红景天苷对LPS刺激人牙周膜细胞增殖和分泌表达的影响

目的研究红景天苷(salidroside,SAL)对大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后体外培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,h PDLCs)的增殖及对分泌表达Toll样受体(Toll-like receptor 4,TLR 4)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)及核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的影响,为红景天苷在牙周炎治疗方面提供初步的实验依据。方法组织块法原代培养正常h PDLCs;以2 mg/L LPS刺激第4代细胞,加入不同浓度的红景天苷作用12、24、48 h;采用MTT方法检测细胞的增殖;采用Western blot、ELISA、qRT-PCR等方法检侧TLR-4、TNF-α、IL-1β、IL-6、OPG及RANKL的表达水平,并进行统计学分析。结果 MTT结果显示低浓度的红景天苷(≤10μmol/L)均能促进细胞增殖,并存在浓度依赖性,其中0.5μmol/L对h PDLCs增殖作用最明显(P<0.05),高浓度的红景天苷(>10μmol/L)不能促进牙周膜细胞增殖;Western blot、ELISA及qRT-PCR结果显示:0.5μmol/L红景天苷可使LPS刺激的h PDLCs的TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6及RANK表达水平随时间延长而逐渐降低,其中48 h降低的最为明显,存在显著性差异(P<0.05);另外,LPS刺激对OPG的表达几乎没有影响,而0.5μmol/L红景天苷作用可以显著上调OPG的表达水平。结论红景天苷可减轻LPS刺激后h PDLCs的细胞损伤,其机制可能通过调节与TLR4相关信号通路,降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及与骨吸收相关因子RANKL、OPG的表达,从而抑制炎症反应和骨吸收。     

TP对脂多糖介导人牙周膜成纤维细胞细胞间黏附分子-1表达的影响

目的: 检测人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLF)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导下细胞间黏附分子-1﹙intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1﹚的表达,探讨TP(tea polyphenols,TP)对其表达的影响。方法: HPDLF采用改良组织块法体外培养,将HPDLF随机分成LPS组、TP100组、TP200组,用酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immuosorbent,ELISA)检测不同浓度TP对LPS介导下HPDLF分泌ICAM-1的活性。实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测ICAM-1 mRNA的表达。结果: 在LPS干预下,不同时间不同浓度的TP影响下均可抑制ICAM-1分泌,其活性降低,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05);且ICAM-1 mRNA表达水平显著降低,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论: TP对ICAM-1的抑制作用明显,100 μg/mL TP对其的抑制作用更显著,提示TP的抗炎机制可能与抑制ICAM-1有关。     

周期性张应力对人牙周膜细胞Periostin表达的影响

目的:研究在机械力作用下人牙周膜细胞(h PDLCs)内Periositn(PN)m RNA和蛋白的表达变化。方法:采用组织块酶消化法培养h PDLCs,经鉴定后将第4代细胞随机分为4个实验组和1个对照组(非加力组),4个实验组分别采用Flexcell-5000 Tension System应力加载系统对h PDLCs加载6、12、24、48 h的周期性张应力;然后采用q RT-PCR、Western blot分别检测各组h PDLCs中PN m RNA和蛋白的表达变化。结果:在正常h PDLCs中表达PN m RNA和蛋白;与对照组相比,加力6 h后,PN m RNA和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05);加力12 h后,PN m RNA和蛋白的表达均逐渐升高,并持续至24 h达最高水平(P<0.05);而在加力48 h时,PN m RNA和蛋白表达均明显下降,并恢复至对照组的表达水平(P>0.05)。结论:机械力可诱导h PDLCs中PN的表达增强及活化,且具有时间依赖性;提示PN可能参与了细胞内生物力学信号的转导。     

