重组DNA甲基化酶1表达质粒对结肠癌细胞相关基因表达的影响

目的 分析DNA甲基化酶1(DNMT1)基因的真核表达质粒对人结肠癌细胞肿瘤相关基因的表达影响。方法 分别构建并转染含有人正义和反义DNMT1的真核表达质粒入结肠癌SW1116细胞，PCR和限制性内切酶证实转染结果，以Western印迹法分析各组细胞DNMT1蛋白的表达情况。定量PCR检测hMLH1、hMSH2及c—myc、p16^INK4A基因的表达。结果 经G418筛选得到稳定转染DNMT1基因的结肠癌细胞系，且分别在该转染有正义和反义质粒的细胞系中，DNMT1蛋白表达上调和下调。同时发现转染正义DNMT1的细胞中hMLH1、hMSH2及c—myc的表达降低，而转染反义DNMT1的细胞中hMSH2的表达明显增强。各组细胞p16^INK4A基因的表达差异不明显。结论 DNMT1基因调控人结肠癌细胞中肿瘤相关基因的表达。     

HIV-1感染对T淋巴细胞p16INK4A基因甲基化及其表达的影响

目的；p16^INK4A基因在与AIDS相关的疾病中的表达缺陷，DNA甲基化可使基因转录下调。本研究观察人类免疫缺陷病毒I型（HIV－1）感染对T淋巴细胞的p16^INK4A基因的表达影响及其途径。方法：建立感染有野生型和突变体HIV－1病毒的T淋巴细胞Hut78细胞系，以RT－PCR、定量PCR和Western blotting检测细胞感染后不同时间的DNA甲基化酶（DNMT）1、3a和3b的mRNA（提高40％以上）和蛋白质水平；并由甲基化特异PCR（MSP）了解p16^INK4A基因甲基化改变，及通过RT－PCR研究该基因的mRNA表达情况。结果：无论野生型抑或突变体HIV－1感染，都能使Hut78细胞中DNMT1表达增强，DNMT3a和DNMT3b无明显变化。HIV－1感染可引起p16^INK4A基因启动子区甲基化水平提高和基因转录水平下调。结论；HIV－1感染可使p16^INK4A甲基化水平升高和表达降低，且与该病毒有无复制无关。     

STAT3及相关生长调控基因在胃癌组织中的表达及意义

目的探讨转录信号传导子与激活子3（STAT3）及相关生长调控基因在胃癌发生发展中的作用及意义。方法应用RT—PCR检测STAT3基因及相关基因c—myc，p53，生存素（survivin），血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA表达水平，应用Western印迹法及免疫组化法检测STAT3基因的蛋白水平及定位表达。结果胃癌组织及癌旁组织中STAT3 mRNA的表达均明显高于正常胃组织（P〈0．01），胃癌及癌旁组织中c—myc，surovivin，VEGF mRNA的表达上调（P〈0．01），p53 mRNA的表达下调（P〈0．01），胃癌组织及癌旁组织中STAT3蛋白水平的表达均高于正常胃组织（P〈0．01）。结论STAT3基因的持续激活在胃癌的发生发展中起重要作用，可作为早期诊断的指标及治疗的靶点。     

丁酸钠对小鼠大肠癌的防治作用及其对甲基化酶的影响

目的通过观察丁酸钠（NaBu）对二甲肼（DMH）诱发小鼠大肠癌的防治作用及其对抑癌基因p21^WAF1甲基化酶的影响，探讨乙酰化酶抑制剂防治肿瘤的分子机制。方法80只S-ICR小鼠随机均分4组：空白对照组、DMH造模组、NaBu对照组、DMH＋NaBu组。记录小鼠一般情况，分别于造模后18周、20周、22周每组处死小鼠2只，24周时全部处死。大体及镜下观察肠道肿瘤发生情况和组织学变化，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测p21^WAF1 mRNA表达，定量PCR检测Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b基因的表达。结果NaBu对小鼠无毒副作用；DMH＋NaBu组小鼠大肠癌发生率（25％）较DMH造模组（95％）明显降低（P〈0．05），肿瘤大小和数目亦显著低于造模组，且大肠癌的病理进展慢。DMH造模组肿瘤组织中较正常对照组甲基化酶水平升高3～4倍，抑癌基因p21^WAF1低表达；与造模组比较NaB组p21^WAF1表达增加，并伴有甲基化酶Dnmt1和Dnmt 3b mRNA降低（P〈0．05）。结论NaBu对DMH诱发的小鼠大肠癌具有一定防治作用，这与激活抑癌基因p21^WAF1表达、降低甲基化酶Dnmtl和Dnmt3b表达有关。     

