荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA的流行病学特点

目的了解结核分枝杆菌DNA定量检测的流行病学特点。方法用荧光定量聚合酶链反应技术对438例结核疑似患者进行结核分枝杆菌DNA检测,比较不同标本类型、不同年份、不同性别的感染情况。结果结核分枝杆菌总阳性率为10.27%,晨尿和痰液阳性率较高,分别为20.72%、15.79%;男性和女性阳性率分别为10.39%和8.70%;>31岁年龄组人群结核分枝杆菌感染者所占比例最高,为71.10%;2009、2010年阳性检出率分别为10.81%和10.00%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论结核分枝杆菌DNA在银川地区男女两性间的流行特点相同,2009年和2010年感染率较为稳定。     

荧光PCR检测尿中结核分枝杆菌的价值

目的:利用荧光PCR技术检测尿中分枝杆菌。方法:用ROCHE公司生产的Light Cycler免疫荧光仪检测我院门诊及住院患者尿液中结核杆菌。结果:25例肾结核尿中TB-PCR均检出阳性,而非结核患者无1例检出尿TB-PCR阳性。结论:荧光PCR技术检测尿中结核杆菌阳性率高、特异性高,对临床肾结核及泌尿系结核的诊断且有无可代替的重要作用。     

检测结核分枝杆菌四种方法的比较

对我院结核病防治所收治的 2 16例肺结核病人分别采用痰涂片法、培养法、ＰＣＲ法进行检验 ,并对检测结果进行分析 ,报告如下。1　材料和方法1 1　观察对象　 2 16例肺结核患者系 1997年 1月至 1999年 12月本院结防所确诊病人 ,其中男 147人 ,女 6 9人。1 2　标本采集　分别留取晨痰、 2 4ｈ痰液和静脉血 2ｍｌ。1 3　仪器和试剂　ＰＥ480型ＤＮＡ扩增仪 ;结核杆菌ＰＣＲ试剂盒 (华美公司 ) ;分枝杆菌培养基 (中科院植物生理研究所 )。1 4　方法　痰涂片法、培养法、ＰＣＲ等方法按常规或试剂说明书进行。2　结果2 1　四种检验方法结果见表…     

应用聚合酶链反应检测胸水中结核分枝杆菌DNA

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测１２８例胸水中结核分枝杆菌ＤＮＡ，并将涂片镜检和分离培养作为参比方法。试验结果显示：ＰＣＲ直接检测胸水中结核分枝杆菌的灵敏为３１个菌体单位，敏感性为４２．３％，特异性为９６．８％，高于涂片镜检和分离培养的检出率（３８．２％和３５．１％）。该法具有敏感性高，特异性强和简便快速等优点，特别适合含微量结构分枝菌临床标本的检测，可用于结核性胸膜炎早期和鉴别诊断。     

肺结核患者外周血白细胞中结核分枝杆菌DNA的检测

明确外周血白细胞中结核分枝杆菌ＤＮＡ检测在肺结核诊断中的意义。应用聚合酶反应技术，对９５例肺结核患者外周血标本、８４例肺结核患者痰标本进行了结核分枝杆菌ＤＮＡ检测。     

用通用引物PCR检测HBV DNA的研究

本文设计一对ＨＢＶ亚型通用的ＰＣＲ引物,用于检测血清ＨＢＶ ＤＮＡ。ＰＣＲ扩增后,产物经２％琼脂糖凝胶电泳分析与ＥＩＡ法有较高的阳性符合率。阳性扩增条带单一清晰,扩增产物的分子量可靠,可测出８０ｆｇ／ｍｌ的微量ＨＢＶ ＤＮＡ。本法准确、敏感,可用于临床常规检测ＨＢＶ ＤＮＡ。     

新型二聚体突变荧光引物定量PCR方法的建立及其在检测HCV中的应用

目的 开发新型二聚体突变荧光引物技术,建立一种能广泛应用于临床检测HCv的实时PCR方法.方法 构建重组质粒pMD18-T-HCV 5′NCR作为标准品,设计二聚体突变荧光引物,优化定量PCR体系,并进行方法学评价.将本法应用于临床确诊的30份HCV阳性患者、30份其他病毒性肝炎患者和30份健康志愿者血清标本的检测,定量结果与商品化TaqMan HCv定量试剂盒的定量结果进行比较.结果 建立了利用二聚体突变荧光引物的实时PCR方法,检测的线性范围为20～109IU/ml;批内CV在1.37%～4.59%之间,批间CV在1.58%～4.81%之间;对所有其他病毒性肝炎患者和健康志愿者血清HCV的检测结果均阴性,检测特异性为100%(60/60);对临床确诊的HCV感染患者血清标本全部检出HCV阳性,定量结果与商品化TaqMan HCV定量试剂盒的定量结果具有很好的相关性,相关系数R2=0.9501.结论 建立的以二聚体突变荧光引物为平台的HCV实时PCR检测方法,具有快速、价廉、准确、结果可靠等特点,可为HCV感染的诊断、治疗监测和流行病学调查提供较好的技术支持.     

