PCR-RFLP检测Apo CIII基因T-455C多态性的反应条件优化

目的:探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)反应体系中各种成分的优化,建立检测载脂蛋白CIII(Apo CIII)T-455C多态性的方法。方法:采用PCR-RFLP检测ApoCIII基因T-455C多态性,同时通过对参与反应体系的成分,在一定范围内设置不同的浓度或参数组,进行正交试验和单因素逐项试验,观测各成分在不同条件下对结果的影响。结果:Apo CIII基因检测到3种基因型。PCR反应体系中不同模板含量、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、退火温度和酶切体系中PCR产物量、内切酶量、酶切时间等对反应结果均有不同程度的影响。结论:该研究建立的PCR-RFLP体系检测Apo CIII基因T-455C多态性技术,是一种高效快速、简单敏感、准确可靠的分析方法,适合常规实验室开展。     

ApoC-Ⅲ启动子C-482T和T-455C单核苷酸多态性与2型糖尿病的相关性探析

目的:分析探究2型糖尿病与Apo C-Ⅲ启动子C-482T和T-455C单核苷酸多态性的相关性。方法:选择2012年9月-2014年9月在本院接受治疗的50例2型糖尿病患者作为试验组,并选取同期50例接受健康体检的正常人作为对照组,分别检测两组Apo C-Ⅲ启动子C-482T和T-455C单核苷酸多态性,对比分析两组C-482T、T-455C基因型与等位基因之间的频率情况及T-455C与C-482T各基因型间Apo C-Ⅲ的浓度情况。结果:两组C-482T、T-455C等位基因C含量与T含量比较差异均无统计学意义(P0.05)。试验组T-455C与C-482T各基因型的Apo C-Ⅲ浓度与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。对照组-482TT基因型的Apo C-Ⅲ浓度高于其-482CT基因型的Apo C-Ⅲ浓度,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:2型糖尿病的发病与Apo C-Ⅲ启动子C-482T和T-455C单核苷酸多态性之间并不存在相关性,但健康人体内的C-482T多态性与其血清Apo C-Ⅲ水平的变化之间存在一定的联系。     

PCR-RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C/G多态性的实验研究

目的为研究PCR—RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C／G多态性的最适实验条件．方法对主要影响因素设系列浓度梯度进行PCR后观察电泳结果，设置不同的体系对RFLP方法进行了研究．结果最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．6μmol／L；最经济有效的酶切体系为12μL体系中加4μL产物用3U的酶消化．结论最佳的实验条件的摸索是进行大批量实验研究的关键．     

利用荧光定量PCR研究载脂蛋白C Ⅲ基因多态性与冠心病的相关性

目的分析探讨人载脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）基因多态性与脂代谢异常和冠心病的相关性。方法以400名健康献血者和360例冠心病患者为研究对象,经静脉采血后进行血生化检测和提取全血DNA,通过荧光实时定量PCR（FQ—PCR）,同时分析载脂蛋白CⅢ-625和-455位点变异与冠心病、血脂的关系。结果冠心病组载脂蛋白CⅢ-455C纯合子基因型（101例,70．1％）,明显高于对照组（85例,53．1％）,-625del-455c基因型（49．3％）显著高于对照组（41例,25．6％）。单纯高脂血症组和高脂血症并发冠心病组,载脂蛋白CⅢ-455C基因表达比较高。单纯冠心病组的载脂蛋白CⅢ-455c基因表达与正常组间差异无统计学意义。结论载脂蛋白CⅢ-455C基因与冠心病风险呈正相关,-455C纯合子基因型携带者具有冠心病的高风险。载脂蛋白CⅢ-625（del）与-455（C）有协同增加冠心病风险的作用。     

PCR-RFLP方法检测PARL基因Leu262Val多态性的实验研究

目的探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测PARL基因Leu262Val多态性的最适实验条件.方法在PCR实验中,运用降落PCR（touchdown PCR,TD-PCR）方法优化PCR条件;对引物终浓度设定0.8μmol/L、0.6μmol/L、0.4μmol/L和0.32μmol/L四个浓度梯度进行扩增;通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.在RFLP实验中,在内切酶量10 U不变的情况下,PCR产物量分别设定为5μL、10μL、15μL;酶切时间分别设定为12 h、8 h、4 h、2 h、1 h酶切,反应完毕后通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.结果 （1）降落PCR方法能有效降低或避免非特异性扩增;（2）引物浓度为0.4μmol/L时,PCR产物量高且引物二聚体较少;（3）10μL的PCR产物进行酶切,电泳结果清晰;（4）在37℃条件下酶切4 h能完全消化一个酶切体系中的PCR产物.结论 PCR实验中,TD-PCR优化了PCR条件,为扩增目的条带提供了快速、特异、可靠的方法,最适引物浓度为0.4μm/L;RFLP实验中,最有效酶切方案为20μL的体系中加10μL产物和10 U内切酶,37℃消化4 h.     