肿瘤相关基因启动子甲基化在非小细胞肺癌细胞株中的作用研究

目的探讨基因甲基化在肺癌发生中的作用。方法南京医科大学附属南京第一医院呼吸科、复旦大学附属中山医院肺科和上海市肿瘤研究所于2004年10月至2005年12月应用甲基化特异性的多聚酶链反应（MSP）和RT—PCR检测甲基化的发生和mRNA的转录水平。结果肺癌细胞株A549部分甲基化的靶点包括p16^INK4a、p73、RASSF1a和CDH1等，完全甲基化的靶点包括MGMT、CDH13等；SH-77部分甲基化的靶点包括p16^INK4a、p73、WT1和CDH1等，完全甲基化的靶点包括RASSF1a和MGMT；SPC—A1部分甲基化的靶点包括p16^INK4a、p73、CDH1、MYOD1和CDH13等，完全甲基化的靶点包括WT1和RAR—β。RASSF1a、WT1、MYOD1、MGMT和RAR—β等5个基因发生甲基化的细胞株其mRNA的转录水平均低于未发生甲基化的细胞株甚至完全不转录。结论NSCLC细胞株中抑癌基因经常发生启动子CpG岛的甲基化，并且甲基化可能与抑癌基因mRNA转录水平下降相关。     

胃癌组织中MGMT基因甲基化与DNMT1蛋白表达的关系

背景:研究表明MGMT基因启动子区甲基化与包括胃癌在内的多种恶性肿瘤密切相关。DNA甲基转移酶1(DNMT1)在多种肿瘤组织中的表达上调。但目前关于胃癌组织中MGMT基因甲基化状态与DNMT1表达关系的研究少见。目的:探讨MGMT基因甲基化、DNMT1蛋白表达与胃癌的关系。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测60例胃腺癌组织及其相应癌旁组织中MGMT基因启动子区甲基化状态,RT-PCR、免疫组化法分别检测MGMT、DNMT1 mRNA和蛋白表达。结果:胃癌组织中MGMT基因启动子区甲基化率明显高于癌旁组织(45.0%对13.3%,P0.001)。胃癌组织中MGMT mRNA阳性表达率显著低于癌旁组织(41.7%对93.3%,P0.001),而DNMT1 mRNA阳性率明显升高(76.7%对18.3%,P0.001)。MGMT mRNA阴性表达的胃癌组织中其基因启动子甲基化率较阳性表达者升高(57.1%对28.0%,P0.05)。胃癌组织中MGMT蛋白表达与DNMT1蛋白表达呈负相关(r=-0.795,P0.01)。结论:MGMT基因启动子区高甲基化和DNMT1高表达可能与胃癌的发生、发展有关。DNMT1可能调控MGMT基因的甲基化过程。     

胃癌组织中肿瘤相关基因甲基化及其表达与叶酸和代谢酶MTHFR基因多态性的关系

目的:探讨人胃癌组织中癌基c-myc,抑癌基因p16INK4A,p21WAF1,错配修复基NhMLH1和hM2SH2的甲基化状态及其表达与叶酸、MTHFR基因多态性的关系．方法:胃癌38例手术切除标本的癌区、癌旁和外周正常黏膜组织,运用FOL ACS:180自动化学发光系统测定叶酸含量,PCR-RFLP技术检测MTHFR基因677(C→T)和1298(A→C)两个常见多态,并分别以Real—time RT-PCR和甲基化特异性PCR (MSP)技术检测肿瘤相关基因的表达和甲基化状态．结果:c-myc表达升高,p16INK4A,hMLH1和hMSH2表达降低的胃癌黏膜组织其基因启动子区异常甲基化．p21WAF1,hMSH2表达降低, p16INK4A高甲基化者叶酸水平明显降低,c-myc低甲基化和表达升高者中均存在低叶酸水平．MTHFR 677CC基因型的胃癌黏膜组织p16INK4A甲基化升高且表达降低,而其余肿瘤相关基因的甲基化及其表达与MTHFR两个常见多态均无明显相关性．结论:DNA甲基化在胃癌的发生、发展中具有重要作用,叶酸水平和MTHFR基因多态性通过影响部分肿瘤相关基因的甲基化状态而调控其表达．     

