抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

A型肉毒毒素治疗眼睑痉挛的临床观察

目的观察A型肉毒毒素治疗眼睑痉挛的疗效。方法对40例眼睑痉挛患者进行局部多点注射A型肉毒毒素,评价其疗效。结果40例患者中,32例完全缓解(80%、),6例明显缓解(15%),2例部分缓解(5%),总有效率达100%。药物持续时间为2.5-6个月,无全身不良反应及过敏反应,局部反应轻微,短暂可逆。结论A型肉毒毒素局部注射治疗眼睑痉挛是一种安全、有效、简便、易行的方法。     

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的 从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(BoNT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成BoNT/A LC序列,克隆至pTIG质粒,转化BL21(DE3) plysS感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经“吸附-洗脱-扩增”程序淘选富集抗体并进行特异性筛选.PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性.结果 可溶性表达的BoNT/A LC占全菌蛋白的36.8％,纯化后蛋白纯度达99％.从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合BoNT/A LC蛋白.结论 该研究得到了两株特异性的BoNT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗.     

A型肉毒毒素治疗面肌痉挛的近远期疗效观察

面肌痉挛又称面部抽搐症,表现为阵发性半侧面部肌肉的不自主抽动,严重影响了病人的社会交往和生活质量。其病因不明,治疗方法众多,但疗效不一。我科自2001年始应用A型肉毒毒素治疗面肌痉挛,经过3年的临床观察及随访取得满意疗效,现报告如下。     

A型肉毒毒素治疗Meige综合征的临床疗效观察

目的观察A型肉毒毒素治疗Meige综合征疗效。方法病例分组，观察治疗组与对照组治疗前后痉挛强度的变化。结果治疗组总有效率达97．44％。对照组总有效率仅为56．25％。结论A型肉毒毒素治疗Meige综合征安全、有效。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

A型肉毒毒素治疗面肌痉挛40例疗效观察

目的观察A型肉毒毒素对面肌痉挛患者的治疗效果。方法对40例面肌痉挛患者进行局部注射A型肉毒毒素。在治疗前后对痉挛程度改善情况进行评定,并对药物的副作用进行观察。结果完全缓解32例,明显缓解6例,部分缓解2例。结论局部注射A型肉毒毒素可迅速缓解或消除面肌痉挛患者肌肉痉挛,提高患者的生活质量。     

A型肉毒毒素治疗慢性头痛的临床研究

目的：探讨慢性每日头痛采取A型肉毒毒素治疗的疗效。方法选取80例收治的CDH患者,根据治疗方式将入选的CDH患者分为对照组与实验组,分别给予醋酸泼尼松龙＋2％利多卡因治疗和A型肉毒毒素注射治疗,观察两组疗效。结果对照组临床有效率显著低于实验组（ P＜0．05）;在疼痛程度上,两组治疗30 d后,均显著降低（ P＜0．05）,对照组至90 d时又显著上升,至90 d时显著高于实验组（ P＜0．05）;在疼痛发作天数上,实验组在治疗30 d、90 d后均显著低于疗前（ P＜0．05）,而对照组仅30 d时与疗前比较差异性（ P＜0．05）,各时间段组间比较有差异性（ P＜0．05）。结论慢性每日疼痛采取A型肉毒毒素治疗,疗效显著,且作用更为持久,安全性可靠,具有借鉴价值。     

A型肉毒毒素治疗痉挛性斜颈20例临床观察

痉挛性斜颈是因颈肌的痉挛性或强直性不随意收缩而引起头部向一方强制性动作。以往对于该类疾病除理疗、针炙、按摩外，口服安坦氟哌啶醇等外，无其他较好的治疗方法．近年来，自开展A型肉毒杆菌毒素(BTXA)治疗后，疗效显著．方法简单，患者的痛苦少，是临床值得推广的一项新技术，现将近3年收治的20例患者应用BTXA治疗情况报告如下。     

