模拟微重力对人牙髓干细胞微丝及细胞迁移能力的影响

目的:探讨模拟微重力对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)微丝及迁移能力的影响。方法:利用旋转培养系统(rotary cell culture system,RCCS)将HDPSCs分为常规对照组和微重力培养组,分别于4、12、24、48、72h行免疫荧光染色,观察微丝的变化;72h后,透射电镜观察微丝骨架变化及细胞迁移实验检测细胞迁移能力。结果:4h时即有粗大的微丝纤维束解聚,24～72h变得模糊,紊乱,且出现多向排列趋势;实验组细胞迁移数量少于对照组(P<0.05)。结论:人牙髓干细胞微丝在模拟微重力环境下发生改变,呈时间依赖性并使细胞迁移能力降低。     

模拟微重力对人牙髓干细胞-PLGA复合物矿化的影响

目的:研究模拟微重力(SMG)对人牙髓干细胞(hDPSCs)在聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上矿化的影响。方法:采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,并进行鉴定。hDPSCs常规接种于PLGA支架,24h后,模拟微重力环境和普通环境下分别矿化诱导。矿化诱导第3、5、7、10、14天时进行碱性磷酸酶活性检测,第21天时进行茜素红染色以观察人牙髓干细胞在PLGA支架上矿化结节形成情况。结果:模拟微重力环境下的碱性磷酸酶活性明显低于普通环境(P<0.01),茜素红染色显示模拟微重力环境下形成的矿化结节较普通环境下的小且数量少。结论:模拟微重力环境抑制hDPSCs在PLGA支架上的矿化。     

模拟微重力环境对人牙髓干细胞体外增殖能力的影响

目的：研究模拟微重力环境对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）在PLGA支架上体外增殖能力的影响。方法：将分离、鉴定后的人牙髓干细胞接种在PLGA支架上,采用MTT法检测普通环境和模拟微重力环境中培养24、48、72h的人牙髓干细胞在PLGA支架上的细胞活性。DAPI荧光染色和流式细胞术比较牙髓干细胞在两种环境培养3d的细胞数量以及细胞周期分布情况。结果：MTT显示模拟微重力组中各时间点的A值均高于普通环境培养组;DAPI荧光染色显示在模拟微重力下培养3d的人牙髓干细胞数量明显多于普通环境培养组;细胞周期分析结果表明模拟微重力组中S期细胞比例明显高于普通环境培养组（P〈0.05）。结论：接种在PLGA支架上的人牙髓干细胞在模拟微重力环境下较普通环境具有更高的体外增殖能力。     

模拟微重力环境对人牙髓干细胞体内增殖能力的影响

目的：研究模拟微重力环境对聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架上人牙髓干细胞（hDPSCs）体内增殖能力的影响。方法：分离、培养hDPSCs并进行鉴定。以PLGA作为支架材料培养人牙髓干细胞,将hDPSCs-PLGA复合物分别在模拟微重力环境和普通重力环境下培养72h,然后移植到裸鼠背部皮下。植入4周后取出组织块,分别进行HE染色、Masson染色、Ki67和I型胶原免疫组化检测。结果：模拟微重力环境下细胞密度、胶原生成量、I型胶原表达量和Ki67阳性细胞数量明显高于普通环境（P〈0.01）。结论：模拟微重力环境培养的hDPSCs的体内增殖能力高于普通重力组。     

模拟微重力对人牙髓干细胞在PLGA支架上黏附影响的研究

目的：研究模拟微重力（SMG）对人牙髓干细胞（hDPSCs）在聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架上黏附的影响。方法：采用酶消化法培养hDPSCs,并进行鉴定。将hDPSCs在模拟微重力条件接种于PLGA支架,接种细胞数分别为0.2×106、0.4×106、0.8×106、1.2×106个/支架,以常规条件接种作为对照组。接种24h后通过细胞计数检测细胞粘附率;扫描电镜（SEM）观察细胞形态。结果：模拟微重力条件接种组随接种细胞数的增多,黏附率显著升高（P〈0.01）,常规条件接种组黏附率略有降低（P〈0.05）;当接种细胞数为0.4×106、0.8×106、1.2×106/支架时,实验组高于对照组（P〈0.05或P〈0.01）;为0.2×106/支架时,对照组高于实验组（P〈0.01）。SEM显示模拟微重力条件接种组的细胞具有丰富的表面微绒毛。结论：模拟微重力条件下hDPSCs在PLGA支架上的黏附率高于常规条件。     