甲基化修饰对人胃癌细胞系中多种基因的调控

背景：甲基化紊乱与胃癌的发生有关，近年来甲基化已成为肿瘤研究的热点。目的：探讨在DNA甲基转移酶抑制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dC)的化学干预下，不同分化胃癌细胞系的抑癌基因、癌基因和与凋亡相关的基因与甲基化调控的关系，并辅以流式细胞仪检测细胞周期的变化。方法：培养高分化、中分化和未分化胃癌细胞系MKN-45、MKN-28和HGC-27，分别以不同浓度的5-aza-dC干预细胞。提取细胞的RNA，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测p16^INK4A、p21%WAF1、p73、c-myc、c-Ha-ras、survivin和死亡相关蛋白激酶(DAP-kinase)等多种基因的表达情况；同时以流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果：抑癌基因中，MKN-45和HGC-27细胞中有p16^INK4A表达，用5-aza-dC干预后其表达增强，MKN-45细胞的p16^INK4A在5-aza-dC 10μmol／L 24h、2μmol／L72h和5μmol／L 72h组表达增强，HGC-27细胞的p16^INK4A在5μmol／L24h和10μmol／L 24h组表达也有明显增强；p21^WAP1、p73无明显变化。癌基因中c-myc、c-Ha-ras变化不明显。与凋亡相关的基因中，MKN-45细胞的survivin在5-aza-dC处理后表达增强，但HGC-27细胞的DAP-kinase无明显变化。结论：在不同分化的人胃癌细胞系中，甲基化修饰对抑癌基因、癌基因以及与凋亡相关基因的调控有明显差异。p16^INK4A基因在MKN-45和HGC-27细胞中、survivin基因在MKN-45细胞中的表达受DNA甲基化调控，在MKN-28细胞中则无表达。     

CDX2与DNMT1 mRNA在胃癌组织中的表达及临床意义

目的:研究尾型同源盒转录因子2(CDX2)mRNA和DNA甲基化转移酶1(DNMT1)mRNA在胃癌组织中的表达,探讨其临床意义.方法:应用实时定量PCR(qRT-PCR)检测60例患者胃癌与相应远癌胃组织中CDX2与DNMT 1mRNA的表达,并分析其与胃癌临床病理特征的关系以及两者表达的相关性.结果:CDX2和DNMT1 mRNA在远癌胃组织中表达较低,在胃癌组织中表达显著升高;CDX2 mRNA的表达与胃癌的Lauren分型、临床TNM分期和淋巴结转移等因素有关(P<0.05),而DNMT1 mRNA的表达与分化程度、临床TNM分期和淋巴结转移等因素有关(P<0.05).两者在胃癌中的表达呈明显负相关(r=-0.385,P<0.05).结论:胃癌组织中CDX2表达下调与病情进展有关,DNMT1可能参与该过程的调控.     

Expression of mRNA for DNA methyltransferases and methyl-CpG-binding proteins and DNA methylation status on CpG islands and pericentromeric satellite regions during human hepatocarcinogenesis

To evaluate the significance of alterations in DNA methylation during human hepatocarcinogenesis, we examined levels of mRNA for DNA methyltransferases and methyl-CpG-binding proteins and the DNA methylation status in 67 hepatocellular carcinomas (HCCs). The average level of mRNA for DNMT1 and DNMT3a was significantly higher in noncancerous liver tissues showing chronic hepatitis or cirrhosis than in histologically normal liver tissues, and was even higher in HCCs. Significant overexpression of DNMT3b and reduced expression of DNMT2 were observed in HCCs compared with the corresponding noncancerous liver tissues. DNA hypermethylation on CpG islands of the p16 (8% and 66%) and hMLH1 (0% and 0%) genes and methylated in tumor (MINT) 1 (6% and 34%), 2 (24% and 58%), 12 (21% and 33%), 25 (0% and 5%), and 31 (0% and 23%) clones, and DNA hypomethylation on satellites 2 and 3 (18% and 67%), were detected in noncancerous liver tissues and HCCs, respectively. There was no significant correlation between the expression level of any DNA methyltransferase and DNA methylation status. Reduced expression of DNA repair protein, MBD4, was significantly correlated with poorer tumor differentiation and involvement of portal vein. Slightly reduced expression of MBD2 was detected in HCCs, and the expression of MeCP2 was particularly reduced in HCCs with portal vein involvement. These data suggest that overexpression of DNMT1 and DNMT3a, DNA hypermethylation on CpG islands, and DNA hypomethylation on pericentromeric satellite regions are early events during hepatocarcinogenesis, and that reduced expression of MBD4 may play a role in malignant progression of HCC.