多药耐药基因1 C1236T多态性与癫痫患者对药物反应性的相关性

目的 了解多药耐药基因1(MDR1) C1236T多态性在癫痫患者中的分布,并探讨其与癫痫患者耐药的相关性。方法 选择70例难治性癫痫患者及88例对抗癫痫药物敏感的癫痫患者,提取其外周血DNA,应用多聚合酶链反应（PCR）扩增后继以限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析,检测基因MDR1的第12个外显子中C1236T的多态性。结果 两组病例的基因型频率和等位基因频率相比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 MDR1C1236T多态性与癫痫患者对抗癫痫药物反应没有相关性。     

PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性的实验条件研究

目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件.方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究.结果PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为:引物浓度为0.2μmol/L;Taq酶量为1.5 U;dNTP浓度为120μmol/L;Mg2 浓度为2.0 mmol/L.最经济有效的酶切体系为20μL体系中加4μL产物用2.5 U的酶消化9 h以上.结论最佳实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键.     

载脂蛋白CⅢ基因多态性频率分布及与高脂血症患者关系的研究

目的 探讨ApoCⅢ基因中,ApoCⅢ3175、ApoCⅢ3206基因型及等位基因频率及其与原发性高脂血症患者的相关性.方法 采用病例一对照相关性研究策略,选择昆明地区汉族作为研究对象,对91例高脂血症患者及76例健康对照者进行了上述基因多态性检测.结果 ①76例健康者中,ApoCⅢ3175位点的CC、CG、GG基因型频率分别是0.421、0.553、0.026;C和G等位基因频率分别是0.697、0.303.ApoCⅢ3206位点的GG、GT、TT基因型频率分别是0.671、0.276、0.053:G和T等位基因频率分别是0.809、0.191.②91例高脂血症患者中,ApoCⅢ 3175(CC、CG、GG)、ApoCⅢ 3175(GG、GT、TT)位点的基因型和等位基因多态性频率与对照组比较,差异无显著性意义(p>0.05).③昆明地区91例高脂血症患者中的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平在ApoCⅢ 3175、ApoCⅢ 3206各位点不同基因型间比较,差异无显著性意义(p>0.05).结论 昆明地区汉族健康人群ApoCⅢ 3175、ApoCⅢ 3206基因多态性有地区特征;该地区汉族高脂血症患者中的ApoCⅢ 3175、ApoCⅢ 3206基因多态性可能与高脂血症可能有一定关联.     

PCR—RFLP法检测骨钙素等位基因

目的：为骨质疏松症的多基因综合研究提供一种简便、实用、准确的骨钙素（osteocalcin,OC)等位基因检测方法。方法：采用聚合酶链反应（PCR）特异性扩增OC基因序列,扩增产物用限制性内切酶Hind Ⅲ酶切,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）酸性银杂后,观察酶切位点的限制酶片段长度多态性（RFLP）图谱。结果：应用PCR－RFLP法检测了77名健康汉族人OC基因型,hh、Hh、HH基因型分布频率分别为64％（49例）、32％（25例）、4％（3例）。结论：该方法简便、准确、重复性好,适用于一般实验室及流行病学调查。     

多巴胺D4受体基因和5-HT2C受体基因与海洛因依赖

目的探讨多巴胺D4受体基因外显子Ⅲ VNTR多态性和5-HT2C受体基因cys23/ser23多态性与海洛因依赖的关联.方法采用聚合酶链式反应(PCR)技术,对102例海洛因依赖者和64例正常对照者的多巴胺D4受体基因外显子Ⅲ VNTR多态性进行检测,同时采用PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术,检测5-HT2C受体基因cys23/set23多态性分布.结果海洛因依赖组多巴胺D4受体基因外显子Ⅲ VNTR多态性的基因型和等位基因型的频率与对照组无显著差异,5-HT2C受体基因的set23等位基因频率仅为0.9%.结论未发现海洛因依赖与多巴胺D4受体基因外显子ⅢVNTR多态性相关联,在中国汉族人未发现5-HT2C受体基因cys23/ser23多态性.     

