CD20嵌合抗体的构建、表达及纯化的实验研究

目的构建CD20嵌合抗体,检测其活性并纯化该嵌合抗体。方法从杂交瘤细胞株中分别扩增抗鼠CD20抗体的轻链和重链基因的可变区,并与人的轻链和重链恒定区连接,分别克隆到pTY5真核表达载体,然后共转染293E细胞,通过RT-PCR检测mRNA的转录,夹心ELISA检测抗体表达量,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合特异性。结果正确扩增得到抗CD20人鼠嵌合抗体的轻链和重链基因片段并成功构建重组真核表达载体pTY5-CD20H和pTY5-CD20L,在293E细胞中进行瞬时表达,RT-PCR显示抗体基因在细胞中进行了成功的转录,ELISA测定抗体表达量在15～24 ng/mL之间,流式检测结果证实细胞上清分泌的抗CD20嵌合抗体可与NS-1细胞株结合,并通过protein A柱亲和层析获取高纯度的抗CD20嵌合抗体。结论成功构建表达抗CD20嵌合抗体的载体,且表达的抗体具有结合活性,为下一步研究慢性荨麻疹的发病机制及治疗打下基础。     

静脉注射和厚朴酚的药代动力学及组织分布研究

和厚朴酚为中药厚朴中分离的带有烯丙基的连苯二酚类化合物,该化合物具有中枢抑制、肌松、抗血小板凝集和抗菌等药理活性.我们对静脉注射和厚朴酚的药代动力学进行了研究并首次揭示了该药物在大鼠组织中的分布规律.现将研究结果报道如下.     

CD30、CD195在Graves病病人131I治疗前后的表达及短期预后相关性研究

目的：本实验拟通过测定GD病人131I治疗前后外周血辅助性T淋巴细胞膜表面CD30、CD195的表达,探讨GD病人Th1/Th2平衡机制变化及其可能的临床意义。方法：选择40例GD病人和40例健康对照组为研究对象,应用流式细胞术检测GD病人131 I治疗前及治疗后6mo的外周血淋巴细胞膜表面CD195、CD30的变化以及临床症状和甲状腺功能。结果：（1）GD病人治疗前CD195显著低于健康对照组（P〈0.05）；CD30高于健康对照组,CD195/CD30低于健康对照组（P〈0.01）。（2）GD病人131I治疗后6mo 34例甲亢缓解。治疗后缓解组CD195上升,CD30下降,与治疗前比较有统计学意义（P〈0.05）；CD195/CD30上升,较治疗前变化显著（P〈0.01）。结论：（1）GD的发病机理与病人外周血T淋巴细胞膜中Th 1/Th 2平衡变化机制有关。（2）GD病人131I治疗缓解组Th细胞膜表面CD195、CD30及其比值的变化有助于更好的研究GD的发生机制及对疾病短期预后的判断。     

兔脂肪垫滑膜间充质干细胞分离、纯化及诱导定向分化研究

目的探讨兔脂肪垫滑膜间充质干细胞(SMSCs)的分离、培养、生物学特性及其定向分化的能力。方法采用兔脂肪垫组织块培养法分离原代SMSCs,有限稀释法纯化和扩增SMSCs,观察SMSCs形态学特点;CCK8法测定第2代及第4代SMSCs增殖能力;Alcian Blue、碱性磷酸酶,以及油红"O"染色法观察第4代SMSCs在定向诱导液中向成软骨、成骨、成脂肪细胞的分化能力。结果脂肪垫滑膜组织经组织块培养2~3d见SMSCs生长,12~14d可获大量SMSCs,纯化传代后细胞形态均一;第2、4代SMSCs细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05);SMSCs经诱导可向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞定向分化。结论关节内脂肪垫滑膜组织采用组织块培养法能有效地分离出SMSCs,其间充质干细胞具有多向诱导分化潜能。更多还原     

恙虫病东方体56kD表达抗原基因片段的、表达及纯化抗原在恙虫抗体检测中的应用

目的：构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因（sta56)片段的重组表达质粒，在E.coli中表达Sta56重组抗原，重组抗原纯化后应用于间接法ELISA，金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体，方法：从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板，扩增出不同长度的截短的sta56片段，定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，化大肠杆菌DH5a或BL21（DE3），IPTG诱导表达，应用SDS－PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western blot分析重组抗原的活性；采用电洗脱，亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板，用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG，或以胶体金标记重组抗原，运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体，结果：（1）从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF，并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO－sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342，各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS－PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白，Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。（3）电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。（4）纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG，与间接免疫荧光法IFAT比较，其敏感性和特异性分别91．7％和76．5％。（5）纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法，可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较，其检测IgG的敏感性和特异性分别为94．2％和84．2％，结论：恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG，适用于大规模的流行病学调查，以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体，具有简便，快速的特点，适于在缺乏实验条件的基层医院，农村对门诊病人进行诊断。     

