以羊膜为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的 以羊膜为载体培养角膜内皮细胞并形成单层组织，为以后内皮细胞层移植提供方法和材料来源。方法 胰酶消化去除羊膜上皮细胞，保留其底膜作为载体，种植兔角膜内皮细胞，体外培养形成单层内皮层，并进行形态，组织学，超微结构观察。结果 角膜内皮细胞在羊膜上黏附生长并增殖，体外培养6-7d即融合成单层，其形态及生长密度优于单纯培养皿上培养的内皮细胞。复合角膜内皮组织由羊膜基底膜和单层扁平内皮细胞组成，与生理状态下的角膜内皮组织相近。结论 以羊膜为载体培养角膜内皮细胞可形成单层细胞层，有望成为角膜内皮移植良好的材料来源。     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

兔血管内皮细胞对角膜后弹力层代谢的影响

目的:检测移植后生长于角膜内皮面的自体血管内皮细胞对角膜后弹力层代谢的影响.方法:家兔26只随机分成3组:实验组10只,将培养的自体血管内皮细胞移植到无后弹力层的角膜内皮面;实验对照组10只,移植无角膜内皮层的自体植片;空白对照组6只,移植带角膜内皮细胞的自体植片,术后观察3组角膜植片的水肿变化.术后15d,取下各组角膜植片做病理切片HE染色观察各组植片的角膜后弹力层变化及其上的细胞分布情况.结果:实验组角膜植片的内皮面长满培养的自体血管内皮细胞.病理切片显示,生长的细胞呈单层分布,内皮面未见明显的后弹力膜样物质形成;实验对照组角膜植片高度增厚,内皮面无细胞生长和后弹力膜样物质形成;空白对照组角膜植片内皮面可见明显的后弹力层,其上可见单层细胞分布.结论:血管内皮细胞具有一定的角膜内皮细胞样功能,但不能产生角膜后弹力层样物质.     

角膜后弹力膜内皮移植术研究进展

角膜后弹力膜内皮移植术由于具有相对较低的移植排斥率以及较好的视力预后等优势,目前已成为部分发达国家治疗角膜内皮失代偿的主流手术方式,但限于手术难度较高,学习曲线较长,中国人前房偏浅,加之国内角膜内皮病变往往合并有其他较复杂的眼部疾病,目前国内尚未普遍开展这一手术。本文就角膜后弹力膜内皮移植术的手术适应证、供体植片制备(...     

家兔角膜内皮细胞的快速培养

目的:短期内体外扩增获得角膜内皮细胞。方法:采用揭膜法与消化法相结合获取原代角膜内皮细胞。并采用本实验室自行研制的角膜内皮细胞培养体系,在24孔培养板中分别以1×106,5×105,1×105,5×104,1×104,5×103细胞/孔浓度传代培养细胞,观察细胞的生长情况。结果:以1×105～5×105个细胞/孔浓度的细胞悬液并添加消化后的Descemet膜原代培养细胞,4d后细胞形成与在体细胞相似的密集单层,可以快速获取纯化的角膜内皮细胞。传代培养时,虽然不同接种浓度在4d的细胞增殖倍数差异不显著,但以1×105～5×105个细胞/孔的浓度传代,3d就可生长成密集单层并可继续传代,现已传至第10代,但传至第4代,细胞形态开始发生改变;而以5×105个细胞/孔以上的浓度传代细胞时,1d的细胞贴壁率下降;以5×104个细胞/孔以下浓度传代,需7d方可长满皿底,并且细胞开始老化,体积变大,不能继续传代培养。或者细胞不能铺满皿底就衰老死亡。结论:本实验的培养体系可在短期内获得实验用角膜内皮细胞。角膜内皮细胞体外培养的增殖能力与其培养浓度和增殖的空间有关,1×105～5×105个细胞/孔的浓度是角膜内皮细胞快速增殖的适宜培养浓度。     

角膜内皮细胞体外培养的研究进展

角膜内皮是角膜的重要组成部分,由单层的角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)组成,在维持角膜正常的透明度方面发挥着重要的作用.CEC在出生后即丧失增殖能力,一旦受损或丢失会导致不可逆性角膜疾病.但是,大量的研究表明CEC可以在体外增殖,这为体外培养人CEC用于角膜疾病的治疗提供了可行性,但至今仍没有建立一套标准的CEC体外培养方法.本文将归纳总结近年来CEC体外培养方法.以利于今后优化CEC体外培养体系.     