大肠杆菌脂多糖影响Toll样受体4在人牙髓细胞的表达

目的:探讨大肠杆菌脂多糖(lippolysacchaide,LPS)对体外培养的人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)表达的影响及TLR4在LPS对牙髓细胞激活中的作用。方法:以大肠杆菌LPS刺激体外培养的人牙髓细胞,运用实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光技术分别检测牙髓细胞TLR4mRNA和蛋白的表达。利用抗体阻断和ELISA方法观察TLR4在LPS激活牙髓细胞释放IL-1β中的作用。结果:正常牙髓细胞不表达TLR4,1×10-4g/L大肠杆菌LPS作用HDPCs6、12、24h后均可见TLR4在胞膜/胞质的表达,胞核并不表达TLR4。FQRT-PCR结果表明LPS能明显上调牙髓细胞TLR4mRNA的表达(P<0.001),并具有LPS浓度依赖性。抗体阻断和ELISA结果证实LPS能激活牙髓细胞释放IL-1β(P<0.01),抗TLR4单抗能明显抑制LPS对HDPCs的激活(P<0.05)。结论:正常人牙髓细胞不表达TLR4,大肠杆菌LPS能诱导牙髓细胞表达TLR4mRNA和蛋白。TLR4介导了LPS对牙髓细胞的活化,在LPS对牙髓细胞激活效应中具有重要作用。     

CircBARD1靶向miR-495-3p/TLR4调控LPS诱导的人牙周膜细胞增殖、凋亡和炎症

目的:研究circBARD1对LPS诱导的人牙周膜细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)增殖、凋亡和炎症的影响，并探讨其潜在的调控机制。方法:脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理PDLCs建立体外牙周炎细胞模型。qRT-PCR检测circBARD1表达；分别采用CCK8实验和流式细胞术检测细胞增殖活性和凋亡情况；Western blot检测凋亡相关蛋白的表达；ELISA检测炎性因子水平。双荧光素酶报告基因实验验证circBARD1、miR-495-3p和TLR4之间的靶向关系。结果:LPS诱导PDLCs中circBARD1和TLR4表达上调，miR-495-3p表达下调。敲低circBARD1促进LPS诱导的PDLCs的增殖活性，抑制细胞凋亡和炎症反应。circBARD1靶向负调控miR-495-3p的表达，抑制miR-495-3p能够逆转circBARD1敲低对PDLCs的影响。TLR4是miR-495-3p的靶基因，敲低circBARD1可作为miR-495-3p海绵，抑制TLR4的表达。过表达TLR4能够逆转circBA...     

内毒素对人牙周膜细胞Toll样受体2和Toll样受体4表达的影响

目的:观察内毒素(LPS)刺激后人牙周膜细胞Toll样受体2和Toll样受体4的表达,探讨牙周膜细胞作为免疫活性细胞在牙周炎局部免疫反应中的作用。方法:组织块法原代培养人牙周膜细胞,经来源鉴定后,取生长良好的第4代细胞用LPS进行刺激,分别于刺激0、4、8、12、24 h,运用免疫细胞化学染色法检测TLR2和TLR4在牙周膜细胞中的表达;利用多功能真彩色细胞分析管理系统进行图像分析,对TLR2和TLR4进行免疫组化评分(IHS)。结果:无LPS刺激的对照组(刺激O h)TLR2和TLR4的表达均为弱阳性,加入LPS后,染色增强,且随着刺激时间的延长而增加(P<0.05),LPS刺激后各时间点TLP2和TLR4的IHS分值与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:内毒素的刺激可以使牙周膜细胞TLR2和TLR4表达增多,提示牙周膜细胞参与牙周局部免疫反应。     

LPS对人牙周膜细胞Toll样受体4及下游炎症因子表达的影响

目的：观察革兰氏阴性菌外膜成分脂多糖（LPS）对牙周膜细胞（PDLCs）Toll样受体4（TLR4）及下游炎症因子表达的影响。方法：用浓度为10μg／mL的LPS对牙周膜细胞进行刺激,Western Blot检测牙周膜细胞上TLR4受体表达,同时ELISA检测培养基上清中炎症因子TNF－α、IL－1β的含量。结果：加入LPS后,牙周膜细胞上TLR4蛋白表达增强,炎症因子TNF－α、IL－1β含量增多,且随LPS的刺激时间增加而呈上升趋势。结论：LPS促进PDLCs的TLR4表达,并导致炎症因子分泌增加,TLR4信号通路在牙周炎发病过程中具有重要作用。     

