鳞状细胞癌细胞系的表达水平为10.30±0.07(HPV阳性)、7.99±0.75(HPV阴性)和正常宫颈细胞系中的的表达水平为3.02±0.47(HPV阳性)、3.16±0.22(HPV阴性),差异均无统计学意义(P均0.05)。ERBB3 si RNA沉默后宫颈鳞状细胞癌细胞SiHa和C33A的增殖(0.20±0.10,0.16±0.08)、迁移(64.87±0.26,55.02±0.06)和侵袭(49.99±0.06,62.80±0.19)能力显著低于正常宫颈细胞系中SiHa和C33A的增殖(0.86±0.49,0.60±0.34)、迁移(99.99±0.31,100.07±0.23)和侵袭(99.89±0.35,99.89±0.14)能力,差异具有统计学意义(P0.05)。ERBB3通过si RNA沉默后MTK-1蛋白的表达水平也显着降低。结论 ERBB3的下调很可能通过抑制MTK-1的表达来抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,从而抑制肿瘤的发展。     

信号诱导增殖相关蛋白1和16、18型人乳头瘤病毒E6蛋白在宫颈癌中的表达及临床意义

目的:探讨信号诱导增殖相关蛋白1(SIPA1)和16、18型人乳头瘤病毒E6蛋白(HPV16/18E6)在宫颈癌中的表达及其与临床病理之间的关系。方法:Western blot检测宫颈癌C33A、HT3、SiHa、HeLa和CaSki细胞株中HPV16/18E6和SIPA1蛋白表达;免疫组织化学Envi-sion法检测正常宫颈组织(40例)和宫颈癌组织(174例)石蜡标本中HPV16/18E6和SIPA1蛋白;分析SIPA1和HPV16/18E6相互之间及其与宫颈癌盆腔淋巴结转移之间的关系。结果:宫颈癌细胞系中SIPA1与HPV16/18E6表达呈负相关。SIPA1在正常宫颈组织和宫颈癌组织中阳性率分别为87.5%和58.6%,差异有高度统计学意义(χ2=11.78,P=0.001);SIPA1蛋白在有和无盆腔淋巴结转移时阳性率分别为19.0%和71.2%,差异有高度统计学意义(χ2=21.45,P=0.000),且SIPA1阴性者发生淋巴结转移风险高于阳性者(OR=5.011,95%CI2.311～10.866,P<0.01)。HPV16/18E6在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的阳性率分别为30.0%和79....     

EXOSC4对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制

目的:探讨EXOSC4在调节宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭方面的作用及机制。方法:通过GEPIA在线数据库分析EXOSC4在宫颈癌中的表达及预后情况,Western blot法检测人宫颈癌细胞株中EXOSC4的表达,设计合成靶向EXOSC4的特异性shRNA,构建稳定低表达EXOSC4的宫颈癌细胞株。Western blot和荧光定量PCR验证干扰效率;CCK-8和细胞克隆形成实验检测各组HeLa细胞的增殖能力;采用流式细胞仪检测细细胞周期;采用细胞划痕和Transwell实验检测HeLa细胞的迁移和侵袭能力,Western blot法检测EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)和Wnt/β-catenin通路相关蛋白(β-catenin、c-Myc、cyclin D1)的表达水平。结果:宫颈癌组织中EXOSC4表达明显高于正常组织,EXOSC4高表达提示预后不良。与HCC94和SiHa细胞系相比,EXOSC4在HeLa细胞中表达量最高。抑制EXOSC4表达可显著降低宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,细胞周期阻滞在G_0/G_1期,上调E-cadherin表达,下调N-cadherin、Vimentin、β-catenin、c-myc和Cyclin-D1表达(均P0.05)。结论:沉默EXOSC4可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭。     

γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系作用的研究

目的:研究γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系以及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的作用,探讨DAPT临床治疗宫颈癌的可行性。方法:体外培养宫颈癌Siha、HeLa细胞系和HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系(CRL2614)。加入不同浓度的γ-分泌酶抑制剂DAPT,不同时间点终止细胞生长,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色方法检测细胞生长情况;使用流式细胞计数仪检测细胞增殖周期中增殖指数(PI)、S期细胞比例(SPF)和凋亡细胞百分比。结果:应用MTT法检测细胞生长情况,5μmol/L及10μmol/LDAPT作用宫颈癌细胞系72h,可显著抑制其生长(P均0.05)。10μmol/LDAPT对CRL2614细胞系作用72h无抑制作用(P0.05)。流式细胞计数仪检测细胞增殖周期及细胞凋亡百分比。用5μmol/L及10μmol/LDAPT作用宫颈癌细胞系24,48,72h均可见SPF、PI明显降低,凋亡细胞百分比明显增加(P均0.05)。10μmol/LDAPT作用CRL2614细胞系72h对SPF、PI及凋亡细胞百分比无影响(P0.05)。结论:DAPT能抑制宫颈癌HeLa、Siha细胞系增殖,促进肿瘤细胞凋亡,对HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的增殖和凋亡没有明显影响。DAPT可能为药物治疗宫颈癌提供新思路。     

NS-398对宫颈癌细胞系的增殖抑制作用及对survivin基因表达的影响

目的:研究选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对宫颈癌HeLa,SiHa细胞系的增殖、凋亡作用及其对凋亡抑制基因survivin表达的影响。方法:体外培养宫颈癌HeLa,SiHa细胞系,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析不同浓度的NS-398分别作用于HeLa,SiHa细胞系24h、48h后对细胞增殖的作用;流式细胞仪(FCM)检测对细胞凋亡的作用;RT-PCR分析对凋亡抑制基因survivin表达的影响。结果:MTT检测显示,NS-398可抑制宫颈癌HeLa,SiHa细胞系增殖,并有浓度时间依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测提示,NS-398可诱导HeLa,SiHa细胞系凋亡,有浓度依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR分析表明,NS-398可抑制HeLa,SiHa细胞系凋亡抑制基因survivinmRNA表达,与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:NS-398可抑制宫颈癌HeLa,SiHa细胞增殖,诱导凋亡,其机制与抑制凋亡抑制基因survivin mRNA表达有关,为宫颈癌治疗提供了新的靶点和理论依据。     

Netrin-1在HeLa细胞的表达及对HeLa细胞功能的影响

目的:研究Netrin-1在HeLa细胞的表达及对HeLa细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法:利用蛋白质印迹法检测Netrin-1在HeLa细胞的表达,并通过MTT、侵袭实验和流式细胞仪分别检测10,50和100ng/mlNetrin-1对HeLa细胞增殖能力、侵袭能力和凋亡的影响。结果:(1)Netrin-1在HeLa细胞有表达,其相对表达量为0.389±0.026;(2)MTT实验结果显示,Netrin-1可以促进HeLa细胞增值,表现为时间和剂量依赖性,与对照组有显著差异(P<0.05或P≤0.01);(3)Netrin-1处理组细胞迁移数分别为314±16,487±15和553±19,均明显多于对照组180±10(P均<0.05);(4)在Netrin-1干预下,HeLa细胞凋亡率呈递减趋势,与对照组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)。结论:HeLa细胞表达的Netrin-1与宫颈癌的侵袭转移有关,Netrin-1促进HeLa细胞增殖和侵袭能力,并抑制HeLa细胞凋亡,可能为未来宫颈癌的治疗提供依据。     

MicroRNA-150通过下调MUC4抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭

目的探讨microRNA-150(miR-150)与宫颈癌细胞生物学功能的相关性。方法收集宫颈癌/癌旁配对样本23例,培养宫颈癌细胞系SiHa细胞、HeLa细胞、miR-150 mimics干预细胞。生物信息学分析,确定miR-150靶标,双荧光素酶报告基因检测进行验证;RT-qPCR及Western blot检测miR-150、MUC4表达;CCK-8检测细胞增殖;AO-PI染色后荧光倒置显微镜下,观察细胞自噬;Transwell检测细胞迁移。结果在宫颈癌组织及SiHa、HeLa细胞中,miR-150表达显著下调,MUC4表达显著上调;荧光素酶报告基因检测证实MUC4是miR-150的直接靶标;miR-150过表达后MUC4表达显著降低,SiHa细胞增殖、迁移侵袭能力显著降低,且细胞凋亡增加;miR-150过表达与细胞自噬相关。结论miR-150可能通过下调MUC4表达抑制宫颈癌细胞的恶性生长和侵袭行为,这可能为宫颈癌的诊断和治疗策略提供新方法。     