整合素α6对模拟微重力下人牙髓干细胞粘附能力的影响

目的:探究整合素α6对模拟微重力下人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)粘附能力的影响。方法:以PLGA支架为载体,将采用酶消化法培养的hDPSCs接种在PLGA支架上,分普通重力组和模拟微重力组培养72 h,Western blot检测整合素α6(Integrin α6)、整合素αv(Integrin αv)、整合素β1(Integrin β1)、粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、磷酸化粘着斑激酶(phospho-FAK)的达;si-RNA转染hDPSCs,抑制整合素α6表达,DAPI荧光染色检测转染后hDPSCs在PLGA支架上的粘附数量,Western blot检测转染后hDPSCs中整合素β1、FAK、phospho-FAK的表达。结果:模拟微重力下, 整合素α6、phospho-FAK蛋白水平上调(P＜0.05),整合素αv、整合素β1和FAK的蛋白水平未见显著性差异;si-RNA转染的hDPSCs粘附能力、phospho-FAK蛋白水平均低于对照组(P＜0.05),整合素β1和FAK的蛋白水平未见显著性差异。结论:模拟微重力下,hDPSCs在PLGA支架上粘附能力增强可能与整合素α6及其下游信号分子FAK的表达水平上调相关。     

模拟微重力影响人牙髓干细胞的矿化能力与RhoA-Rho激酶信号通路相关性研究

目的初步研究Rho A-Rho激酶信号通路在模拟微重力(Simulated Microgravity,SMG)影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)矿化过程中的作用。方法将经酶消化法分离、纯化后的人牙髓干细胞体外扩增培养,以1×106细胞接种于PLGA支架上,分别于模拟微重力下及普通重力下矿化诱导液中培养,72 h后收集细胞,采用Western Blot检测Rho A蛋白表达;此外,在重力条件下采用Rho激酶抑制剂Y-27632,以矿化诱导液培养组作为对照组,检测矿化诱导3、5、7、10d两组碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)活性变化,采用Western Blot检测矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白牙本质基质蛋白(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达,采用茜素红染色法检测矿化诱导21 d,矿化结节形成水平。结果模拟微重力下,人牙髓干细胞中Rho A蛋白的表达下调;在普通重力矿化诱导条件下,加入抑制剂Y-27632后,各时间点细胞AKP表达水平均较对照组有所降低;矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白DSP、DSPP、DMP-1表达明显下调,矿化诱导21 d,矿化结节形成同样有所减少。结论模拟微重力下,Rho A蛋白表达水平下调;抑制Rho激酶的表达,可降低h DPSCs矿化能力,提示Rho A-Rho激酶信号通路可能参与模拟微重力对h DPSCs矿化能力的影响。     

模拟微重力对人牙髓干细胞在裸鼠体内矿化能力的影响

目的:研究模拟微重力环境对聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)在裸鼠体内矿化能力的影响。方法:分离、培养hDPSCs并进行鉴定,然后将hDPSCs接种到PLGA支架上培养72 h后随机分为两组,普通重力组和模拟微重力组,经矿化诱导液培养1周后分别将细胞支架复合物移植到裸鼠体内,植入术后4周取材,进行组织学(HE和Vonkossa)和免疫组织化学(DSPP)检测。结果:HE染色均可见有血管生成,Vonkossa染色均为阳性,模拟微重力组DSPP的表达水平明显高于普通重力组(P<0.05)。结论:模拟微重力有利于hDPSCs在裸鼠体内的矿化。     

模拟微重力对人牙髓干细胞在PLGA支架上黏附影响的研究

采用酶消化法培养hDPSCs,并进行鉴定。将hDPSCs在模拟微重力条件接种于PLGA支架,接种细胞数分别为0.2×106、0.4×106、0.8×106、1.2×106个/支架,以常规条件接种作为对照组。接种24h后通过细胞计数检测细胞粘附率;扫描电镜(SEM)观察细胞形态。结果:模拟微重力条件接种组随接种细胞数的增多,黏附率显著升高(P<0.01),常规条件接种组黏附率略有降低(P<0.05);当接种细胞数为0.4×106、0.8×106、1.2×106/支架时,实验组高于对照     

沉默N-cadherin对人牙髓干细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨沉默N-cadherin对人牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）增殖和迁移能力的影响,为基于DPSCs的牙髓再生提供实验依据。方法采用N-cadherin sh RNA慢病毒转染DPSCs,q RT-PCR、Western blot检测N-cadherin的表达水平,验证沉默效率。实验分为阴性对照组（sh RNA-NC）和N-cadherin sh RNA沉默组。采用CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,Transwell法检测细胞迁移能力。结果N-cadherin sh RNA可显著降低DPSCs的N-cadherin m RNA和蛋白的表达水平（P<0.001）。N-cadherin sh RNA组细胞增殖活性分别在细胞接种的第3、4天高于sh RNA-NC组,第6～8天低于sh RNA-NC组,差异均具有统计学意义（P<0.05）;在第3天时,N-cadherin sh RNA组处于S期和G2期的细胞比例大于sh RNA-NC组（P<0.05）;在第6天时,N-cadherin sh RNA...     