CD30、CD195 在Graves 病病人131 I 治疗前后的表达及短期预后相关性研究

目的: 本实验拟通过测定GD 病人¹³¹ I 治疗前后外周血辅助性T 淋巴细胞膜表面CD30、CD195 的表
达，探讨GD 病人Th1 /Th2 平衡机制变化及其可能的临床意义。方法: 选择40 例GD 病人和40 例健康对照组为
研究对象，应用流式细胞术检测GD 病人¹³¹ I治疗前及治疗后6mo 的外周血淋巴细胞膜表面CD195、CD30 的变
化以及临床症状和甲状腺功能。结果: ( 1) GD 病人治疗前CD195 显著低于健康对照组( P＜0． 05) ; CD30 高于健
康对照组，CD195 /CD30 低于健康对照组( P＜0． 01) 。( 2) GD 病人131 I 治疗后6mo 34 例甲亢缓解。治疗后缓解
组CD195 上升，CD30 下降，与治疗前比较有统计学意义( P＜0． 05) ; CD195 /CD30 上升，较治疗前变化显著( P
＜0． 01) 。结论: ( 1) GD 的发病机理与病人外周血T 淋巴细胞膜中Th 1 /Th 2 平衡变化机制有关。( 2) GD 病
人¹³¹ I治疗缓解组Th 细胞膜表面CD195、CD30 及其比值的变化有助于更好的研究GD 的发生机制及对疾病短
期预后的判断。     

盐酸万乃洛韦缓释胶囊的动物药代动力学及相对生物利用度研究

盐酸万乃洛韦(valaciclovir hydrochloride)是阿昔洛韦的前体药,即阿昔洛韦的L-缬氨酸酯盐酸盐.其对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)的抑制作用强,对水痘疱疹病毒、EB病毒以及巨细胞病毒的抑制作用弱.     

消渴通痹颗粒对糖尿病周围神经病变大鼠IL-1β、TNF-α及CD54的影响

目的:探讨消渴通痹颗粒对糖尿病周围神经病变大鼠IL-1β、TNF-α及CD54的影响。方法:采用STZ诱发糖尿病大鼠模型,用不同剂量的消渴通痹颗粒灌胃,并与弥可保对照,2月后观察各组大鼠血清IL-1β、TNF-α及CD54的变化。结果:不同剂量的消渴通痹颗粒均能降低糖尿病周围神经病变大鼠TNF-α及CD54(P<0.05,P<0.01)。结论:消渴通痹颗粒可通过干预糖尿病炎症反应因子,减轻或改善糖尿病周围神经损伤。     

恙虫病东方体56 kD表面抗原基因片段的克隆、表达及纯化抗原在恙虫病抗体检测中的应用

目的　构建恙虫病东方体 5 6 k D表面抗原基因 (sta5 6 )片段的重组表达质粒 ,在 E.coli中表达 Sta5 6重组抗原 ,重组抗原纯化后应用于间接法 EL ISA、金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体特异性抗体。　方法　从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出 sta5 6基因的 ORF及其中长 10 5 3bp的大片段 ,用 TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板 ,扩增出不同长度的截短的 sta5 6片段 ,定向插入p PROEX HTb及 p ET30 a载体 ,转化大肠杆菌 DH 5α或BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,应用 SDS- PAGE观察重组蛋白表达情况 ,应用 Western blot分析重组抗原的活性 ;采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯 96孔板 ,用于间接法 EL ISA检测恙虫病东方体 Ig G,或以胶体金标记重组抗原 ,运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体 Ig M和 Ig G抗体。　结果　 (1)从恙虫病东方体 Karp株基因组中扩增出含 sta5 6基因的 ORF,并成功构建含 sta5 6 ORF大片段的重组质粒 TOPO- sta5 6。(2 )以截短的 sta5 6基因片段构建重组表达质粒 p HTb Ot95 7、p HTb O4 98、 p HTb Ot342和 p ETOt95 7、 p ETOt4 98、p ETOt342 ,各重组子均可在 E.coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS- PAGE显示各表示重组子     

