鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ 技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ 片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３ 中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－ ）中,转染细胞经选择培养基筛选,并采用ＭＴＸ加压扩增培养。结果：得到了高效表达融合蛋白的细胞株,表达水平为３００ Ｕ／（１０６ 细胞·ｄ）。通过ＥＬＩＳＡ 和溶解圈方法鉴定,该融合蛋白可与Ｄ－二聚体结合,并具有激活纤溶酶原溶解纤维蛋白的活性。结论：成功构建并获得高效表达双功能融合蛋白的细胞株,为进一步研究这一双功能融合蛋白的体内外特异溶栓活性以及评价其作为新型导向溶栓制剂奠定了基础。     

低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽（12肽）融合表达及特性…

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶性活性，同时人血纤蛋白附肽（１２肽），的抗血纤收白单体聚合的活性。     

低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽(12肽)融合表达及特性分析

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重组，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶纤活性，同时兼具血纤蛋白粘附肽（１２肽）的抗血纤蛋白单体聚合的活性     

可溶性E—选择素cDNA基因克隆及其真核表达

从ｐＵＣ１８／Ｅ－选择素重组质粒经ＰＣＲ扩增得到可溶性Ｅ－选择素ｃＤＮＡ基因，将此基础插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｓｍａ Ｉ位点，构建了正向表达质粒ｐＪＳＡ１１７５．可溶性Ｅ－选择素，采用脂质供共转染的方法，将上述质粒转染ＴＫ＾－１４３细胞。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体—突变体人TNFα融合基因在CHO（dhfr^—）细胞中的表达

目的：提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子（hScFv25-hTNFα)的稳定性和杀伤活性,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体－突变体人TNFα融合基因（ds-ScFv-hTNFα）,并在CHO细胞中表达。方法：常规构建ds-ScFv-hTNFα融合基因,并克隆入真核表达载体pCI(dhfrl）,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO－dhfr^-）,甲氨蝶呤（MTX）高压筛选高表达细胞株,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果：目的基因在CHO（dhfr^－）中获得了表达,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性,且稳定性得到大幅度提高,达到4℃放置4个月活性无明显下降。结论：抗肝癌人源化ds-ScFv-hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

人脑源性神经营养因子及神经营养素—3重组腺病毒的构建及鉴定

目的：构建人脑源性神经营养因子和神经营养素－３重组腺病毒，使其携带神经营养因子感染神经系统细胞，在局部释放有生物活性的营养因子。方法：Ｕ针人全长ＢＤＮＦ与ＮＴ３基因分别插入ｐＣＤＮＡ３载体，然后将表达序列ＣＭＶ－ＢＤＮＦ－ＢＧＨｐＡ和ＣＭＶ－ＮＴ３－ＢＧＨｐＡ切下，插入Ｅ１区缺失的腺病毒载体ｐＨΔＥｌｓｐ１Ａ中，与ｐＪＭ１７共转染２９３细胞，通过同源重组产生重组腺病毒。结果和结论：经过二次ＣｓＣｌ     

小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体的表达与纯化

目的：表达并纯化小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体,并初步分析比较两者的体外生物活性。方法;经ＤＮＡ重组的构建重组表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中高表达两种单链抗体,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体后经ＩＭＡＣ纯化表达产物,并用凝血酶切除Ｎ端融合的（Ｈｉｓ）６,纯化的表达产物经复性后ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果：两种单链抗体在大肠杆菌中表达量占全菌蛋白的５０％以上,经变性,纯化后纯度可达９７％     

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体-突变体人论著TNFα融合基因在CHO(dhf)细胞中的表达

目的 :提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子 (hScFv2 5 hTNFα)的稳定性和杀伤活性 ,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体 突变体人TNFα融合基因 (ds ScFv hTNFα) ,并在CHO细胞中表达。方法 :常规构建ds ScFv hTNFα融合基因 ,并克隆入真核表达载体pCI(dhfr1) ,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株 (CHO dhfr ) ,甲氨蝶呤 (MTX)高压筛选高表达细胞株 ,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果 :目的基因在CHO(dhfr )中获得了表达 ,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性 ,且稳定性得到大幅度提高 ,达到 4℃放置 4个月活性无明显下降。结论 :抗肝癌人源化ds ScFv hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达 ,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