白藜芦醇减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤并抑制TLR4/NF-κB活化

目的:探究白藜芦醇(RES)对脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜细胞(hPDLCs)损伤的保护作用.方法:体外培养并鉴定hPDLCs,将培养的hPDLCs随机分为5组:对照组、LPS(10 μg/ml)+RES(0、30、60、90tμmol/L)组,MTT法检测各组细胞增殖能力,ELISA检测各组细胞分泌TNF-α/IL-6水平,PCR和Western blot检测各组细胞TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达.结果:分离培养的hPDLCs抗波丝蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性.与对照组比,LPS处理后细胞增殖能力明显降低,细胞分泌TNF-α/IL-6水平和TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达明显增加;30～90 μmol/L白藜芦醇预处理后,细胞增殖能力增加(P＜0.05),细胞分泌TNF-α/IL-6水平、TLR4/NF-κB mRNA以及蛋白表达则下调(P＜0.05),均呈现一定的浓度依赖性.结论:白藜芦醇可抑制TLR4/NF-κB活化并减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤.     

年龄对小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4表达水平及功能的影响

目的：观察不同年龄组小鼠腹腔巨噬细胞Toll样受体2/4（TLR2/4）表达水平的差别,以及该细胞在脂多糖（LPS）刺激下,炎症因子TNF-α分泌水平的差别。方法：采用real-time PCR和流式细胞技术,检测低龄组和高龄组小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达水平的差异;同时检测1μg/mL大肠杆菌（E.coli）LPS或1mg/L牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）LPS刺激后,两组细胞TLR2/4表达水平的变化;采用ELISA技术检测炎症因子TNF-α分泌水平的变化。结果：刺激前,两组细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达水平均无明显差别。E.co-li LPS或P.gingivalis LPS刺激后,低龄组细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达水平均明显高于高龄组（P〈0.05）,其分泌的TNF-α水平也显著高于高龄组（P〈0.05）。结论：年龄对小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4表达水平没有显著影响,但增龄性变化可能导致TLR2/4功能的减退。     

TLR4与LPS诱导的大鼠口腔黏膜分泌TNF-α的相关性研究

目的 :观察Toll样受体-4(Toll like receptors 4,TLR4)与脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的,大鼠口腔黏膜上皮细胞分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的相关性。方法:选取SPF级SD大鼠15只,根据随机数字表法将其随机均分为5组,分别为采用不同浓度和不同时间的LPS刺激大鼠口腔黏膜,检测大鼠口腔黏膜上皮细胞培养上清液中TNF-α的表达情况,检测细胞内TLR4、MyD 88的表达变化。结果:经过LPS刺激后,TNF-α蛋白质的表达量随着LPS刺激浓度的增加而逐渐升高,呈现出明显的剂量依赖性效应。另外,二者与LPS刺激的持续时间呈现出一定的时间依赖性,TNF-α蛋白质的表达量在12 h达到峰值。LPS能够明显增加细胞内TLR4和MyD88蛋白质的表达。结论:LPS诱导并促进大鼠黏膜上皮细胞分泌TNF-α的情况,可能与TLP4调控有关。     