实验性家兔新月体性肾小球肾炎的免疫组化、光镜及电镜研究

应用自制羊抗兔肾毒血清,经静脉1次注射免疫家兔,成功地复制了抗基底膜型新月体性肾小球肾炎模型。通过免疫组化、组织学及透射电镜技术,动态观察了细胞性新月体形成的过程。结果表明,细胞性新月体主要由球囊壁层上皮细胞及巨噬细胞构成,其间杂有少量纤维素、中性白细胞及淋巴细胞。对新月体形成的机理进行了讨论。     

大鼠胰岛细胞的分离纯化及培养

目的　探讨大鼠胰岛细胞分离纯化和培养的方法。方法　采用胰导管逆行灌注Hanks液分离成年大鼠胰岛,Ⅴ型胶原酶消化,不连续密度梯度Ficoll 4 0 0纯化胰岛。用台盼蓝和双硫腙染色检测胰岛活性和纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛功能。结果　胰岛细胞的收获量为5 4 0±15 0个胰岛 胰腺,活性>90 % ,纯度>90 % ,高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激的2倍多。结论　胰导管灌注Hanks液,Ⅴ型胶原酶消化和不连续密度梯度葡聚糖纯化胰岛,可以获取数量多,活性和纯度好的胰岛     

利用硝酸银处理的硅胶色谱方法分离和提纯中药有效成分的思考

【目的】探讨了AgNO3-双键配合物的实验规律及原理。【方法】收集并整理经AgNO3处理的硅胶色谱柱分离的挥发油中含双键的混合物;通过分离纯化中药半边旗中的抗癌有效成分以及用银离子络合法从油脂中分离花生四烯酸等,从中找出规律,并用配位化学理论分析其原理。【结果】分离和纯化结果比较满意。【结论】AgNO3-配合物的稳定性规律是：当无空间障碍时,双键个数越多,络合越牢;环外双键比环内双键络合得牢;顺式比反式络合得牢;末端双键比顺式络合得牢;多重苯环芳烃的配合物比单环芳烃络合得牢。这些规律可以指导结构和理化性质相近、用普通色谱法或萃取法难以分离的双键化合物的分离和纯化。     

成年猪胰岛的分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对成年猪胰岛的分离效果.方法采用胶原酶胰导管注射负荷技术,静止消化与物理消化相结合消化分离成年猪胰腺脾叶;不连续密度梯度比重离心纯化,胰岛素释放试验检测胰岛细胞功能.结果胰岛收获量为8339±2305胰岛数/g胰腺,纯化后胰岛数/g胰腺为4367±1876,纯度为85%,胰岛素释放反应良好.结论采用本方法消化分离成年猪胰岛,胰岛细胞产量、纯度较高,功能良好.     

蛇床子中喔斯脑、欧芹属素乙的提取分离及鉴定

从蛇床果实的乙醇提取物中经柱层析、薄板层析、高效液相层析证明有八种成分,已测定其中喔斯脑(Qsthol,欧芹酚—7—甲醚)及欧芹属素乙(imperatonin)为主要成分,并分离得到单体,其它六种化合物因含量少,未进一步进行分离。     

RBX诱骨活性成分的分离与纯化

目的　重组合异种骨 (RBX)作为一种新型植骨材料在临床治疗骨缺损、骨不连等病例中取得了显著疗效 .需进一步研究重组合异种骨中诱骨活性蛋白的相对分子质量范围 .方法　采用肝素亲和层析技术纯化 RBX中诱骨活性蛋白即骨形态发生蛋白 (BMP) ,利用小鼠肌袋实验检测其骨诱导活性 ,再用聚丙烯酰胺电泳 (SDS- PAGE)测量 RBX中诱骨活性蛋白纯化后的相对分子质量 .结果　在纯化近 2 0倍后 ,获得 8.2 3m g高度纯化的蛋白质 ,组织学观察其活性发现植入小鼠股部第 10日 ,有大量软骨细胞及软骨岛的出现 ,在局部区域还可见到条索状骨小梁出现 ,SDS- PAGE电泳发现这种蛋白质的相对分子质量为 35× 10 3,经还原后单体的相对分子质量为 2 2× 10 3.结论　重组合异种骨 (RBX)中 35× 10 3的蛋白质经还原后为 2 2× 10 3,其单独使用具有异位成骨活性 ,为 RBX的临床应用提供了理论依据 .     