PinlsiRNA对宫颈癌细胞SiHa增殖和凋亡的影响

目的：通过小干扰RNA（siRNA）栽体介导抑制肽基脯氨酰同分异构酶（Pinl）表达,探讨Pinl对宫颈癌细胞SiHa增殖与凋亡的影响。方法：构建pGPU6／GFP／Neo—PinlsiRNA表达载体,脂质体介导将其转染至宫颈癌细胞SiHa中;实验设3组：实验组（SiHa／pGPU6-PinlsiRNA组）、阴性对照组（SiHa／pGPU6-con组）和空白对照组（Si-Ha）。采用RT—PCR、Western blot法检测Pinl的表达;M1Tr法检测细胞增殖活性;原位末端标记法（TUNEL）和流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡。结果：转染SiHa／pGPU6．PinlsiRNA的SiHa细胞中,PinlmRNA和蛋白表达分别下调68．1％和54．8％,细胞增殖显著抑制。TUNEL显示典型细胞凋亡特征,SiHa／pGPU6-PinlsiRNA组的凋亡指数（AI）为（29．6±14．58）％,显著高于SiHa／pGPU6-con组[（8．44±5．65）％]和空白对照组[（5．34±4．47）％]（P〈O．05）。SiHa／pGPU6．PinlsiRNA组的细胞凋亡率为（30．95±16．47）％,显著高于SiHa／pGPU6-COIl组[（6．18±6．10）％]和空白对照组[（5．95±4．99）％]（P〈0．05）。结论：RNA干扰技术能特异高效的抑制Pinl基因的表达,Pinl基因的下调能抑制宫颈癌细胞增殖并促进细胞凋亡,提示Pinl可能成为治疗宫颈癌的新靶点。     

一氧化氮与HPV感染的关系及其对子宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨一氧化氮(NO)与HPV感染的关系及其对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响.方法 选择2009年12月1日至2010年8月5日在复旦大学附属妇产科医院宫颈疾病诊疗中心行阴道镜检查的患者115例,应用HPV分型检测试剂盒(可检测21种HPV亚型)进行HPV分型,同时应用Griss法间接检测官颈局部NO含量.在体外培养的宫颈腺癌细胞株HeLa细胞和宫颈鳞癌细胞株Caski细胞中,加入不同浓度(终浓度分别为0.125、0.25、0.5 、1.0及2.0 mmol/L)NO供体--硝普钠(SNP)后培养24 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并应用荧光定量逆转录PCR技术及蛋白印迹法检测SNP处理后细胞中HPVE6、E7 mRNA的表达及p53蛋白的表达.结果 (1)115例患者中,宫颈HPV感染93例,其中高危型50例,低危型43例;无HPV感染22例.115例患者的宫颈局部均检测到NO,其中高危型HPV感染患者的宫颈局部NO含量为(47.6±1.4)μmol/L,低危型HPV感染者为(24.1±1.2)μmol/L,无HPV感染者为(22.8±0.3)μmol/L,高危型HPV感染者高于低危型HPV感染者和无HPV感染者,差异有统计学意义(P＜0.05);而低危型HPV感染者与无HPV感染者比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(2)不同浓度(0.125、0.25、0.5 1.0及2.0 mmol/L)SNP处理HeLa、Caski细胞24 h后,能抑制细胞生长、促进细胞凋亡,当SNP浓度≥1.0 mmol/L时,与SNP处理前比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).1.0 mmol/L的SNP处理24h后,HeLa细胞中HPV18 F6、E7 mRNA的表达水平(分别为19.181±0.360、17.571±0.010)明显低于SNP处理前(分别为27.362±0.191、22.962±0.053;P＜0.05),p53蛋白的表达水平(1.17±0.03)明显高于SNP处理前(0.23±0.05;P＜0.05);但Caski细胞中HPV16E6、E7mRNA和P53蛋白的表达在SNP处理前、后无明显变化(P＞0.05).结论 宫颈局部微环境中NO含量增加与感染高危型HPV有一定的相关性;SNP能抑制宫颈癌细胞的生长,促进其凋亡,降低HPV18 E6、E7 mRNA的表达及活化p53蛋白,其机制可能是宫颈腺癌细胞株HeLa细胞对SNP更敏感.NO释放增加可能是官颈局部微环境清除HPV的免疫机制之一.

