Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用研究

目的探讨Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用及其机制。方法通过RNA干扰降低Tim-3在巨噬细胞表面的表达,构建一种稳定低表达Tim-3的RAW264.7巨噬细胞系;以野生型及低表达Tim-3的巨噬细胞为研究对象,探讨Tim-3对巨噬细胞活性及表型的影响。结果将含Tim-3 siRNA及NC对照序列的载体经脂质体分别转染细胞系RAW264.7,以G418加压筛选,获得低表达Tim-3的巨噬细胞稳定株。功能实验显示,激活Tim-3通路促进了巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6。同时发现Tim-3通路可以影响CD80/CD86共刺激分子在巨噬细胞表面的表达,并进而影响巨噬细胞的抗原呈递功能,促进Th1、Th17细胞的极化。结论成功构建了重组载体Tim3 siRNA,建立了稳定低表达Tim-3的巨噬细胞系,初步研究结果提示Tim-3信号通路在促进TNF-α、IL-6分泌及调节巨噬细胞共刺激分子表达,促进Th1、Th17细胞分化中发挥重要作用。     

TGF-β3对辐射致肺上皮细胞损伤的保护作用及其机制研究

目的 探索转化生长因子-β3(TGF-β3)在辐射致肺上皮细胞损伤中的作用及其可能机制,为放射性肺损伤的防治提供实验依据。方法 设计合成并筛选Ⅱ型转化生长因子-β受体(TGFBR2)的小干扰RNA(siRNA),用于细胞TGFBR2干涉;将体外培养的人支气管上皮细胞(Beas-2B细胞)及其TGFBR2干涉细胞随机分为对照组、5 ng/ml TGF-β3处理组(TGF-β3组)、6 Gy⁶⁰Co-γ射线单次照射组(6 Gy组)、6 Gy⁶⁰Co-γ射线单次照射+5 ng/ml TGF-β3处理组(6 Gy+TGF-β3组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组胶原蛋白和TGFBR2的表达,RT-qPCR和Western印迹检测上皮间质转化(EMT)相关标志物平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期。结果 (1)TGF-β3对辐射诱发的细胞胶原蛋白表达增高有明显抑制作用,并可降低辐射所致细胞EMT相关标志物α-SMA基因和蛋白水平的异常高表达,有效保护辐射所致肺组织细胞纤维化改变;(2)TGF-β3可抑制...     

高原环境对大鼠桡骨骨折愈合过程中TGF-β1表达的影响

为探讨高原地区骨折愈合过程中转化生长因子β1（TGF－β1）的表达特点及其对骨折愈合的影响，建立高原大鼠单侧桡骨中段骨折模型，采用免疫组化－图像分析方法检测骨折愈合各阶段TGF－β1的表达。结果表明，在骨折愈合过程中，高原组大鼠TGF－β1的表达量较平原组低，其中3天组和3周组与平原组比较差异有显著性意义（P＜0．01）。提示高原环境影响成骨细胞等的增殖、分化，进而影响TGF－β1的表达，并最终影响到骨折的愈合。     

海水浸泡对腹部开放伤大鼠TGF-β1、VEGF蛋白及mRNA表达的影响

目的 观察海水浸泡对腹部开放伤大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA表达的影响.方法 成年健康Wistar大鼠60只,随机分为2组,其中腹部开放伤合并海水浸泡组40只,腹部开放伤对照组20只.腹部开放伤合并海水浸泡后0.5、1、2、3、4h应用免疫组织化学、核酸原位杂交和图像分析技术检测大鼠肺和肾组织TGF-β1和VEGF蛋白及mRNA表达水平的变化.结果 对照组在致伤后1h开始出现TGF-β1蛋白阳性表达,2、3和4h表达逐渐增强.海水浸泡组0.5h开始出现阳性表达,此后表达逐渐增强,4h时阳性表达量最高.TGF-β1 mRNA表达滞后于蛋白表达.两组均于致伤后2h开始出现VEGF蛋白阳性表达,3、4h表达逐渐增强.VEGF mRNA与蛋白表达同步且一致.结论 TGF-β1和VEGF蛋白及mRNA的高表达与损伤关系密切,可作为海水浸泡伤预后判断的指标.     