异种角膜基质作为生物角膜载体的免疫学研究

目的探讨异种(猪)角膜基质组织免疫原性,以评价其作为角膜重建载体材料的可行性。方法将新鲜、脱水2种猪角膜基质植片分别植入F344大鼠角膜基质层间,术后12d、90d抽取外周血,行抗CD25·FITC和抗CD4/CD8·PE双色免疫荧光标记,流式细胞仪测定分析。结果测得新鲜组、脱水组大鼠术后12d外周血T淋巴细胞表面抗原CD4 和CD25 、CD8 和CD25 双阳性表达率(1.53%±0.47%,2.13%±0.53%与0·57%±0.20%,0.67%±0.18%)及CD4 /CD8 比值(1.43±0.28,1.69±0.18)与同基因移植组(1.78%±0.36%,1.50±0.19)、阴性对照组(2.06%±0.52%,1.44±0.32)比较无显著性差异(P>0.05)。术后90d,新鲜组、脱水组大鼠外周血T淋巴细胞表面抗原CD4 和CD25 、CD8 和CD25 双阳性表达率(1.48%±0.39%,1.50%±0.46%与0·55%±0.15%,0·58%±0·11%)及CD4 /CD8 比值(1.43±0.51,1.36±0.59)与同基因移植组(1.32%±0·75%,1.31±0.29)、阴性对照组(1.34%±0.18%,1.44±0.42)比较,也无显著性差异(P>0.05)。结论异种(猪)角膜基质免疫原性低,是一种理想的角膜体外重建载体材料。     

角膜后基质与后弹力层交界面的超微结构

目的:研究不同年龄段角膜后基质与后弹力层交界面的超微结构。方法:实验研究。选取不同年龄来源的新鲜供体角膜植片14枚,分为婴幼儿组(3枚)、成年组(5枚)、老年组(6枚)。将供体植片固定于钻台上,台盼蓝溶液染色,8.0mm环钻轻压,用无齿显微镊将后弹力层和角膜内皮层撕离,暴露一层光滑的界面(CⅠ);显微镊继续撕除一半光滑的界面,暴露出相对粗糙的界面(CⅡ)。取2个界面组织行扫描电子显微镜观察、苏木精-伊红(HE)染色及胶原纤维免疫荧光染色。结果:光学显微镜下可见3组供体角膜CⅠ界面均光滑,CⅡ界面均粗糙。扫描电子显微镜下发现3组供体角膜CⅠ界面位于后弹力层之前,为一层光滑的后弹力层前膜,CⅡ界面可见粗大呈束状的后基质层胶原纤维。HE染色可见角膜后弹力层附着于基质,撕除完整后弹力层,暴露光滑的后弹力层前膜,3组供体角膜未见明显差别。3组供体角膜胶原纤维免疫荧光染色显示后弹力层前膜存在Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原纤维,后弹力层含Ⅳ型胶原纤维。结论:不同年龄段角膜后弹力层与后基质层之间均存在一层薄且光滑的后弹力层前膜,主要由Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原纤维组成。后弹力层前膜与后弹力层连接疏松,与后基质连接紧密。     

角膜内皮细胞培养的研究进展

角膜内皮功能失代偿引起的失明可通过角膜移植来治疗.人们通过体外培养角膜内皮细胞并使其增殖,进行角膜内皮细胞移植和角膜组织工程学研究.目前常用的分离角膜内皮细胞的方法是从供体上撕除后弹力层和角膜内皮层,利用酶消化作用使角膜内皮细胞分离.常用的培养基为基础培养基加各种生长因子.这些生长因子在一定程度上促进细胞增殖,但培养的角膜内皮细胞长期传代后仍难以维持正常的细胞形态和功能.基因转染技术建立了永生化角膜内皮细胞系,有关细胞周期、信号通路和离子通道的研究成果也促进了角膜内皮细胞体外培养的研究进展.本文综述了角膜内皮细胞体外培养各个环节的最近进展.     

异种角膜基质材料正位植入后神经再生的研究

目的探讨新鲜、甘油脱水异种角膜基质材料的神经再生特性。方法将新鲜、甘油脱水猪角膜基质材料分别植入到兔角膜基质层间．术后不同时期．通过神经组织银染技术观察受体角膜基质神经再生的状况。结果受体创缘的再生神经纤维分别于术后2个月和3个月长入新鲜材料和脱水材料，但形态走向异常；术后4个月．2种材料周边区神经纤维的数量明显增加，可见神经纤维束和神经纤维丛再生，部分象限中央区也可见神经纤维再生；术后5个月，再生神经纤维形态走向开始改建。结论异种角膜基质材料植入后易于神经再生，再生速度不一；甘油脱水工序对材料的远期神经再生率没有影响。     

In vitro culture of human fetal corneal endothelial cells

Purpose  

To explore and optimize a proper culture system for human fetal corneal endothelial cells (hFCECs), including the methods of primary culture, passage and cryopreservation.     