Abstract：

Objective To study the relationship between nitric oxide within cervical microenvironment and different HPV types as well as the effect of sodium nitroprusside( SNP), a nitric oxide donor, on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cell lines. Methods HPV typing test was assessed from 115 women by using high-risk HPV (HR-HPV) 21 typing test and the release of cervical nitric oxide(NO) was assessed as nitrate, nitrite in cervical fluid. Cervical NO was then compared between women showing different HPV types. Proliferation of Caski and HeLa cervical cells was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, cell apoptosis was detected by flow cytometry after 24 hours treated by different final concentration of SNP (0. 125,0. 25,0. 5,1.0 and 2. 0 mmol/L, respectively). The expressions of HPV E6,E7 gene mRNA and p53 protein were detected by SYBR Green Ⅰ quantitative real-time PCR and western blot. Results ( 1 ) The cervical NO release of women with HR-HPV was higher compared to that in HPV negative women [ (47. 6 ± 1.4) μmol/L vs ( 22. 8 ± 0. 3 ) μmol/L; P ＜ 0. 05 ]; but there was no statistical difference between low-risk HPV (LR-HPV) group [ (24. 1 ± 1.2 ) μmol/L] and control group (P ＞0. 05 ). (2)After 24 hours treated by different final concentration of SNP, the results shown that SNP could inhibited the proliferation and increased apoptosis rate in Caski and HeLa cells, in which the concentration of SNP ≥ 1.0 mmol/L , there were significantly different ( P ＜ 0. 05 ), while when SNP ≥2. 0mmol/L, the proliferation of cells inhibited seriously. Treated by SNP ( 1.0 mmol/L ) 24 hours, the expressions of HPV18 E6, E7 mRNA in HeLa cells were reduced from 27. 362 ±0. 191,22. 962 ±0. 053 to19. 181 ±0. 360, 17. 571 ±0. 010 and the protein expression of p53 increased from 1. 17 ±0. 03 to 0. 23 ±0. 05, there were statistically significant differences between adding SNP group and the control group ( P ＜0. 05); but there were no statistically significant differences in HPV16 E6, E7 mRNA and that of p53 in Caski cells( P ＞ 0. 05 ). Conclusions The presence of HR-HPV is associated with an increased release of NO in the human uterine cervix; NO could inhibit the growth and proliferation and enhance the apoptosis of cervical cancer cells, inhibit the expression of HPV18 E6, E7 mRNA in HeLa cells and activate the expression of p53 protein, the mechanism may be due to higher sensitivity of HeLa cells (cervical adenocarcinoma cell) to SNP. The increasing release of NO may play a role in regulating the elimination of HPV in cervical microenvironment, which is a part of mucous membrane immunity.     