常通口服液对肠粘连大鼠血TGF-β1的影响

目的观察常通口服液对大鼠肠粘连模型血转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)水平的影响.方法 (1)选取54只SD雄性大鼠随机分为6组(n=9)正常对照组、模型对照组、四磨汤组、常通口服液低、中、高剂量组.除正常对照组外,其余大鼠均按Ellis法制备成肠粘连模型.正常及模型对照组予以蒸馏水ig(10ml·kg-1);四磨汤组以10m1·kg-1ig给药;常通口服液低、中、高剂量组分别按4.3、8.6、17.2g·kg-1ig给药.各组于术后第7d取血,酶联免疫吸附法(ELISA)测定TGF-β1水平.(2)选用SD雄性大鼠90只,随机分为2组,按Ellis法制备成肠粘连模型.给药方法及给药剂量同方法(1).常通口服液中剂量组与模型对照组于术后第1、3、5、7、9d采血,不同时间点各取血9只大鼠,并处死.测定TGF-β1水平.结果 (1)与正常对照组比较,模型对照组TGF-β1显著升高(P<0.001);与模型对照组比较,常通口服液中、高剂量组均能显著降低TGF-β1含量(P<0.05～0.01),而低剂量组TGF-β1含量无明显减少(P>0.05).(2)常通口服液中剂量组与模型对照组各个时间点相应比较,在术后第5、7、9d 3个时间点有显著性差异(P<0.01～0.001).结论常通口服液能降低TGF-β1水平.细胞因子TGF-β1在肠粘连形成中可能发挥一定作用.     

TGF-β3通过抑制上皮间质转化拮抗放射性肺纤维化

目的检测分析放射性肺纤维化过程中上皮间质转化（EMT）情况,探索转化生长因子β3（TGF-β3）是否通过EMT途径抑制放射性肺纤维化的发生。方法将180只C57BL/6雌性小鼠按体重完全随机分为对照组、单纯照射组（简称照射组）和照射+TGF-β3组（简称TGF-β3组）,照射组和TGF-β3组经20 Gy 60Co γ射线单次胸部照射后,分别腹腔注射0.5 mL 0.9%的生理盐水和TGF-β3（1 μg/kg）,每周1次,于照射后1、3和6个月活杀,用苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色后观察肺组织病理学改变,用免疫组化法检测肺组织EMT相关的上皮标志物紧密连接蛋白（ZO-1）和间质标志物N-钙粘蛋白（N-cadherin）的表达,用Mann-Whitney U秩和检验和Fisher确切概率法对结果进行统计分析。结果HE和Masson染色结果显示,照射能够引起小鼠肺泡壁增厚、肺泡间隔明显增宽、肺泡结构严重破坏、胶原纤维大量沉积等典型纤维化病理改变;照射后3和6个月,与照射组比较,TGF-β3组小鼠肺纤维化病变明显减轻,差异有统计学意义（Z=-2.562、-2.807,均P<0.05）,胶原沉积显著减少,差异有统计学意义（Z=2.442、2.529,均P<0.05）。免疫组化结果显示,与对照组比较,照射后1、3和6个月,小鼠肺组织ZO-1的表达量明显减少,差异有统计学意义（Z=4.492、5.831、6.064,均P<0.05）,N-cadherin的表达量显著增高,差异有统计学意义（Z=-3.269、-5.520、-6.063,均P<0.05）;与照射组比较,TGF-β3组ZO-1表达量显著增高,差异有统计学意义（Z=-2.881、-4.220、-5.695,均P<0.05）,而N-cadherin表达量显著减少,差异有统计学意义（Z=4.546、3.560、4.919,均P<0.05）。结论TGF-β3可通过抑制EMT拮抗放射性肺纤维化。     