基孔肯亚病毒中和单克隆抗体的筛选与鉴定

目的 :建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体细胞株 ,筛选具有中和活性的特异性单克隆抗体。方法 :利用细胞融合技术建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,用细胞培养中和试验初筛具有中和活性的单克隆抗体 ,用固定单克隆抗体稀释病毒方法进行乳鼠中和试验 ,进一步验证单克隆抗体的保护作用 ;用中和交叉试验鉴定中和单克隆抗体反应的特异性。结果 :用免疫荧光法检测建立了 9株能稳定分泌抗基孔肯亚病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,初筛出 4株具有中和活性的单克隆抗体 ,其中 1F1单克隆抗体稀释 2 0 0倍时可保护 50 %细胞不产生细胞病变 ;乳鼠中和试验1F1单克隆抗体中和指数为 10 3.3,对试验小鼠有较强的保护作用。中和交叉试验表明 ,1F1单克隆抗体只中和基孔肯亚病毒 ,与其他病毒无交叉反应 ,特异性较高。结论 :制备了 9株抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,筛选得到了 1F1具有较强中和活性的特异性单克隆抗体 ,可望为基孔肯亚病毒病的诊断、紧急预防与治疗提供良好试剂     

抗平颏海蛇短链神经毒素全人源单克隆抗体的筛选、制备及生物活性研究

目的 重组表达3种平颏海蛇短链神经毒素,利用噬菌体抗体库筛选制备全人源抗毒素单克隆抗体并评估其生物活性.方法 以重组表达纯化的神经毒素蛋白作为抗原,从自主构建的噬菌体抗体库中筛选获得噬菌体抗体,经序列测定确定其抗体类型后构建完整抗体.利用真核表达系统表达纯化抗体后鉴定其抗原结合活性、生化特性及药代动力学特性.在体内验证抗体药物的抗毒素作用.结果 经过4轮筛选,获得2株能同时结合3种神经毒素的噬菌体单链抗体,并将其制备成完整的抗体,进一步证实所获得的抗体可特异性结合3种抗原.2株全人源抗体均可拮抗神经毒素对昆明小鼠的致死作用.结论 利用重组神经毒素和噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗平颏海蛇短链神经毒素的全人源治疗性抗体.     

抗登革病毒单抗的独特型抗体的制备与鉴定

从19种抗登革病毒单克隆抗体(简称单抗)中筛选出4种具有中和活性的单抗。经过纯化免疫新西兰大白兔制备多克隆抗独特型抗体(Ab2)。制备的4种抗独特型抗体血清有很高的特异性,其中具有全交叉反应的3种单抗的抗血青中Ab2的水平较高。采用简便的去除抗血清中的同种型和同种异型抗体的方法,用夹心ELISA法检测Ab2的水平取得了满意的结果。     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体的制备、鉴定及其在抗原纯化中的应用研究

以从ＣＨＯ工程细胞培液上清初步纯化的尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｕＰＡ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过杂交瘤技术制备出１１株抗ｕＰＡ单克隆抗体，经特异性实验表明，这些抗体特异性地识别高分子量ｕＰＡ（５．４×１０￣４ｕ），与低分子量ｕＰＡ（３．３×１０￣４ｕ）有不同程度结合，但都不识别１．８×１０￣４ｕ的ｕＰＡ片段。它们与牛血清白蛋白、ＣＨＯ细胞上清液及组织型纤溶酶原激活剂都无交叉反应。１１株抗体分别针对５个不同的抗原决定簇。以单克隆抗体偶联的ｓｃｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱直接从培液上清纯化ｕＰＡ，并经ｓｅｐｈａｃｒｖ１Ｓ－２００分子筛进一步纯化，纯度达９５％以上，回收率为８５％，纯化倍数为１５７倍左右。     

抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的研制与鉴定

利用常规杂交瘤技术制备了２株抗人绒毛膜促性腺激素（ｈＣＧ）的杂交瘤细胞。ＥＬＩＳＡ结果表明，单克隆抗体ＩＤ５和４Ｄ５均与人ｈＣＧ有特异性反应，腹水效价分别为３．２×１０－５、６．４×１０－５，均属于ＩｇＧ１亚类。与人促卵泡激素（ｈＦＳＨ）和人促黄体激素（ｈＬＨ）的交叉反应呈阴性。免疫转印结果显示能识别相对分子质量为２４×１０３ｕ的ｈＣＧ－β链条带。亲和常数分别为１．０１×１０７Ｌ／ｍｏｌ、４．４３×１０７Ｌ／ｍｏｌ。     