利用噬菌体表现呈现技术制备HIV—1整合酶单链抗体的初步研究

研制ＨＩＶ－１整合酶的重组噬菌体单链抗体。方法采用噬菌体表现呈现方法。结果：由ＩＮ蛋白免疫的小鼠脾细胞ｍＲＮＡ中构建了单链抗体基因ｃＤＮＡ文库，克隆入噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，经转化大肠杆菌ＴＧ１，获得了车容为３．５＊１０＾５的表达文库。     

人白介素6在CHO细胞中的克隆与表达

本研究通过引物设计、转译优化、ＤＮＡ体外重组等技术，构建了ｐＳＶ２·ＩＬ６重组质粒，利用磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷型（ＣＨＯｄｈｆｒ－）株，经选择培养基筛选及逐渐提高甲氨蝶呤（ＭＴＸ）的浓度加压基因共扩增法，获得一株稳定表达人ＩＬ６的细胞株，用ＩＬ６依赖的杂交瘤细胞株７ＴＤ１测定细胞上清液的ＩＬ６生物学活性为１．９×１０５Ｕ／（１０６细胞·ｄ）。     

反义bcr／ab1重组逆转录病毒表达载体的构建及其转染对K562细胞系的影响

用逆转录聚合酶链反应技术从Ｋ５６２细胞系中扩增出ｂｃｒ／ａｂ１融合区２５３ｂｐＤＮＡ片段，经反复连接与克隆，得到含同方向串联的２、３和４个拷贝的该融合基因片段的克隆载体ｐＵＣｓ。这些片段分别反向连接到逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲｎｅｏ。ＤＮＡ序列分析、限制性内切酶分析和菌落原位杂交证实：不同拷贝数的ｂｃｒ／ａｂ１融合区基因片段已反向插入ｐＤＯＲｎｅｏ。利用脂质体介导，将重组质粒导入Ｋ５６２细胞系后，观察到转染细胞的增殖明显被抑制     

人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒pcDNA3—hEGF的构建

目的：构建人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因真核表达质粒，为深入研究ｈＥＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈＥＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增；提纯及纯化ｐＵＣ１８－ｈＥＧＦ质粒；经ＤＮＡ序列分析其所含ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ；限制性酶切ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ片段，连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内，克隆出真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈ     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白的产生

目的：获得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析。方法：用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，定向克隆到经同样酶切处理的ｐＧＥＸ－ＫＧ表达载体，转化大肠杆菌，经优化ＩＰＴＧ的诱导条件，获得了ＦＡＳ胞外区与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶的融合蛋白高效表达；用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了ＧＳＴ－ＦＡＳ融合蛋白，免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。结果：用重组ＦＡＳ为免疫原制备的抗体能诱导Ｕ９３７细胞产生细胞凋亡。结论：重组ＦＡＳ抗原和制备的抗体能用于对ＦＡＳ系统的功能研究     

利用噬菌体表面呈现技术制备HIV-1整合酶单链抗体的初步研究

目的：研制ＨＩＶ－１整合酶（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ，ＩＮ）的重组噬菌体单链抗体。方法：采用噬菌体表面呈现方法。结果：由ＩＮ蛋白免疫的小鼠脾细胞ｍＲＮＡ中构建了单链抗体基因ｃＤＮＡ文库，克隆入噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，经转化大肠杆菌ＴＧ１，获得了库容为３．５×１０５的表达文库。利用包被在酶联板上的ＩＮ蛋白进行四轮亲和富集，筛选出７６株具有ＩＮ结合活性的重组噬菌体。对随机挑选的一株克隆进行了ＤＮＡ序列分析，证明其符合小鼠抗体序列。结论：获得了抗ＨＩＶ－１ＩＮ的噬菌体单链抗体，为其进一步研究打下基础。     