增龄对角膜基质载体培养的角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 观察增龄对新西兰兔角膜缘干细胞在同种异体角膜基质上生长、增殖的影响.方法 用酶消化法将不同年龄新西兰兔角膜缘组织制成细胞悬液培养,以相同的细胞密度种植于不同年龄的新西兰兔的角膜基质上,观察角膜缘干细胞在角膜幕质上的生长情况.原位杂交检测ABCG2、ANp63的表达,IPP5.1软件分析图像,流式细胞术测细胞周期,运用SPSS13.0软件对析因设计资料进行方差分析.结果 角膜缘干细胞供体年龄各水平差异有统汁学意义,相同时间内角膜基质培养的青年兔角膜缘干细胞在角膜基质单位面积卜的牛长总而积均较中年和老年高,增殖期细胞所占比例大;而角膜基质供体年龄各水平差异与角膜缘干细胞和角膜基质的交互作用均无统计学意义.结论 在同种异体角膜基质载体上培养的角膜缘干细胞的增殖能力随着年龄的增加而降低.     

小鼠角膜基质细胞的KSFM培养基培养法

目的研究使用KSFM培养基能否获取具有增殖能力且保持生物学特性不变的小鼠角膜基质细胞（CSCs）。方法实验研究。将中央区角膜置于EDTA液（20mmol／L）内孵育45min后,用手术显微镊小心剥离角膜上皮层以及内皮层,并将获取的角膜基质置于含300U／mlⅠ型胶原酶的溶液中消化4h。离心后采用DMEM基础培养基、DMEM完全培养基（含10％FBS）以及KSFM培养基重悬细胞常规培养,并以含1U／m1分散酶的EDTA液消化传代细胞。同时,观察细胞并绘制细胞生长曲线;采用逆转录聚合酶链式反应（RT．PCR）检测细胞角膜蛋白多糖（keratocan）mRNA和乙醛脱氢酶（ALDH）mRNA表达情况;采用细胞免疫荧光染色以及蛋白质印迹方法检测细胞keratocan蛋白的表达情况。采用独立样本≠检验对数据进行统计学分析。结果通过胶原酶消化的方法可以从每只小鼠的角膜基质获取约l×l04个单个细胞。RT-PCR结果显示,原代细胞表达CSCs标记物keratocan和ALDH;免疫荧光染色和蛋白质印迹结果显示：原代细胞表达keratocan蛋白。培养于DMEM基础培养基内的原代CSCs无法增殖。培养于DMEM完全培养基内的CSCs可增殖,但第3代细胞不表达keratocan mRNA和ALDH mRNA以及keratocan蛋白。培养于KSFM培养基内的CSCs也可增殖,第3代细胞仍表达keratocan mRNA和ALDH mRNA以及keratocan蛋白,且与原代细胞相比,表达强度差异无统计学意义。结论KSFM培养基不仅能维持小鼠CSCs的生物学特性不变,还能有效促进细胞增殖。     

角膜体外重建异种生物载体材料生物相容性研究

目的　研究异种 (猪 )角膜基质的生物相容性 ,评价其作为角膜体外重建载体的可行性。方法　将新鲜、脱水两种猪角膜基质分别植入新西兰白兔角膜层间 ,定期临床观察植片愈合情况 ,并于术后 2周、1、2、4、8个月取兔角膜进行组织学观察。结果　临床观察 :全部植片存活 ,12只术眼未见角膜水肿混浊、角膜新生血管、排斥反应发生 ,新鲜植片在 2个月左右已透明 ,脱水植片在 6个月后透明。组织学观察 :新鲜植片 4个月时与兔角膜基质相融愈合 ,脱水植片经角膜细胞再分布、胶原纤维改建重塑 ,于 8个月后与兔角膜基质相融愈合 ,2组植片愈合过程中未见有淋巴细胞浸润及新生血管生成。结论　异种 (猪 )角膜基质具有良好的生物相容性 ,是一种理想的角膜体外重建载体材料。     

多糖生物膜细胞载体特性的实验研究

目的 探讨多糖生物膜(PSBM)作为角膜内皮细胞培养及移植载体的可行性。方法 通过PSBM的不同制剂给予大白鼠口服，悬浮培养仓鼠肾(BHK21)细胞及兔角膜层间植入，观察其毒性、生物相容性及可吸收性。结果 食用含多糖微颗粒的饲料60d后，大白鼠无肝肾功能及组织学改变；PSBM微载体悬浮培养72h后，细胞密度可增值3倍以上；角膜层间植入PSBM后2～3个月时，植人物基本吸收。结论 PSBM属安全无毒物质，具有很好的细胞亲和性、生物相容性及可吸收性，是CE细胞培养及移植的良好载体。     

复方中药金芪滴眼剂对兔角膜上皮及基质细胞增殖的影响

目的：观察复方中药金芪滴眼剂对兔角膜上皮细胞及兔角膜基质层细胞增殖的影响。方法：建立体外培养兔角膜上皮细胞，兔角膜基质层细胞系，用MTT法检测不同浓度金芪滴眼剂对细胞增殖活性的影响。结果：金芪滴眼剂对兔角膜上皮细胞有显著的促进增殖作用。且随浓度的增加。增殖率加大，对兔角膜基质层细胞无促增殖作用。高浓度时有抑制作用。结论：复方中药金芪滴眼剂对兔角膜上皮细胞有较好的保护作用。