丙型肝炎病毒RNA高变区准种复杂性与干扰素疗效关系的初步探讨

目的探讨丙型肝炎病毒高变区1(HCV HVR1)准种复杂性与干扰素疗效的关系，为临床选择应用干扰素抗病毒治疗的适应症及预测疗效提供理论依据。方法采用基因芯片法进行HCV基因分型；采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析（SSCP）进行HVR1准种复杂性检测。结果治疗前HCV HVR1准种的SSCP条带数(复杂性)≤3者，经干扰素治疗后，HCV RNA阴转率为77.78％，＞3者HCV RNA阴转率为21.43％，两者差异具有统计学意义(P＜0.01)；治疗有效组SSCP条带数为2．44±0．73，无效组为4.50±0.65，两者差异具有统计学意义(P＜0.01) 结论感染HCV基因型lb型的慢性丙型肝炎患者HVR1准种复杂性程度越高，对干扰素无应答的可能性越大，是预测干扰素疗效的一个重要因素。     

HCV HVR1准种在不同基因型丙型肝炎患者中的分布

目的:通过研究丙型肝炎病毒高变区1(HCV HVR1)准种复杂性与基因型之间的关系,探讨不同基因型HCV致病性差异的机制.方法:采用C区型特异性引物PCR法进行HCV基因分型,采用单链构象多态性聚合酶链反应法(SSCP法)检测HCV HVR1准种.结果:68例丙型肝炎患者中,Ⅱ型49例(72%),Ⅲ型13例(19%),Ⅱ、Ⅲ混合型6例(9%).Ⅱ型和Ⅱ、Ⅲ混合型HCV感染患者的HCV HVR1准种复杂性(SSCP条带数)明显高于Ⅲ型感染的患者,且与疾病严重程度关系密切.结论:HCV HVR1准种复杂性的差异可能是导致不同基因型HCV致病性差异的因素之一.     

丙型肝炎病毒结构区基因变异的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）结构区主变异在HCV感染慢性化中的作用。方法：采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增HCV的C、E1及E2／NS1区核苷酸片断（1kb）,扩增产物进行克隆,以单链构象多态性（SSCP）／异质性双体分析（HDA）方法对每份血清中30个克隆的C／E1和E2／NS1区准种（Quasispecies）进行优化筛选,分析HCV急性感染者和持续性感染者血清种复杂性。结果：HCV的C／E1区和E2／NS1区增片段形成的SSCP条带间差异明显,但E2区形成的异质性双体与同源双体之间差距准种复杂性的增加与病毒持续性感染有关。     

丙型肝炎患者抗—NS5抗体与α—干扰素疗效关系的研究

目的：探讨丙型肝炎患者IgG抗－NS5抗体与α-干扰素疗效的关系。方法：以重组HCV抗原及NS3、NS5区段多肽作为抗原,以ELISA法检测丙型肝炎患者α-干扰素治疗前血清IgG抗－NS3、抗－NS5、抗－HCV抗体及其滴度。结果：α－干扰素治疗有效组的抗－NS5抗体的阳性率为80％（8／10）,无效组为20％（2／10）,两组比较有显著差异（P＜0．05）;有效组抗－NS5抗体滴度显著性高于无效组（P＜0．05）;有效组和无效组抗－NS3、抗－HCV本阳性率及抗体的滴度无明显差异（P＞0．05）。结论：治疗前血清IgG抗-NS5抗体可以作为α-干扰素疗效的一个预测指标。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