熊果酸对TGF-β1诱导肝细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的 研究熊果酸(UA)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肝细胞凋亡的干预作用及其机制.方法 采用原位灌注法分离健康SD大鼠原代肝细胞,随机分成空白对照组、UA自身对照组(UA 25μmol/L)、TGF-β1组(TGF-β12.5ng/ml)、UA干预组(UA 25μmol/L+TGF-β12.5ng/ml)、DPI干预组(DPI 0.5μmol/L+TGF-β12.5ng/ml).药物作用相应时间后,采用流式细胞术检测肝细胞增殖及凋亡情况,荧光定量PCR法检测肝细胞内CD95(Fas) mRNA的表达,Western blotting检测肝细胞内CD95蛋白的表达以及NADPH氧化酶(NOX)亚基p47phox移位至胞膜的蛋白量,并采用活性氧(ROS)检测试剂盒检测肝细胞内ROS水平.结果 在TGF-β1刺激肝细胞前30min加入UA进行干预可明显降低TGF-β1诱导的肝细胞凋亡率(80.53％±1.56％vs 63.97％±3.19％,P＜0.01),肝细胞增殖指数明显增加(10.83％±2.03％vs 18.67％±1.60％,P＜0.01),细胞内CD95 mRNA及蛋白表达均明显下调(2.40±0.25 vs 1.28±0.15,P＜0.01;1.37±0.18vs 1.05 ± 0.15,P＜0.05),p47phox向膜移位明显减少(1.76±0.22 vs 1.13±0.12,P＜0.01),肝细胞中ROS水平明显降低(3.23±0.53vs2.12±0.45,P＜0.01).结论 UA可能通过抑制肝细胞内NOX激活,减少ROS产生,下调CD95的表达来抑制TGF-β1诱导的肝细胞凋亡.     

鹿瓜多肽对去卵巢大鼠骨密度及松质骨中TGF-β1表达的影响

目的:鹿瓜多肽对去卵巢大鼠骨密度及松质骨中TGF-β1表达的影响。方法:将30只雌性SD大鼠,随机分为假手术(SHAM)组、去势(OVX)组、去势 鹿瓜多肽(OVX CCP)组。术后20周测各组大鼠骨密度(BMD),利用免疫组织化学法观察各组大鼠松质骨中TGF-β1表达。结果:①OVX组与SHAM组相比较,松质骨中TGF-β1阳性细胞灰度值升高(P<0.05),CCP治疗组较OVX组灰度值降低(P<0.05);②与SHAM组相比,OVX组BMD明显降低(P<0.01);CCP治疗组各部位BMD高于去势组(P<0.05);结论:鹿瓜多肽注射液可以增加去势大鼠松质骨中TGF-β1的表达,抑制和延缓骨质疏松的形成,对雌激素缺乏引起的骨质疏松有预防作用。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA和蛋白表达的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对肺泡巨噬细胞Toll 样受体(toll-like receptor,TLR2/4)基因和蛋白的影响,为探讨骨髓MSCs移植对早期炎症介质的影响及炎症级联反应的调控机制做铺垫。 方法 巨噬细胞分为PBS对照组、骨髓MSCs对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对照组和LPS+骨髓MSCs处理组,各组均取1,3,6,12 h时相点。流式细胞仪检测骨髓MSCs表面标记阳性细胞率和巨噬细胞TLR2/4蛋白的表达;RT-PCR方法检测各组不同时相点巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达变化;ELISA法检测各组不同时相点上清液中TNF-α浓度变化。 结果 与PBS对照组、骨髓MSCs对照组比较,LPS对照组巨噬细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.01),1h时开始增高,12h时达到峰值;同时TNF-α浓度也明显增高(P＜0.01),6h时TNF-α浓度达到峰值。与LPS对照组比较,LPS+ MSCs组巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),TNF-α浓度也降低(P＜0.01)。 结论 LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达升高,TNF-α浓度也升高,后者峰值时间出现略早,说明TLR2/4表达与TNF-α之间存在一个正反馈环;骨髓MSCs可以明显降低LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达及TNF-α浓度,说明骨髓MSCs打破了上述正反馈环。     