分子信标荧光探针检测结核分枝杆菌的临床应用

目的:探讨分子信标荧光探针检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:应用设置内参照的分子信标荧光探针检测178例肺结核标本,并与痰涂片和培养结果进行比较。结果:肺结核组分子信标荧光探针阳性率显著高于痰涂片和培养,检出率分别为56.2%(100/178),34.8%(62/178)、34.8%(62/178)。结论:分子信标荧光探针具有较高的灵敏度和特异度,对结核病的辅助诊断有一定的临床意义。     

结核分枝杆菌检测方法临床应用的对比研究

目的用涂片、聚合酶链反应(PCR)法检测结核分枝杆菌,探讨其临床应用价值。方法对169例临床确诊的肺结核患者、可疑肺结核患者和非结核患者痰标本用涂片、PCR两种方法进行检测,对结果进行对比分析。结果 169例痰标本中,痰涂片检查阳性率为7.1%(12/169),PCR检测阳性率为32.54%(55/169);痰涂片、PCR法检测42例临床确诊的肺结核患者痰标本阳性率分别为11.9%(5/42)、57.1%(24/42);检测82例临床可疑肺结核患者痰标本阳性率分别为8.54%(7/82)、37.8%(31/82)。比较两种方法的阳性检测率,差异有统计学意义(χ2=19.729,P<0.01),检测45例非结核患者痰标本,涂片及PCR检测均为阴性。结论 PCR法检测结核分枝杆菌具有较高的敏感性和特异性,可作为临床结核病检测诊断的有效方法之一。     

PCR—微孔板反向杂交法在结核分枝杆菌检测中的应用

目的　评价PCR 微孔板反向杂交法检测临床标本中结核分枝杆菌 (MTB)的应用价值。方法　应用集菌涂片镜检法、培养法、PCR法、PCR 微孔板反向杂交法分别对 5 5份肺结核病患者和 30份非结核呼吸系统病患者痰标本平行检测。结果　涂片法对结核病患者临床标本中MTB检出率为 2 1.82 % ,培养法检出率为2 5 .4 6 % ,PCR法检出率 36 .36 % ,PCR 微孔板反向杂交法检出率 4 7.2 7%。对 30例非结核呼吸系统疾病患者检测MTB ,PCR法出现 2例假阳性 ,其余 3种方法均阴性 ,PCR 微孔板反向杂交法比单纯PCR法灵敏度高、特异性强。结论　PCR 微孔板反向杂交法具有简便、快速、抗污染、灵敏度高、特异性强的优点 ,缺点是存在假阴性 ,应改进标本前处理方法 ,在对结核病的辅助诊断中应与细菌学方法相结合 ,以提高检出率     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应（PCR）方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白（hilA）基因、变形杆菌溶血素（hpmA）基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用PrimerPremier5．0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401bp、256bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16（4^3）正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为：94．07pg沙门菌DNA,140．85ng变形杆菌DNA,1．41ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4h培养后样品的最低检测限度分别为：沙门菌10^0菌落形成单位（CFU）／mL、变形杆菌10^1CFU／mL、金黄色葡萄球菌10^0CFU／mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白(hilA)基因、变形杆菌溶血素(hpmA)基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用Primer Premier 5.0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401 bp、256 bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为:94.07 pg沙门菌DNA,140.85 ng变形杆菌DNA,1.41 ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4 h培养后样品的最低检测限度分别为:沙门菌100菌落形成单位(CFU)/mL、变形杆菌101CFU/mL、金黄色葡萄球菌100CFU/mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

基于芯片点样技术的RT-PCR平台建立及其在HCV、HIV-1快速检测中的应用

目的：建立基于芯片点样技术的荧光定量PCR（RT‐PCR）平台并将其用于HIV‐1和HCVRNA载量的检测。方法选择HIV‐1和HCV的保守区域设计引物,制备基因芯片管,建立RT‐PCR测定HIV‐1和HCV的反应体系,利用溶解曲线区分病毒种类。对该方法的灵敏度和特异度进行评价,并用临床标本验证其检测性能。结果该方法的特异度较好,其检测HCV、HIV‐1的最低检测限为1×103copy/mL,对RNA载量为1×103～1×106copy/mL的临床标本能准确检测。结论该方法为检测HCV、HIV‐1提供了新思路。     

副溶血弧菌TaqMan双重实时-聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立副溶血弧菌TaqMan实时-PCR和毒力基因TaqMan双重实时-PCR筛检的实验室检测方法。方法根据副溶血弧菌ItoxR/I基因的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测副溶血弧菌的实时-PCR方法;根据副溶血弧菌耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin, Itdh/I）和耐热相关溶血素（thermostable related hemolysin, Itrh/I）基因的保守序列设计引物和探针,建立检测致病性副溶血弧菌毒力基因的双重TaqMan实时-PCR方法。对所建立的副溶血弧菌实时-PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。结果副溶血弧菌的检测下限为10sup2/sup拷贝/l,Itdh/I和Itrh/I双重实时PCR的检测下限为10sup2/sup拷贝/l。针对ItoxR/I基因建立的副溶血弧菌实时-PCR方法对11种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增。结论建立的方法能够特异和敏感地检测副溶血弧菌,并能确定致病性副溶血弧菌的毒力基因,能作为副溶血弧菌的灵敏和快速检测方法。     