干扰素治疗丙型肝炎疗效预测因素的研究

目的：探讨能预测干扰素疗效的因素。方法：分别应用引物特异PCR法、信号引物能量转移技术、薄板层析技术、放免法及APAAP免疫桥联酶标法检测20例慢性丙型肝炎HCV基因型及干扰素治疗前后血清HCV－RNA水平，β2微球蛋白，2′－5′寡腺苷酸合成酶活性及外周血淋巴细胞亚群。结果：（1）疗前HCV－RNA量低者及治疗和随访过程中HCV－RNA量持续降低者对干扰素治疗反应好。（2）HCV－Ⅲ型患者对干扰素安全应答率高于HCV－Ⅱ型，P＜0.05。（3）疗前2′－5′寡腺苷酸合成酶活性低者对IFN治疗反应好。（4）治疗前后血清β2微球蛋白水平无显著变化，疗前不同应答组β2微球蛋白水平也无显著差异。（5）治疗后外周血CD3^ ,CD4^ 及CD4^ /CD8^ 升高，完全应答组疗前CD3^ ,CD4^ 及CD4^ /CD8^ 较部分应答组高，但无统计学差异。结论：IFN治疗前HCV－RNA水平、HCV基因型、2′－5′寡腺苷酸全盛酶活性测定可作为预测IFN疗效的指标。治疗期间及随访过程中血清HCV－RNA水平变化对IFN疗效评价有重要意义。疗前β2微球蛋白水平及淋巴细胞亚群检测不能作为预测IFN疗效的指标。     

丙型肝炎病毒基因型及其病毒RNA定量与干扰素疗效的关系

目的：探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV)基因型及HCV RNA量与干扰素（interferon,IFN)疗效的关系。方法：应用特异引物聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR)法并利用信号引物能量转移技术对20例慢性丙型肝炎患者进行HCV基因分型及IFN治疗前后血清HCV RNA定量检测。结果：HCV－Ⅲ型患者对IFN孤完全应答率高于HCV－Ⅲ型（P＜0．05）;治疗前血清HCV RNA低水平者,完全应答率高,且完全应答组血清HCV RNA量明显低于部分应答及无应答组（P＜0．01）;治疗结束时3组血清HCV RNA量较治疗前均有明显下降,但停药后半年,部分应答及无应答组血清HCV RNA量均回升至治疗前水平,仅完全应答组保持治疗结束时的低水平状态。结论：治疗前血清HCV RNA量及HCV基因型可作为预测IFN疗效的参考指标;治疗及观察过程中血清HCV RNA量的变化对IFN疗效评价有重要意义。     

慢性丙型肝炎自然病程中丙型肝炎病毒准种演化及其临床意义

目的探究慢性丙型肝炎患者在自然病程中HCV准种变异、组成变化及其与病程的关系。方法对未接受特异性抗病毒
治疗的11名慢性丙型肝炎患者进行病程跟踪、血样采集、HCV病毒载量及主要肝功生化指标检测,并对HCV HVR1区进行基
因扩增、克隆和测序,所获得序列用于HCV准种变异、组成变化其病程的相关性分析。结果通过631克隆的序列测定与分析,
发现在慢性丙型肝炎自然病程中,HVR1的准种存在3种变化模式：稳定型、快变型和慢变型。感染者体内准种的平均遗传距
离、有意突变率均与主要肝功生化指标存在显著的负相关性,而与病毒载量不存在相关性。结论因个体差异、免疫选择压力不
同等原因,在慢性感染者体内HCV准种演化,随着病程进展,呈现不同的变化模式。鉴于准种平均遗传距离、有意突变率与肝
功生化指标之间的相关性,准种的演化可作为评价病情和病程预后的参考指标。
     

抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义

目的：构建抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法：根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后线性的pSilencer^TM 3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western  blotting印迹法鉴定 NS5A蛋白表达。结果：对重新构建的pSilencer^TM3.1-H1neoHCV  NS5A- R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4　348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的 NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒 NS5A蛋白在相对分子质量5　600处出现条带。结论：设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