β3肾上腺素能受体激动剂对小鼠巨噬细胞胞葬的影响

目的 探讨β₃肾上腺素能受体(β₃ adrenoceptor,β₃ AR)激动剂对小鼠巨噬细胞胞葬的影响及其可能机制。方法 (1)紫外线照射诱导Jurkat细胞凋亡。紫外线分别照射Jurkat细胞60、75、90 min后,以Annexin V-FITC/PI标记,运用流式细胞仪检测Jurkat细胞凋亡率。(2)构建巨噬细胞胞葬模型。以荧光探针分别标记RAW264.7细胞和Jurkat细胞,将紫外线照射后凋亡Jurkat细胞加入巨噬细胞中共培养,构建巨噬细胞胞葬模型。运用流式细胞术分别比较加药组和对照组巨噬细胞胞葬率。(3)检测β₃ AR及胞葬相关分子mRNA表达水平。运用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)进一步检测对照组和1μmol/L β₃ AR激动剂组β₃ AR及胞葬相关分子mRNA表达水平。结果 (1)与对照组比较,紫外线照射60、75、90 min后Jurkat细胞晚期凋亡率均显著升高[(8.17±1.27)%vs(39.7±14.63)%...     

TGF-β分子及其靶向药物研究进展

转化生长因子-β(TGF-β)为一类调节细胞生长和分化的重要细胞因子,在多种肿瘤的发生、浸润和转移过程中发挥重要作用.该文综述了TGF-β的结构、功能及作用机制,以及用于肿瘤治疗的TGF-β靶向药物的研究进展,通过全面梳理TGF-β作为肿瘤免疫治疗靶点的潜能,将为抗肿瘤药物的研发和临床应用提供参考.     

TGF-β分子及其靶向药物研究进展

转化生长因子-β(TGF-β)为一类调节细胞生长和分化的重要细胞因子,在多种肿瘤的发生、浸润和转移过程中发挥重要作用.该文综述了TGF-β的结构、功能及作用机制,以及用于肿瘤治疗的TGF-β靶向药物的研究进展,通过全面梳理TGF-β作为肿瘤免疫治疗靶点的潜能,将为抗肿瘤药物的研发和临床应用提供参考.     

TGF-β1在放射性肺损伤中的促纤维化作用及其机制

转化生长因子β1（TGF-β1）是一种重要的成纤维细胞因子,其表达水平能反映肺纤维化的严重程度。放射性肺损伤（RILI）包括早期的放射性肺炎（RP）和晚期的放射性肺纤维化（RIPF）。RP向RIPF发展的过程中伴随着TGF-β1表达水平的升高。了解及掌握TGF-β1在RP和RIPF发生、发展过程中的分子机制,对于RILI的防治具有重要意义。笔者就TGF-β1在RILI发生过程中的促纤维化作用及其机制进行综述。     

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导的大鼠肺泡巨噬细胞iNOS表达及NO生成的影响

目的探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和一氧化氮(NO)生成的影响。方法体外培养大鼠巨噬细胞NR8383,分别加入LPS(终浓度1μg/ml)和不同浓度(10-10、10-8和10-6mol/L)的CCK-8进行干预,并设空白对照组(加入PBS)和丙谷胺干预组(丙谷胺终浓度2μg/ml,CCK-8浓度10-8mol/L,LPS浓度1μg/ml)。各组细胞培养24h后收集上清液,Griess法检测NO含量;取培养24h后的细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR法检测iNOS基因表达情况;裂解培养24h后的细胞,离心取上清,生化法检测细胞内iNOS活性。结果 LPS可明显促进大鼠肺泡巨噬细胞iNOS的表达和NO的生成;预先加入不同浓度的CCK-8均可抑制LPS诱导的iNOS mRNA水平上升和活力增强,减少NO生成,且呈现剂量依赖性(P<0.05或P<0.01)。CCK受体拮抗剂丙谷胺可逆转CCK-8的抑制作用。结论 CCK-8可能通过降低LPS诱导的肺泡巨噬细胞iNOS表达和NO产生来实现其对内毒素休克动物的保护效应。     

芪参煎剂抗C57小鼠lewis肺癌转移及其对TGF-β表达的实验研究

肿瘤转移的发生不仅取决于肿瘤细胞自身的生物学特性。同时宿主的免疫状态也是重要的影响因素之一。现代中药药理研究证实，一些中药能调节机体免疫状态，发挥生物反应调节剂（biological response modifier，BRM）作用。其机理之一就是可能逆转转化生长因子β（TGF-β）对LAK、NK与TIL细胞等的免疫抑制，从而加强免疫监控功能，预防或减少肿瘤转移。为了探讨中药复方芪参煎剂对肺癌转移的疗效及其对细胞免疫功能的影响，我们观察了对lewis小鼠肺转移癌的抑制作用。     