耐异烟肼结核分枝杆菌katG基因突变快速筛选的研究

目的：建立结核分枝杆菌（MTB）katG基因点突变的筛选方法，了解结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）的状况。方法：采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）技术，对8株耐INH的临床MTB分离株、16株对INH敏感的临床分离株及MTB标准株H37Rv的katG基因，进行聚合酶链（PCR）反应扩增katG基因片段，再用Msp I内切酶分别对PCR产物进行消化反应。如果有315位点AGC突变为ACC，则将增加一个切点。结果：检测到8株耐药株中有7株增加了一个Msp I内切酶切点，耐药株中katG基因点突变检出率为87．5％（7／8）；16株敏感株和标准株均无额外的Msp I内切酶切点。未发现katG基因序列的缺失。结论：katG基因点突变是MTB耐INH重要机理之一；用PCR－RFLP检测耐INH的MTB的katG基因点突变具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点。     

多巴胺D4受体基因和5—HT2C受体基因与海洛因依赖

目的 探讨多巴胺D4受体基因外显子Ⅲ VNTR多态性和5－HT2C受体基因cys23/ser23多态性与海洛因依赖的关联。方法 采用聚合酶链式反应（PCR)技术,对102例海洛因依赖者和64例正常对照者的多巴胺D4受体基因外显子Ⅲ VNTR多态性进行检测,同时采用PCR结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术,检测5－HT2C受体基因cys23/ser23多态性分布。结果 海洛因依赖组多巴胺D4受体基因外显子Ⅲ VNTR多态性的基因型和等位基因型的频率与对照组无显著差异,5－HT2C受体基因的ser23等位基因频率仅为0．9％。结论 未发现海洛因依赖与多巴胺D4受体基因外显子Ⅲ VNTR多态性相关联,在中国汉族人未发现5－HT2C受体基因cys23/ser23多态性。     

临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌gyrA基因突变的研究

目的：检测临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌DNA促旋酶gyrA基因突变情况。方法：收集临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌30株及敏感株10株，测定其对萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)；用聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因部分片断，对PCR产物进行限制性片断长度多态性(PCR—RFLP)及单链构象多态性(PCR—SSCP)分析，检测gyrA突变情况。结果：30株耐喹诺酮菌株都检测到gyrA基因突变，PCR—RFLP均显示两条不同于敏感株的电泳带，其PCR—SSCP则检测到4种不同于敏感菌的迁徙率条带；而10株敏感菌均未检测到gyrA基因突变。结论：阴沟肠杆菌对喹诺酮类药物耐药性与gyrA基因突变有关，gyrA基因第83位氨基酸密码子突变可能为其耐药的主要原因。     

基于FOK1酶体系的PCR防污染法及在产前诊断中的应用

目的：建立一种有效、实际操作强的聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）防污染法并用于产前检测叶酸利用能力。方法：在1条引物的5′端加入限制性内切酶FOK1的识别序列,将FOK1酶加入PCR扩增反应体系中,切断污染的前PCR产物,考察体系中FOK1酶的用量、酶切扩增一体式反应体系成分的比例及污染量的可控程度,并应用于亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR）基因上C677T突变位点的分析。结果：FOK1酶最佳反应体系却抑制PCR扩增;在TaKaRa反应体系中,0.5 U FOK1酶可完全切割≤0.1 μL含有酶切位点的前扩增产物,且成功扩增,而不加入FOK1酶无法控制假阳性结果。FOK1酶切防污染法成功用于MTHFR C677T的测序检测。结论：本方法有效便捷,完全实现了闭管防止PCR污染,不影响后续测序反应,不仅可适用于以PCR扩增为基础的产前诊断等测序分析,更可广泛应用于所有涉及核酸扩增诊断的实验室防治PCR污染中。     