乳铁蛋白下调脂多糖激发的人牙周膜细胞Toll样受体4表达的研究

目的 观察乳铁蛋白（LF）对经脂多糖（LPS）刺激的人牙周膜细胞（hPDLCs）表达Toll样受体4（TLR4）的影响。方法 采用组织块酶消化法培养hPDLCs,鉴定后取第4代细胞,分成空白对照组、LPS组、LPS+LF组。空白对照组不加任何刺激,LPS组加入0.1 μg?mL-1 LPS;LPS+LF组在加入0.1 μg?mL-1 LPS 2 h后,加入10 μg?mL-1 LF。以加入LF时开始计算时间,4 h后采用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测hPDLCs中TLR4 mRNA的表达,24 h后采用细胞免疫荧光染色法观察TLR4蛋白的表达。结果 RT-PCR检测显示：LPS+LF组TLR4 mRNA表达较LPS组明显降低（P<0.05）,与空白对照组无明显差异（P>0.05）。细胞免疫荧光染色法显示：LPS+LF组TLR4蛋白的表达强度较LPS组减弱（P<0.05）,与空白对照组无明显差别（P>0.05）。结论 LF可以下调LPS激发的hPDLCs中TLR4的表达,在牙周炎症TLR4信号通路的调控过程中有一定的作用。     

TLR4对牙周膜细胞分泌IL-8影响的实验研究

目的:观察TLR4在牙周膜细胞分泌IL-8过程中的作用。方法:采用RT-PCR和ELISA的方法检测IL-8mRNA和蛋白在牙周膜细胞中的表达,并观察不同剂量LPS对其表达量的影响以及抗TLR4抗体作用下IL-8mRNA和蛋白表达量的变化。结果:牙周膜细胞中存在IL-8mRNA表达,分泌少量IL-8蛋白;经LPS刺激后IL-8表达量上调,抗TLR4抗体能够拮抗这一作用。结论:牙周膜细胞表达IL-8mRNA及蛋白,在受到LPS刺激后,IL-8mRNA和蛋白的表达量增加,抗TLR4受体能够拮抗这一作用,提示TLR4参与了牙周膜细胞受到LPS刺激后分泌IL-8的过程。     

白藜芦醇对高糖环境下牙龈上皮细胞TLR4表达及炎症因子分泌的影响

目的:研究白藜芦醇对高糖环境下牙龈上皮细胞TLR4表达及炎症因子分泌的影响,探讨白藜芦醇对伴糖尿病牙周炎患者的治疗作用及相关分子机制.方法:体外培养牙龈上皮细胞,按照作用方式不同分为正常对照组、高糖组和高糖+白藜芦醇组.荧光定量PCR检测TLR4表达情况;取第3代牙龈上皮细胞,高糖环境下采用或不采用白藜芦醇处理24 h,随后用100 ng/mL LPS处理2 h,ELISA检测IL-1β 、IL-6、IL-8和TNF-α分泌;Western印迹法检测TLR4信号通路下游分子NF-κB p65、p38MAPK和STAT3磷酸化.采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析.结果:白藜芦醇可以逆转高糖环境下牙龈上皮细胞TLR4水平的升高,同时抑制高糖环境下LPS诱导的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达.Western印迹结果显示,白藜芦醇也可抑制TLR4信号通路下游分子NF-κB p65、p38MAPK和STAT3磷酸化.结论:白藜芦醇通过负向调控TLR4信号通路减轻高糖环境下牙龈上皮细胞炎症因子的分泌.     

Toll样受体2和4在脂多糖诱导人牙周膜成纤维细胞表达细胞核因子-κB受体活化因子配基中的作用

目的 观察在脂多糖（LPS）刺激下,人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）中Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）表达水平的抑制对其表达细胞核因子-κB受体活化因子配基（RANKL）的影响。方法 选用100 ng·mL-1、1 μg·mL-1、10 μg·mL-1大肠杆菌LPS分别刺激HPDLFs,刺激6、12、24、48 h后,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HPDLFs表达RANKL的水平。分别运用不同滴度的anti-TLR2+anti-TLR4、anti-TLR2、anti-TLR4抗体预处理HPDLFs,观察
1 μg·mL-1 LPS刺激下,其RANKL表达水平的变化。结果 LPS刺激HPDLFs 6 h后,即可检测到RANKL的表达,24 h达到顶峰,然后逐渐下降;各LPS质量浓度组的规律基本一致。分别用anti-TLR2+anti-TLR4、anti-TLR2、anti-TLR4抗体预处理HPDLFs,在1 μg·mL-1 LPS刺激下,其产生RANKL的水平明显下降（P<0.05）;3组中,RANKL的表达水平有明显差异（P<0.05）,其中anti-TLR2+anti-TLR4抗体处理组RANKL表达量最少,anti-TLR4抗体处理组次之,anti-TLR2
抗体处理组RANKL的表达量最高。结论TLR2、TLR4均参与了LPS诱导HPDLFs表达RANKL的过程;与anti-TLR2抗体相比,anti-TLR4抗体能更有效地抑制LPS刺激后HPDLFs表达RANKL的能力。     