HCV NS5b1b与1b混合感染指标在干扰素治疗中的应用

目的 :探讨丙型肝炎病毒 (HCV)感染的基因型及其与干扰素应答效果的关系。方法 :应用逆转录—聚合酶链反应 (RT PGR)技术对 2 69例肝炎病人血清进行HCVNS5b区基因片段扩增 ,并对 5 6例阳性PCR产物进行酶切分型 ,同时观察干扰素α 2b对其中 48例慢性丙型肝炎的疗效。结果 :HCV单纯 1b型感染、1b与 1b混合感染及 2a型感染对干扰素的应答率分别为 70 % (14 /2 0 )、9 5 % (2 /2 1)、71 4% (5 /7) ;其中完全应答分别为 45 % (9/2 0 )、4 8% (1/2 1)、5 7 1% (4 /7) ;部分应答分别为 2 5 % (5 /2 0 )、4 8% (1/2 1)、14 3 % (1/7)。 1b与 1b混合感染组同单纯 1b型及 2a型感染组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ,而单纯 1b型感染组与 2a型感染组比较无明显差异 (P >0 0 5 )。结论 :HCV单纯 1b型感染或 2a型感染者对干扰素敏感 ,而 1b与 1b混合感染者干扰素治疗效果极差 ,可作为预测干扰素疗效的一项新的重要指标     

Single-strand conformation polymorphism for analysis of genomic variability of hepatitis C virus nonstructure 5A region

OBJECTIVE To establish a convenient method to detect the genomic population with hepatitis C virus (HCV) at nonstructure 5A (NS5A) region and to determine the correlation between the genomic population complexity at NS5A region and disease stage.

METHODS The sera from 52 patients with chronic hepatitis C virus infections were analysed using single strand conformation polymorphism (SSCP). In the SSCP, an asymmetric polymerase chain reaction (PCR) was carried out on the 455 bp products of the first round PCR at the NS5A region and the number of band of single strand deoxyribonucleic acid (DNA) which reacted with complemental DNA probe specific for the NS5A region after gel electrophoresis was analyzed.

RESULTS In 90% patients with chronic persistent hepatitis, the bands of single strand DNA was limited to one, and in those with chronic active hepatitis or liver cirrhosis, two or more bands of DNA were frequently detected. In about half of patients with hepatocellular-carcinoma, three or more bands were found. The number of bands increased with the progression of liver disease. The multivariate analysis showed that the progression of liver disease was the independent factor of viral diversity (P < 0.025) and was not related to the age, sex, the route of infection and the titer of hepatitis C virus ribonucleic acid (HCV RNA).

CONCLUSIONS These results suggest that the genomic variability of HCV at NS5A region increases with the progression of liver disease, and this may be closely related to the clinical features of type C liver disease.

     

丙型肝炎病毒准种在单个核细胞和肝细胞内的分隔性分布

目的探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）对单个核细胞感染在ＨＣＶ感染慢性化中的作用。方法通过对ＨＣＶ高度变异区（ＨＶＲ）基因的体外扩增后产物的直接测序,比较慢性丙型肝炎和接受肝移植的肝硬化患者血清、外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）、肝脏相关的单个核细胞（ＬＡＭＣ）和肝脏中ＨＣＶ准种（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）的分布。结果（１）３例肝移植和５例慢性肝炎患者ＰＢＭＣ中的主要ＨＣＶ准种不同于肝脏中的ＨＣＶ;（２）３例患者的ＰＢＭＣ和ＬＡＭＣ中ＨＶＲ有不同的基因替代;（３）ＨＶＲ基因的核苷酸突变主要位于Ｅ２基因的前５０个氨基酸内。结论（１）单个核细胞中的ＨＣＶＲＮＡ是由于ＨＣＶ的感染所致;（２）ＨＣＶ准种在肝细胞和单个核细胞中的分隔性分布可能与ＨＣＶ感染的慢性化密切相关。     

HCV基因型混合感染与干扰素疗效关系的初步探讨

目的了解丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)基因型与干扰素(interferon,IFN)疗效的关系,探索影响IFN疗效的指标。方法采用型特异性引物PCR法进行基因分型,Fisher'sexact法分析IFN的疗效。结果1b与1b 2型患者IFN疗效间差异无显著性,HCV1b感染者与合并HBV感染的HCV1b患者IFN疗效间差异无显著性。结论HCV1b患者IFN的疗效与其是否合并HCV2或HBV感染无关。     