我国登革2型病毒prM-E基因与SFV病毒载体重组RNA的构建

目的：构建我国登革２型病毒４３株ｐｒＭ－Ｅ基因的甲病毒（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ,ＳＦＶ）重组ＲＮＡ,为登革新型疫苗的研究奠定基础。方法：首先将含有多种稀有限制酶位点的接头插入ｐＳＦＶ载体的多克隆位点,再把ｐｒＭ－Ｅ基因克隆至该载体中。将获得的重组质粒ＤＮＡ经体外转录后,通过电穿孔法将其转录的ＲＮＡ产物导入宿主细胞,并采用间接免疫荧光法检测ｐｒＭ－Ｅ基因的表达。结果：已获得含多种酶位点的ｐＳＦＶ病毒载体,并且所构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ,在宿主细胞中的表达产物可与登革２型病毒特异抗体起反应。结论：构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ可表达我国登革２型病毒株的特异蛋白。     

重组融合蛋白Fab／INF—αA的表达及其抗乙型肝炎病毒的作用

ＩＦＮ－αＡ是治疗乙型病毒性肝炎有效药物,但由于其临床应用的副作用及持久应答率不超过５０％,限制了其疗效的发挥［１］。作者通过ＤＮＡ重组技术和ＰＣＲ技术将抗乙型肝炎表面抗原抗体片段Ｆａｂ与ＩＦＮ－αＡ在分子水平上进行重组,构建了人抗乙肝表面抗原抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素融合蛋白原核表达载体［２］。本实验将筛选出阳性克隆的菌种进行诱导表达,测定表达的重组融合蛋白（Ｆａｂ／ＩＦＮ－αＡ）的ＩＦＮ－αＡ活性及抗体Ｆａｂ活性,并应用ＨＢＶＤＮＡ转染细胞系（ＨｅｐＧ２２１５细胞系）作模型［３］,通过检测…     

水蛭素12肽与低分子量尿激酶融合基因的构建和表达

目的：旨在获得既能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达。方法：化学合成水蛭素１２肽基因编码序列，通过ＤＮＡ重组技术将水蛭素１２肽基因片段连接到低分子量尿激酶ｃＤＮＡ片段５′端，构建成融合基因，结果：构建了水蛭素１２肽与低分子量尿激酶的融合基因，在大肠杆菌中获得表达，重组融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。结论：运用ＤＮＡ重组技术可将两种不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纤活性和抗凝活性。     

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的原核表达载体,并在大肠杆菌ＪＭ１０９中表达可溶性的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ。以重组的ＨＣＶ核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经ＮｃｏⅠ／Ｎｏｔ Ⅰ酶切鉴定,该ＳｃＦｖ基因由７５０ｂｐ组成。将其亚克隆到ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ表达载体中,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,提取质粒进行ＤＮＡ序列测定,符合ＳｃＦｖ的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。ＩＰＴＧ诱导转化的大肠杆菌ＪＭ１０９,在其培养上清中获得了可溶性ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ的表达。酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）证实表达的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡ     

新型CHO/dhfr-细胞定点整合和表达系统的建立

目的建立CHO/dhfr-细胞的定点整合和表达系统.方法利用常规分子生物学方法,构建了一个新的高效筛选表达载体,该载体含有一个由FRT(flp recombination target)位点、报告基因(LacZ)及筛选基因(zeocin)三片段构成的融合基因,而且该基因的表达受一个弱化的SV40启动子的控制.借助于随机整合及高效筛选,实现FRT位点在CHO/dhfr-细胞基因组中转录活跃区的整合,然后利用该位点介导的特异性重组实现了目的基因(单链抗体-尿激酶融合基因)的定点整合和有效表达,而且随后通过DHFR/MTX系统的加压扩增,以提高单链抗体-尿激酶融合基因在宿主细胞中的表达水平.结果与结论获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系,并利用该细胞系实现了单链抗体-尿激酶融合基因的高表达,表达量达到5 μg/(106细胞·24 h).