单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法:应用PCR方法从HSV-Ⅰ基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD.结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%.结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒.     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。     

hTFF2毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的 构建三叶因子2(hTFF2)的毕赤酵母表达载体.方法 从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF2 cDNA,用PCR方法扩增hTFF2基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pGAPZαA中,构建真核重组表达质粒pGAPZαA-hTFF2.结果 通过双酶切和基因序列分析确定插入pGAPZαA中的片段为hTFF2基因片段.结论 重组质粒pGAPZαA-hTFF2成功构建,为在真核细胞中高效表达hTFF2及下一步的功能研究奠定了基础.     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体的构建及序列测定

目的构建晚期糖化终产物受体(RAGE)、核因子-κB(NF-κB)反义RNA单／双基因共表达载体。方法从人脐静脉内皮细胞ECV304中提取总RNA,RT-PCR扩增RAGE基因片段；从糖尿病人外周血单核细胞提取总RNA,RT-PCR扩增NF-κB p65基因片段。分别克隆入PGEM-T载体，酶切鉴定阳性克隆。再经PCR反应获得多量的RAGE，NF-κB基因片段。反向插入双启动子真核表达载体pBud CE4．1。构建RAGE、NF-κB反义RNA单／双基因共表达载体。结果RT-PCR扩增出RAGE基因片段328bp，扩增出NF-κB p65基因片段364bp。测序分析证实目的基因片段正确反向插入3个重组载体。结论RAGE、NF-κB反义RNA单／双基因共表达载体构建成功。     

正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建正、反义hTERT基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的hTERT cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义hTERT基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的hTERT cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义hTERT基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

pGAPZαA/HD5酵母表达载体的构建

目的 利用分子生物学技术和方法将pGAPZαA质粒改建为带有人防御素5(HD5)基因的新型表达载体pGAPZαA/HD5,为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础.方法 PCR技术,以设计的引物P1/P2从克隆载体pMD18-T/HD5中扩增人防御素5基因片段,并将扩增出来的目的 基因和pGAPZαA质粒用EcoRI和XbaI双酶切后连接构成重组质粒,然后转化至E.coli Top10感受态细胞,筛选阳性克隆.最后对PCR及酶切鉴定含有目的 基因的克隆进行测序和电泳.结果 获得HD5基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的 基因的正确序列;电泳结果证明已将此片段克隆到pGAPZαA内.结论 成功构建了HD5基因的新型表达载体pGAPZαA/HD5.     

青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序

【目的】克隆青蒿鲨烯合酶基因,为基因工程改造青蒿打下基础。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)扩增、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析等方法。【结果】通过PCR扩增和RT-PCR扩增,分别获得3590bp及1257bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99％,氨基酸序列同源性为100％。【结论】成功克隆了青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA。     

小鼠β2m正义与反义RNA表达载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠β2微球蛋白基因(β2 microgbbulingene,β2m)正义及反义RNA表达载体,为研究降低细胞MHCⅠ类分子的表达作准备.[方法]从小鼠基因组获得的β2m克隆中以β2m-pSV2△HXgpt为模板,合成两对引物,采用常规PCR方法分别扩增出β2m引导区及其下游主要编码区,即外显子1及部分外显子2,然后利用重叠延伸法将两条片段拼接起来,再将其分别正向、反向插入载体pcDNA3,并进行限制性内切酶酶切鉴定及序列分析.[结果]构建出小鼠β2m正义和反义RNA表达载体pcDNA3-β2mSN及pcDNA3-β2mAN.[结论]克隆的正义及反义β2m经限制性内切酶酶切鉴定结果正确,测序分析结果与文献一致,从而为下一步降低移植排斥反应的体内外研究奠定了基础.     

编码大鼠ENPP1蛋白的cDNA克隆及重组腺相关病毒构建

目的：克隆编码大鼠外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ENPP1）的全长cDNA片段,构建ENPP1重组腺相关病毒载体（AAV-ENPP1）。方法：以大鼠血管平滑肌细胞mRNA为模板,通过RT-PCR扩增获得大鼠ENPP1基因大片段并克隆至pCDH载体中,经过EcoR I/Xho I酶切、连接、转化将该片段克隆至腺相关病毒载体pAAV-MCS中,酶切及DNA测序对阳性克隆进行鉴定。重组AAV-ENPP1经包装后转染目的血管平滑肌细胞,Western blot检测目的蛋白ENPP1的表达。结果：RT-PCR成功克隆出2 721 bp的大鼠ENPP1基因大片段,并最终获得测序正确的pAAV/ENPP1克隆,Western blot检测显示目的蛋白ENPP1的表达升高。结论：成功构建大鼠ENPP1重组腺相关病毒载体。     

人腺体激肽释放酶基因重组表达载体pPICZαChK2的构建

目的：构建人腺体激肽释放酶（hK2）基因的酵母表达载体。 方法：利用RT-PCR法从人正常前列腺组织中扩增出hK2基因,先将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析,然后将hK2基因亚克隆至酵母pPICZαC表达载体上,进行鉴定。 结果：获得一个核苷酸长度为738 bp的基因,同源比较结果表明,与GenBank（NCBI:AF188746）公布的hK2的基因序列有99%的同源性,序列分析表明有一个氨基酸出现变异。酶切表明hK2基因正确插入酵母表达载体pPICZαC。 结论：成功构建出hK2基因的酵母表达载体pPICZαChK2。     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的重组杆状病毒载体。方法 将目的基因（EGFP和GDNF）克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达。结果 目的基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达。结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染Sf9细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础。     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其表达

目的 构建针对人caspase-8 基因mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中caspase8的抑制作用.方法 化学合成针对caspase-8发夹状的RNA寡核苷酸,将其退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,RT-PCR测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果 成功地构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-C1和pSUPER-C2,并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase8基因的干涉作用,而且pSUPER-C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER-C2.结论 成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体,转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达.     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

狂犬病毒融合基因pVax-G/N的克隆

目的构建狂犬病病毒G基因和N基因的融合表达载体,为研究融合基因疫苗打下基础。方法利用分子生物学技术从质粒pVax-G中克隆出狂犬病毒G和N基因,经连接及鉴定成功后与酿酒酵母表达载体pYes2连接,并进行酶切及测序鉴定。结果融合基因pVax-G/N测序结果与预期完全符合。结论成功构建了融合表达载体pYes2-pVax-G/N,为进一步研究稳定、安全的狂犬病疫苗奠定基础。     

LZ-8基因克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

【目的】从灵芝中克隆LZ-8基因并在毕赤酵母表达系统中诱导表达LZ-8蛋白。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)法从赤灵芝的基因组DNA中扩增LZ-8基因序列,采用电激转化法将pPLZ8-X重组质粒转化到毕赤酵母中,PCR Southernblot法检测酵母是否转化LZ-8基因,十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并银染法观察蛋白在酵母中的差异表达。【结果】PCR Southern blot结果显示LZ-8基因已转化到酵母中;SDS-PAGE胶银染结果提示LZ-8蛋白在酵母中被诱导表达。【结论】免疫调节蛋白基因LZ-8在毕赤酵母表达系统获得了诱导表达。     

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果:PCR法获得了约1 810bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定

目的：制备大肠杆菌β-半乳糖苷酶（β- galactosidae）酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具有全酶活性的β-半乳糖苷酶。方法：以pSV-β- galactosidase control vector为模板设计引物,用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM-T-easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β-半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果：获得与pSV-β- galactosidase control vector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b-ED及pET20b-EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为14 000及116 000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论：成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β-半乳糖苷酶。