淮北市HCV感染者基因亚型分布特征及1b型天然耐药突变分析

目的：分析淮北市HCV感染病人基因亚型分布特征及1b型天然耐药突变情况，为HCV临床抗病毒治疗和感染防控提供依据。方法：选取2019-2022年就诊于淮北矿工总医院住院的HCV感染者(未经任何DAAs治疗)HCV-RNA阳性血清样本，抽提RNA后逆转录，采用巢式PCR扩增NS5B、NS5A及NS3/4A区域基因序列，产物送交测序公司测序。采用Mega11.0软件对测序结果进行序列比对分析。结果：结果 HCV 1b型(68.63%)为主要亚型，2a型次之(29.41%),此外检出3a型2例(1.96%)。HCV亚型的分布与性别、年龄无明显相关(P>0.05),1b型多见于≥55岁年龄组中。RASs主要类型为：NS5B区C316N(100.00%);NS5A区Q54H(40.47%),Y93H(19.05%);NS3/4A区Q86P(30.88%),I71V+Q86P(19.12%),V170I+Q86P(14.71%)及T72I/A+Q86P(13.24%)。其中突变频率较高的RASs依次为：C316N(100.00%)、Q54H(60.00%)、Q86P(53.78%)、Y93H...     

Evolutionary study of hepatitis C virus envelope genes during primary infection

Background Hepatitis C virus (HCV) envelope genes encoding glycoproteins E1 and E2 exhibits a high degree of variability that gives rise to differing phenotypic traits; including alterations in receptor-binding affinity and immune recognition and escape. This study aims to elucidate the relationship of the evolutionary patterns for HCV envelope glycoproteins to viral persistence.Methods HCV quasispecies were characterized in specimens collected every two to six months from a cohort of acutely HCV-infected subjects. We evaluated two individuals who spontaneously cleared viremia and three individuals with persistent viremia by cloning 33 1-kb amplicons that spanned E1 and the 5’ half of E2; including hypervariable region 1 (HVR1). To detect representative variants for sequencing thirty-three cloned cDNAs representing each specimen were assessed by a method that combined analysis of a single-stranded conformational polymorphism (SSCP) method and heteroduplex analysis (HDA). For each patient, the rates of both synonymous and nonsynonymous substitutions for the E1, HVR1 and E2 regions outside HVR1 were evaluated. The amino acid sequences and predicted antigenic profiles were analyzed. Results The genetic diversity within HVR1 was consistently higher than that in the E1 and E2 regions outside HVR1 in individuals with persistent viremia, but did not change markedly over time in those with clearance of viremia. For individuals with persistent viremia, the rate of nonsynonymous substitutions within the HVR1 region predominated and gradually increased, compared to that in the E1 and E2 regions outside HVR1. By contrast, the rates of both nonsynonymous and synonymous substitutions for the E1 and E2 regions, including HVR1, were consistently lower in individuals with clearance of viremia. HVR1 had a higher antigenic variable and lower positive charge in subjects with persistent viremia. All cysteine residues and N-linked glycosylation sites, some of which were known to play a major role in protein folding and others play a role in HCV entry,were 100% conserved among the sequenced cloned cDNAs from the two outcome groups. Conclusion HCV persistence may be associated with positive selection pressures on HVR1, rather than functional constraints in the envelope region.     

HCV HVR1序列差异与丙型肝炎细胞因子间的相关性分析

目的:研究HCV HVR1氨基酸序列间的差异性以及此差异与细胞因子间的相关性。方法:以81例丙型肝炎病人氨基酸序列为材料,分组后利用生物信息学的手段分析氨基酸序列与丙型肝炎患者三种细胞因子表达量间的相关性。结果:样本的细胞因子IFN与IL-10量的差异与样本序列差异在所有分组中都具有相关性。结论:在病理变化过程中,如果IFN、IL-10的量具有显著差异,可以在一定程度上推测样本致病蛋白序列发生差异,即IFN、IL-10可作为病情恶化的标志指标。