低强度牵张应力对异丙肾上腺素诱导下牙周膜成纤维细胞炎症反应的影响

目的: 探讨低强度牵张力对异丙肾上腺素（isoproterenol,ISO）诱导下人牙周膜成纤维细胞炎症反应的影响及其分子机制。方法: 体外培养人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligaments cells,PDLCs）,给予一定浓度(0.01、0.1、1 μmol/L)ISO刺激24 h,设置空白对照组,同时施加不同强度（5%、10%、15%形变量）的牵张力,利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞内IL-1β、IL-6 mRNA的表达。设置空白対照组、ISO刺激组（0.1μmol/L）、低强度牵张力组（5%形变量）和ISO+低强度牵张力组,利用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测内质网应激相关p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4蛋白表达量的变化。应用细胞转染技术敲低PDLCs中PERK基因的表达,RT-qPCR检测低表达PERK的牙周膜成纤维细胞在ISO及5%形变量牵张力作用下IL-1β及IL-6 mRNA的表达。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果: ISO诱导可显著上调牙周膜成纤维细胞中IL-1β及IL-6 mRNA的表达（P<0.05）;与对照组相比,5%形变量牵张力抑制ISO诱导下PDLCs中IL-1β和IL-6 mRNA的表达,差异有统计学意义（P<0.05）;Western印迹结果显示,5%形变量牵张力可抑制ISO诱导引起的PERK、eIF2α磷酸化及ATF4的表达（P<0.05）。与阴性对照组相比,ISO诱导下PERK沉默的PDLCs中IL-1β及IL-6 mRNA表达显著降低（P<0.05）。结论: 5%形变量牵张力可能通过内质网应激PERK通路抑制ISO诱导下牙周膜成纤维细胞的炎症反应。     

中间普氏菌内毒素刺激人牙周膜细胞上调表达基因的研究

目的：用基因芯片研究中间普氏菌内毒素刺激前后，牙周膜细胞上调表达基因。方法：应用点样数512点的基因芯片分析中间普氏菌内毒素刺激人牙周膜细胞上调表达基因。结果：研究发现中间普氏菌内毒素刺激牙周膜细胞后有6条上调基因，其中部分基因与蛋白激酶和蛋白磷酸酶有关。结论：牙周致病菌内毒素刺激牙周膜细胞后，可引起部分基因表达上调，从而影响牙周膜细胞正常的生理功能。     

炎症微环境对人牙周膜成纤维细胞增殖与成骨分化的影响

目的: 观察脂多糖模拟的炎症微环境对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells, PDLCs）增殖与成骨分化的影响。方法: 体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、0.1、10 μg/mL脂多糖作用于细胞,采用MTT法观察脂多糖对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western印迹法检测脂多糖模拟的炎症微环境对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 0.1 μg/mL脂多糖促进PDLCs增殖,增强成骨标志物mRNA和蛋白的表达;10 μg/mL脂多糖可抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2的表达,其结果有统计学意义。结论: 高浓度脂多糖（10 μg/mL）模拟的炎症微环境对PDLCs增殖及成骨分化有抑制作用,低浓度脂多糖（0.1 μg/mL）对PDLCs的增殖和成骨分化有促进作用。