CASC19调控miR-449b-5p表达对子宫颈癌细胞增殖、凋亡和辐射敏感性的影响

目的探讨癌易感性候选基因19(CASC19)调控微小RNA-449b-5p(miR-449b-5p)的表达后对子宫颈癌细胞增殖、凋亡和辐射敏感性的影响。方法(1)培养子宫颈癌细胞系HeLa细胞,予不同剂量(分别为0、2、4、6、8 Gy)的X线照射,实时荧光定量PCR技术检测HeLa细胞中CASC19 mRNA和miR-449b-5p的表达水平。(2)不同条件处理后HeLa细胞增殖、凋亡、辐射敏感性及其相关蛋白表达的检测,其中,不同处理条件包括沉默CASC19表达、过度表达miR-449b-5p、下调miR-449b-5p并沉默CASC19表达,相关蛋白包括细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase-3)和组蛋白变异体H2AX(γ-H2AX);采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,细胞克隆形成实验检测细胞的辐射敏感性(以存活分数表示)。(3)采用双荧光素酶报告基因实验(结果以荧光素酶活性表示)和实时荧光定量PCR技术验证CASC19和miR-449b-5p之间的靶向调控关系。结果(1)随着X线照射剂量(0、2、4、6、8 Gy)的增加,HeLa细胞中CASC19 mRNA的表达水平逐渐升高(F=502.681,P=0.000),miR-449b-5p的表达水平逐渐降低(F=202.936,P=0.000)。(2)沉默CASC19表达、过度表达miR-449b-5p后,HeLa细胞的存活率显著降低(P<0.05),凋亡率显著升高(P<0.05),存活分数显著降低(P<0.05),cyclin D1蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),cleaved-caspase-3和γ-H2AX蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);下调miR-449b-5p并沉默CASC19表达后,HeLa细胞的存活率显著升高(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.05),存活分数显著升高(P<0.05),cyclin D1、γ-H2AX蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),cleaved-caspase-3的表达水平显著降低(P<0.05)。(3)与对照比较,过度表达miR-449b-5p可显著降低CASC19基因野生型HeLa细胞的荧光素酶活性(分别为1.00±0.09、0.37±0.05,P<0.01),而对CASC19基因突变型HeLa细胞的荧光素酶活性无显著影响(分别为0.92±0.07、0.94±0.05,P>0.05)。与对照比较,沉默CASC19表达后HeLa细胞中miR-449b-5p的表达水平显著升高(分别为1.00±0.12、4.84±0.49,P<0.05),过度表达CASC19后HeLa细胞中miR-449b-5p的表达水平显著降低(分别为1.00±0.09、0.38±0.04,P<0.05)。结论HeLa细胞中CASC19可负调控miR-449b-5p的表达,下调miR-449b-5p表达可部分逆转沉默CASC19对HeLa细胞增殖、凋亡及辐射敏感性的影响。     

Sensitivity to Fas-mediated apoptosis in high-risk HPV-positive human cervical cancer cells: relationship with Fas, caspase-8, and Bid

OBJECTIVE: Binding of Fas ligand or agonistic anti-Fas antibody to the death receptor Fas can activate a caspase-cascade resulting in apoptosis. In the present study, the functionality of the Fas pathway was studied in human cervical cancer cells with different HPV and p53 status. METHODS: HeLa (HPV-18 positive), CaSki, and SiHa (both HPV-16 positive) contain wild-type p53, while C33A (HPV negative) expresses mutant p53. Fas cell surface expression was determined by flow cytometry. Expression of proteins involved in the apoptotic pathway was analyzed by Western blotting and apoptosis was measured by acridine orange staining of nuclear chromatin. RESULTS: Despite high Fas membrane expression in the HPV-positive cells, CaSki was highly sensitive, HeLa slightly sensitive, and SiHa and C33A were resistant for agonistic anti-Fas antibody. Almost undetectable Fas membrane levels can explain the non-responsiveness of C33A for anti-Fas. Although interferon-gamma (IFNgamma) strongly and cisplatin to a lesser extend enhanced Fas membrane expression in all HPV-positive cells, sensitization to anti-Fas by IFNgamma or cisplatin was only observed in HeLa. Analysis of the Fas apoptotic pathway showed that anti-Fas treatment induced caspase-8 activation and concomitantly Bid cleavage, caspase-9 and caspase-3 activation, PARP cleavage and apoptosis in HeLa and CaSki. IFNgamma plus anti-Fas treatment, in contrast to anti-Fas alone, facilitated caspase-8 activation in HeLa and SiHa, while an increase in Bid cleavage, caspase-9 activation and apoptosis was only observed in HeLa. Apoptotic failure in SiHa (even in the presence of IFNgamma) was probably due to low caspase-8, almost undetectable Bid protein levels and therefore lack of caspase-9 activation. CONCLUSION: Sensitivity to anti-Fas depends on Fas, caspase-8, and Bid protein levels in cervical cancer cells. Additionally, IFNgamma and cisplatin can increase sensitivity to anti-Fas in a subset of HPV-positive cervical cancer cell lines by upregulation of Fas and caspase-8 expression without major changes in p53 levels.