基质金属蛋白酶9C1562T基因突变频率的检测

目的：建立一种简便、准确、实用的人基质金属蛋白酶9C1562T基因突变频率的检测方法,并了解汉族人基质金属蛋白酶9C1562T基因的分布特点.方法：115例广东籍汉族人血样本取自2004年9月广州医学院卫生所体检的正常人,应用聚合酶链反应（PCR）特异性扩增人基质金属蛋白酶9C1562T基因序列,扩增产物用限制性内切酶SphⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切位点的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱.结果：运用PCR-RFLP法检测了115名广东籍汉族人基质金属蛋白酶9基因C1562T点突变,其中野生型纯合子频率为87.83%,杂合子频率为10.43%,突变型纯合子频率为1.74%.突变等位基因频率为0.0694.结论：该方法简便、快速、准确,适合于一般实验室检测及大规模的人群调查,汉族人基质金属蛋白酶9C1562T基因的分布与其他地区人群的分布无明显差异.     

儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因多态性研究

为分析中国汉族人儿茶酚胺氧位甲基转移酶 (COMT)基因多态性 ,用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术分析了 53名正常中国汉族人COMT基因 1 94 7位点的多态性 ;并对NIaⅢ内切酶酶切后有异常带出现的标本PCR产物直接进行序列分析。发现中国汉族人COMT基因的A 1 94 7位点的频率为 0 .2 8;基因型G/G、G/A与A/A的频率分别为 0 .51 ,0 .4 2和 0 .0 7;并发现了C1 883/G和G1 966/T 2个多态性位点     

中国人群非综合征性唇腭裂TGFA基因Taq I多态性研究

目的：探讨转化生长因子-α（TGFA）与中国人群非综合征性唇腭裂（NS－CL／P）的关系。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）结合限制性内切酶酶切（RFLP）方法，对103名健康体检者和124名非综合征性唇腭裂患者进行TGFA基因多态性检测。PCR后直接用限制性内切酶酶切检测基因多态性。结果：单侧唇裂伴腭裂和双侧唇裂伴腭裂均与正常对照组有显著性差异。而单侧唇裂和单纯性腭裂与正常对照组无显著性差异。有家族史患者与无家族史患者等位基因频数在统计学上无显著性差异。结论：中国人群非综合征性唇腭裂TGFA基因中存在Taq I多态性位点，TGFA TaqI位点与中国人群非综合征性唇腭裂相关。     

幽门螺杆菌空泡毒素基因分型

目的：探寻幽默门螺杆菌（Hp）基因分理方法。方法：用自行设计的引物对16株临床分离Hp和2株标准菌的空泡毒素基因vaeA进行扩增,用7种限制性内切酶对基因扩增产物进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析;对18株Hp VacA活性进行检测。结果：18珠Hp的VacA扩增产物达2.7kb左右,但并不完全相同;HeaⅢ酶切电泳可将18株Hp的VacA基因分为12种谱型。未发现与VacA表达相关的谱型。结论：VacA基因的PCR产物经HeaⅢ酶切RFLP分型可作为Hp基因分型较理想的选择,但不能反映毒素活性的表达情况。     

广西地区壮、汉族人群apoCⅢ基因多态性研究

目的：研究广西壮、汉族人群载脂蛋白CⅢ（apocⅢ）基因多态性，以获得广西壮、汉族人群apocⅢ基因频率分布资料。方法：以apocⅢ基因为候选基因。应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）方法检测114例汉族人和107例壮族人的apocⅢ基因型。结果：广西壮、汉族人群S1和S2等位基因的频率分别为0．706比0．772比0．772和0．294比0．228（P＞0．05）。结论：广西壮、汉族人群apoⅢ基因多态性无显性差别。     

人载脂蛋白CⅡ成熟肽编码基因的克隆

目的：克隆人载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）成熟肽编码基因。方法：以人基因组DNA为模板，利用聚合酶链反应（PCR）分别扩增ApoCⅡ成熟肽的编码基因外显子3和外显子4，继而采用外显子拼接法。以两种扩增产物为模板再次进行PCR，得到246bp的人ApoCⅡ基因编码片段。将ApoCⅡ基因编码片段重组入载体pUC18，并进行序列测定。结果：PCR扩增得到ApoCⅡ基因编码片段．经测序证实重组人载体pUC18中的ApoCⅡ编码片段的序列与Genbank中所检索到的编码序列完全一致。结论：利用外显子拼接法完成人ApoCⅡ成熟肽基因编码片段的克隆，为基因工程研制有生物活性蛋白提供了可行的技术手段。