模拟微重力培养环境下牙周膜干细胞生长状态的研究

目的探讨模拟微重力培养体系下人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,HPDLSCs）的生长特点。方法在体外用有限稀释法克隆化生长获得HPDLSCs,接种于葡聚糖微载体,观察在旋转微重力细胞培养环境下与普通重力环境下细胞生长状态的差异。结果利用克隆生长法成功获取具备多向分化潜能的HPDLSCs,在微重力环境下的微载体表面细胞多呈半球形,少数铺展为不规则扁平形或长梭形,与普通重力环境相比,细胞生长速度明显加快。结论三维微重力培养环境可以迅速获得大量的HPDLSCs,为构建工程化牙周组织奠定了实验基础。     

Satb2过表达对牙髓干细胞增殖和迁移能力的影响

目的:通过慢病毒介导Satb2(special AT-rich binding protein 2,Satb2)感染人牙髓干细胞(human Dental pulp stem cells,hDPSCs),观察Satb2过表达对人牙髓干细胞迁移和增殖能力的影响。方法:构建Satb2过表达慢病毒感染人牙髓干细胞,通过筛选得到稳定过表达Satb2细胞克隆。CCK8实验检测过表达Satb2对人牙髓干细胞的增殖能力的影响。划痕实验和Transwell细胞迁移实验观察细胞迁移能力的变化。免疫荧光染色观察细胞骨架微管的变化。结果:过表达Satb2的人牙髓干细胞相比对照组增殖能力增强(P＜0.05),微管更粗大,细胞的迁移能力增强。结论:过表达Satb2能使人牙髓干细胞的增殖和迁移能力增强。     

人牙髓干细胞在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物支架上粘附与增殖的研究

目的：研究成人牙髓干细胞（HDPSCs）在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）支架上粘附与增殖的情况。方法：采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,免疫组化法及体外诱导分化对细胞进行鉴定。将人牙髓干细胞与PLGA支架材料进行复合培养,扫描电镜（SEM）观察支架材料形态,细胞粘附、增殖及基质分泌情况;细胞计数检测其增殖力。结果：细胞接种2、5、10d,扫描电镜及细胞计数均显示HDPSCs与PLGA支架材料粘附紧密,生长状态良好,细胞明显增殖（P〈0.05）,有丰富的细胞外基质形成。结论：PLGA是一种适宜人牙髓干细胞粘附与增殖的支架材料。     

Functional and molecular characterization of transmembrane intracellular pH regulators in human dental pulp stem cells

ObjectiveHomeostasis of intracellular pH (pH_i) plays vital roles in many cell functions, such as proliferation, apoptosis, differentiation and metastasis. Thus far, Na⁺-H⁺ exchanger (NHE), Na⁺-HCO₃⁻ co-transporter (NBC), Cl⁻/HCO₃⁻ exchanger (AE) and Cl⁻/OH⁻ exchanger (CHE) have been identified to co-regulate pH_i homeostasis. However, functional and biological pH_i-regulators in human dental pulp stem cells (hDPSCs) have yet to be identified.DesignMicrospectrofluorimetry technique with pH-sensitive fluorescent dye, BCECF, was used to detect pH_i changes. NH₄Cl and Na⁺-acetate pre-pulse were used to induce intracellular acidosis and alkalosis, respectively. Isoforms of pH_i-regulators were detected by Western blot technique.ResultsThe resting pH_i was no significant difference between that in HEPES-buffered (nominal HCO₃⁻-free) solution or CO₂/HCO₃-buffered system (7.42 and 7.46, respectively). The pH_i recovery following the induced-intracellular acidosis was blocked completely by removing [Na⁺]_o, while only slowed (−63%) by adding HOE694 (a NHE1 specific inhibitor) in HEPES-buffered solution. The pH_i recovery was inhibited entirely by removing [Na⁺]_o, while adding HOE 694 pulse DIDS (an anion-transporter inhibitor) only slowed (−55%) the acid extrusion. Both in HEPES-buffered and CO₂/HCO₃-buffered system solution, the pH_i recovery after induced-intracellular alkalosis was entirely blocked by removing [Cl⁻]_o. Western blot analysis showed the isoforms of pH_i regulators, including NHE1/2, NBCe1/n1, AE1/2/3/4 and CHE in the hDPSCs.ConclusionsWe demonstrate for the first time that resting pH_i is significantly higher than 7.2 and meditates functionally by two Na⁺-dependent acid extruders (NHE and NBC), two Cl⁻-dependent acid loaders (CHE and AE) and one Na⁺-independent acid extruder(s) in hDPSCs. These findings provide novel insight for basic and clinical treatment of dentistry.