人血浆前白蛋白的分离和纯化

建立一种新的分离纯化人血浆前白蛋白（ＰＡ）的方法。由酚试剂沉淀后的血浆，通过离子交换树脂分离所得ＰＡ，用高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ）进行纯化，经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其分子量在５５０００左右，纯度达到电泳纯和免疫纯。此法步骤简单，用血量少，适用于实验室常规操作和临床人体研究。     

当归多糖的分离、纯化及分析鉴定

目的　从新鲜中国当归 [Angelica sinensis(Oliv)Diels]中分离纯化出多个多糖组分 ,并对其理化性质进行分析鉴定 .方法　采用水煮—乙醇沉淀法从新鲜当归中提取当归总多糖 AP- 0 ;AP- 0用 80 g· kg- 1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀得到当归多糖亚组分 AP- 1;CTAB处理后的上清用 10 g· kg- 1 H3BO3,2 mol· L- 1 Na OH处理得到当归多糖亚组分 AP- 2 ;所剩上清 ,用乙酸处理后 ,再用乙醇沉淀 ,得到当归多糖亚组分 AP- 3.总糖含量测定采用改良苯酚 -硫酸法 ;蛋白质含量测定采用 Serva Blue- G染料结合法 ;糖醛酸含量测定采用间羟基连苯法 .采用新华中速滤纸纸色谱和硅胶G薄层色谱分析多糖各组分的单糖组成 .高效凝胶过滤色谱和高效离子交换色谱分析多糖各组分的 Mr分布和电荷性质 .红外光谱法分析多糖各组分的糖苷键构成 .结果　 AP- 0总糖 970 g· kg- 1 ,其中糖醛酸 2 10 g· kg- 1 ,蛋白质 30g·kg- 1 ;AP- 1总糖 970 g· kg- 1 ,其中糖醛酸 172 g· kg- 1 ,蛋白质 30 g· kg- 1 ;AP- 2总糖 830 g· kg- 1 ,其中糖醛酸 2 5 7g·kg- 1 ,蛋白质 170 g· kg- 1 ;AP- 3总糖 970 g· kg- 1 ,其中糖醛酸 86 g· kg- 1 ,蛋白质 30 g· kg- 1 .AP- 0 ,AP- 1,AP- 2和 AP- 3主要由葡萄糖 ,阿拉伯糖和少量糖醛酸     

猪肝细胞的Gerlach分离法

目的 :探讨猪肝细胞分离收获率、存活率。方法 :取本地杂种小猪作为肝细胞供体 ,采用Gerlach五步胶原酶灌流法分离猪肝细胞 ,血细胞计数板计数细胞产量 ,TrypanBlue拒染法计算细胞活率。结果 :每只猪肝平均可获得 (12 .2 2± 1.5 7)× 10 9个肝细胞 ,平均活力为 95 .4 %± 2 .4 1%。结论 :采用Gerlach五步胶原酶灌流法分离猪肝细胞 ,获得较高产量和活力的游离肝细胞     

肉苁蓉水溶性多糖的分离纯化及分析

目的:从肉苁蓉药材中提取、分离、纯化肉苁蓉多糖,并对其进行分析.方法:采用95%乙醇脱脂、水提醇沉得粗多糖,Sephadex柱层析精制多糖;用薄层层析鉴定其单糖组成,测定其比旋光度和紫外光谱对多糖的纯度进行鉴定.结果:该多糖的紫外光谱只有单一峰位、其不同浓度乙醇的沉淀物比旋光度一致.结论:用此方法分离纯化的多糖为均一组分.     

闽产木立芦荟多糖的分离纯化及初步分析

目的 分离纯化及初步分析产木立芦荟中的多糖。方法 芦荟经沸水提取,醇沉,Sevage法去除蛋白质,Sephadex G-200柱色谱分离纯化,制得闽产木立芦荟多糖,以硫酸－苯酚法测定其总糖含量。结果 闽产木立芦荟多糖经紫外吸收光谱扫描具有多糖特征吸收峰,未见核酸和蛋白质吸收峰,多糖含量可达89．7％,初步分析由D－甘露糖和D－葡萄糖等单糖组成。结论 从闽产木立芦荟中可提取分离纯度较高的杂多糖。