布鲁菌PCR快速检测方法的建立及应用

目的建立布鲁菌聚合酶链反应(PCR)方法,对其进行应用评价。方法针对布鲁菌外膜蛋白编码基因(omp-2)设计PCR引物,建立PCR方法,利用19种常见细菌和布鲁菌株DNA分别对其进行特异性和敏感度评价,对3株疑似布鲁菌株进行核酸检测,并与分离培养法进行结果比对。结果本研究建立的布鲁菌PCR检测方法仅能检出布鲁菌阳性菌株,对照菌DNA未出现目的条带;敏感度为100拷贝/反应;PCR方法对3株疑似布鲁菌株检出omp-2基因条带,鉴定结果为布鲁菌,与分离培养法结果相同。结论本研究建立了一种布鲁菌PCR检测方法,与分离培养法相比,布鲁菌PCR方法准确、快速,适合布鲁菌病疫情的快速检测。     

实时荧光聚合酶链反应熔解曲线检测人类白细胞抗原 B27方法建立及评价

目的：构建并评价实时荧光聚合酶链反应(PCR)熔解曲线法检测人类白细胞抗原-B27(HLA-B27)。方法通过采用本研究所构建的实时荧光 PCR 熔解曲线法和微量淋巴细胞毒法、实时荧光定量 PCR 法检测81例标本,并对3种方法进行评价。结果实时荧光 PCR 熔解曲线法与实时荧光定量 PCR 的敏感度和特异度均达到93.8%、90.9%,明显优于微量淋巴细胞毒法的敏感度56.2%和特异度81.8%。结论实时荧光 PCR 熔解曲线法具有很好的敏感度和特异度,具有较好的临床适应性。     

单引物二次PCR法对重组质粒中HBV前C-C基因进行点突变的研究

目的建立单引物二次PCR法对重组质粒中HBV前C-C基因进行4处点突变，并与传统环状突变法进行对比。方法将变异点合成在一对互补引物中，先加入单条引物行PCR扩增，再以产物为模板，加入另一单条引物行PCR扩增。PCR产物加入DpnⅠ酶，切除其中变异前的模板质粒，转化入大肠埃希菌DH5α，卡那霉素培养基筛选阳性菌落增菌测序。结果对该质粒而言，采用单引物二次PCR法预期位点均发生变异，成功率高于传统环状突变法。4个变异后质粒与模板条带位置基本一致，4个质粒的拟变异位点均如预期变异成功，而其他氨基酸无变异。结论单引物二次PCR法进行重组质粒基因突变较传统环状突变法成功率有所提高。     

CYP2C19基因多态性荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立检测人细胞色素氧化酶2C19(CYP2C19)基因多态性的荧光定量PCR检测方法。方法用Primer Premier5.0和Primer Express 3.0软件针对人CYP2C19基因681和636多态性位点分别设计1对引物和2条Taq Man-MGB探针,优化建立荧光PCR反应体系。评价该方法的准确性、灵敏度和重复性。用该方法检测300例临床样本,并用测序法进行验证。结果建立CYP2C19基因681和636位点荧光PCR检测方法,灵敏度为每个反应2 ng/g DNA。300例临床样本检测结果与测序法一致性为100%。结论建立的CYP2C19基因多态性荧光PCR检测法准确性较高、灵敏度和重复性较好,适于临床实验研究。     

实时荧光定量PCR检测DHX32 mRNA方法的建立及初步应用

目的建立实时荧光定量PCR(FQ-RT-PCR)检测DHX32 mRNA的方法并研究其在结直肠癌中的表达。方法用Taq-Man探针建立检测DHX32 mRNA的FQ-RT-PCR方法,评价其特异性、重复性及扩增效率,并用该法检测DHX32 mRNA在结直肠癌中的表达水平。结果批内变异系数1.1%～1.9%,批间变异系数1.2%～2.5%;扩增效率为0.85,相关系数为0.9990。癌组织DHX32 mRNA表达水平中位数为1.90×10-3(四分位间距5.47×10-3),明显高于癌旁组织0.09×10-3(四分位间距1.41×10-3),两者差异有统计学意义(P<0.05)。DHX32 mRNA表达水平与结直肠癌癌栓形成、淋巴结转移、组织学分级以及Dukes分期关系密切(P<0.05)。肿瘤的恶性程度越高,DHX32 mRNA表达水平越高。结论FQ-RT-PCR检测DHX32 mRNA的方法特异性好,重复性高,操作简单,无污染。DHX32 mRNA表达上调可能在结直肠癌发生、发展中起重要作用,其表达水平可作为结直肠癌恶性程度的评价指标。