TGF-β1成熟肽基因克隆及在大肠杆菌中表达

为在原核中表达TGF－β1单体蛋白，用基因重组技术构建pBV220-TGF-β和pQE-TGF－β两种原核表达载体，分别在M15和DH5α大肠杆菌中进行表达，然后利用Sephacryl S-100凝胶层析及Ni^ -NTA琼脂柱纯化TGF－β1单体，经酶切鉴定及测序结果证明pBV220和pQE30载体上成功地插入了TGF－β1成熟肽基因片段，pBV220-TGF－β和pQE-TGF－β两种原核载体在大肠杆菌中均得到了高效表达，表达量约占全菌蛋白的15％和20％，表达的TGF－β1单体蛋白经纯化后进行SDS－PAGE电泳，均显示了一条蛋白带，分子量分别为13kD和15kD左右。     

血清细胞因子TGF-β1和IL-1β表达水平对急性放射性心脏损伤发生的影响

目的 研究胸部肿瘤放射治疗患者血清TGF-β1和IL-1β水平对急性放射性心脏损伤发生的影响。方法 接受常规适形或调强放疗的胸部肿瘤患者54例,PTV处方剂量为50~66 Gy,分析靶区剂量分布及危及器官受量。患者于放疗前及放疗结束后空腹采肘静脉血,应用酶联免疫吸附法检测血清中TGF-β1和IL-1β水平,并分别在放疗前后和放疗开始90 d内检测心肌酶、肌钙蛋白Ⅰ、心电图以及心功能指标评价患者心脏损伤状况,对急性放射性心脏损伤分级标准进行评价。分析血清TGF-β1和IL-1β水平对急性放射性心脏损伤的影响。结果 放疗前患者血清TGF-β1为(888.4±41.1)μg/L,放疗结束时为(926.1±23.1)μg/L,差异有统计学意义(t=-6.479, P<0.05);放疗后发生急性放射性心脏损伤患者血清TGF-β1为(900.6±34.5)μg/L,高于无急性放射性心脏损伤患者的(865.7±47.0) μg/L,差异有统计学意义(t=-2.646,P<0.05)。Spearman相关分析显示,TGF-β1放疗前基础水平、放疗前后差值与急性放射性心脏损伤相关(r=0.378、0.311,P<0.05)。患者放疗前与放疗结束时的血清IL-1β比较差异无统计学意义;放疗后发生急性放射性心脏损伤者与未发生急性放射性心脏损伤者血清IL-1β基础表达水平差异无统计学意义。患者放疗前IL-1β基础水平、放疗后表达水平、放疗前后差值与急性放射性心脏损伤无相关性。放疗前、后TGF-β1的表达水平与放疗后IL-1β的表达水平呈正相关(r=0.416、0.389,P<0.05)。结论 放疗后血清TGF-β1升高,放疗前基础表达水平及放疗前后差值与急性放射性心脏损伤相关。IL-1β与放射性心脏损伤无相关性。     

Tim-3抗体的生物学活性及应用研究

目的：制备抗人Tim-3单抗并评价其生物学活性,为干预Tim-3表达失调引发的疾病提供实验基础。方法制备重组人Tim-3蛋白,常规方法免疫BALB/c小鼠,筛选出阳性克隆,并对其识别、中和活性进行体内外验证,探讨其作为免疫干预手段的可行性。结果①获得一株能够分泌具有较好结合活性的抗人Tim-3单克隆抗体细胞株（克隆号L3D）,其分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a;②流式实验结果表明,该抗体能够结合人U937细胞上的Tim-3分子,且与小鼠RAW 264．7细胞上Tim-3有一定的交叉结合活性;③该抗体能够阻断Gal-9分子诱导的人THP1细胞凋亡,具有良好的体外中和活性;④体内注射L3D,显示该抗体能够显著加重脓毒血症模型小鼠病情,提高炎性因子的表达水平,显示出其良好的体内中和活性。结论成功制备一株分泌抗人Tim-3抗体的细胞株,其良好的结合及中和活性为基于Tim-3表达异常相关疾病的干预提供了实验基础。