抗大鼠HSP70蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

目的制备大鼠HSP70蛋白单克隆抗体并对其性质进行研究。方法利用PCR技术扩增大鼠全长hsp70,插入表达质粒pET-28a,pMAL-c2x,诱导表达,采用亲和层析纯化融合蛋白;用HIS-HSP70融合蛋白免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备大鼠HSP70单克隆抗体;采用Western印迹和免疫组化方法对抗体性质进行鉴定,ELISA方法确定抗体的表型。结果亲和层析纯化HIS-HSP70蛋白纯度在97.6%,获得6株可稳定分泌抗HSP70mAb的杂交瘤细胞系;抗体的亚类均是IgG1类κ链的。Western印迹结果显示6株单抗均能识别天然的大鼠HSP70蛋白;免疫组化结果显示3株抗体可以识别组织的HSP70蛋白。结论成功获得6株有活性HSP70单克隆抗体,可以识别HSP70蛋白不同表位,为进一步研究HSP70单克隆抗体在疾病中的作用奠定基础。     

抗河豚毒素单克隆抗体的制备及其抗毒效应

目的 :为制备高毒性的小分子生物毒素河豚毒素 (TTX)的单克隆抗体 (mAb) ,探讨TTX中毒免疫抗毒的可能性。方法 :以TTX为半抗原 ,与中国鲎血蓝蛋白 (TTH)化学偶联制备人工抗原 (TTX_TTH) ;并以其免疫BALB c小鼠。用杂交瘤技术制备抗TTX的mAb ,用竞争抑制酶免疫分析法测定mAb对TTX结合活性 ,以mAb与检测抗原的结合被抑制 5 0 %时的TTX浓度 (IC50 )表示mAb的结合反应性。对小鼠预防注射抗体 ,测试抗体对抗TTX中毒的效果。结果 :建立了 2株对TTX_BSA阳性反应的mAb(1E4和 3C11) ,均属IgG1 亚类 ;具有TTX结合活性 ,其IC50 值分别为 3.2× 10 _6 mol L和 9.9× 10 _7mol L ;亲和力常数 (Kaff)分别为 3.0× 10 6 L mol和 2 .8× 10 6 L mol。小鼠预防给予mAbs ,可对抗 1×LD的TTX攻毒 ,动物存活率 71% ;抗 1.5×LD时 ,1 3存活 ;抗毒效果好于小鼠抗血清对照。结论 :用新的TTX人工抗原成功地制备了抗TTX的mAb ,具有一定的体内预防抗毒效价。     

A型肉毒毒素联合氟尿嘧啶在瘢痕疙瘩手术治疗中的应用

 目的 探讨A型肉毒毒素联合氟尿嘧啶在瘢痕疙瘩手术治疗中的应用。方法 选取西京医院烧伤与皮肤外科2015-07至2017-07行瘢痕疙瘩手术切除的患者68例,随机分为观察组和对照组,每组34例。其中观察组术后注射A型肉毒毒素联合氟尿嘧啶,对照组术后注射曲安奈德,比较两组患者愈合的瘢痕美容评估与评级(scar cosmesis assessment and rating,SCAR)量表评分、温哥华瘢痕评分、瘢痕疙瘩复发率及患者满意度。结果 在SCAR量表评分[(7.46±1.26)分 vs (11.51±2.33)分]、温哥华瘢痕评分[(6.31±4.16)分 vs (9.37±4.82)分]、瘢痕疙瘩复发率(5.88% vs 23.53%)及患者满意度[(9.17±0.82)分 vs (6.62±1.16)分]方面,观察组均优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 瘢痕疙瘩手术后注射A型肉毒毒素联合5-氟尿嘧啶可减轻术后切口瘢痕,提高手术效果,复发率更低,患者更为满意,值得临床推广。