用Red系统敲除大肠杆菌O157∶H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157∶H7的突变体。方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5′端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除。结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7突变菌株。结论:为进一步研究EHEC O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7Ⅲ型分泌系统的缺陷突变株对HeLa细胞黏附能力的影响

目的：构建O157∶H7 EDL933菌株Ⅲ型分泌系统（ T3SS）缺陷突变株ΔescR,感染HeLa细胞后检测其黏附能力。方法通过重叠延伸PCR扩增出中间为卡那霉素抗性基因,两侧为escR基因上下游同源序列的重组线性DNA片段,电击转入含pKD46的EDL933感受态细胞中,escR基因被kan基因替换而缺失。绘制野生株与ΔescR生长曲线,并利用免疫荧光观察两株细菌对HeLa细胞的黏附能力。结果获得缺陷突变株ΔescR,相较于野生株,该突变株在DMEM（10％FBS）培养基中生长速度以及对HeLa细胞的黏附能力明显下降。结论 T3SS结构蛋白escR基因的缺失破坏了EDL933 T3SS的形成,影响了该菌株黏附能力,其构建为后续研究T3SS奠定了基础。     

经聚乙烯亚胺钝化的荧光碳点负载阿霉素抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移侵袭的治疗研究

目的研究利用经聚乙烯亚胺（PEI）钝化的荧光碳点（CD）装载阿霉素（DOX）进行药物递送,旨在增加DOX对非小细胞肺癌的治疗作用,减少DOX的心肌毒性。 方法通过一步微波加热法将甘油和PEI的混合物制备成CD-PEI,并通过静电效应将DOX装载至CD-PEI。采用CCK8实验检测CD-PEI-DOX对非小细胞肺癌细胞A549的增殖能力的影响;Transwell实验评估CD-PEI-DOX对A549细胞迁移侵袭能力的影响;最后通过体内动物实验评估CD-PEI-DOX的心肌毒性以及对非小细胞肺癌皮下肿瘤生长的抑制效果。 结果体外细胞实验证实,对比单纯的DOX处理组,CD-PEI-DOX对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭能力的抑制作用更为显著。体内实验证实,CD-PEI-DOX纳米复合物治疗组小鼠心肌细胞结构完整,并且能有效抑制小鼠皮下肺癌肿瘤的生长。 结论经PEI钝化的荧光碳点负载阿霉素能显著提高DOX对非小细胞肺癌的治疗效果,并减少DOX对心脏的毒性作用。运用CD-PEI纳米颗粒改善化疗药物递送的治疗方案取得了初步证实,这可为肺癌化学治疗提供新思路,具有广大的临床应用前景。     

基于上转发光免疫层析技术的常见食源性致病菌快速检测方法研究与评价

目的：研制针对4种常见食源性致病菌：甲型副伤寒沙门菌（ Salmonella paratyphi A）、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）、大肠埃希菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的基于上转发光免疫层析技术（ UPT－LF）的快速定量检测试纸,并对其检测性能进行评价。方法以上转发光纳米颗粒（ UCP－NPs）作为示踪物,基于双抗体夹心检测模型,研制针对上述4种靶标菌的UPT－LF试纸;以4种靶标菌的系列浓度标准菌悬液作为标准样品,评价试纸的敏感性、特异性、线性和精密性,并进行模拟染菌食品的检测,评价模拟样品阳性检出率。结果针对4种靶标菌的UPT－LF试纸均具有良好的线性,相关系数r为0．985～0．996;检测敏感性达105～106 CFU／ml,与其他近缘菌株无交叉反应;对乳制品、饮料、小食品、水产、肉类等细菌污染的食品检出率较高。结论该研究建立的对4种常见食源性致病菌进行快速检测的UPT－LF,简便快速,具有良好的敏感性、特异性和线性定量能力,操作性能可满足食品安全检测的要求。     

量子点的表面修饰、表征及其活细胞成像研究

目的 通过对疏水性量子点表面进行亲水性改造并偶联单克隆抗体,制备免疫荧光探针用于细胞荧光标记示踪.方法 将牛血清白蛋白(BSA)作为乳化剂分子对疏水性量子点进行表面亲水性改造,检测亲水性改造后的量子点物理特性,采用MTT法测定其对细胞活力的影响.将亲水性改造后的量子点与trastuzumab偶联,对HER-2阳性乳腺癌细胞进行实时荧光成像检测.结果 经亲水性改造后的量子点粒径约70nm,分布较均一;在不同离子强度和pH环境中,仍保持良好的发光性能和胶体稳定性;生物相容性佳,未检测到明显细胞毒作用;经表面偶联肿瘤特异性单克隆抗体后,成功地对HER-2阳性乳腺癌细胞进行了长时间的活细胞跟踪成像研究.结论 亲水性量子点可通过选择性偶联抗体获得免疫量子点荧光探针,从而对细胞、组织等进行特异性荧光成像和检测.     

基于细胞表面特异识别的荧光标记小分子抗体的鉴定及其应用

 目的 建立基于细胞表面特异性识别的荧光标记小分子抗体的鉴定方法并应用于食管癌外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)检测。方法 本研究前期利用噬菌体技术高通量筛选富集到单链噬菌体抗体NFC 20b和NFC 70a,标记荧光后,观察在斑马鱼体内与食管癌细胞的聚集示踪,并用于检测食管癌患者的外周血CTCs;同时通过高通量蛋白组芯片对抗原蛋白表达谱进行分析。结果 荧光小分子抗体NFC 20b和NFC 70a于不同时间点,在斑马鱼的背主动脉、尾动脉和尾静脉中均能观察到抗体分布,与空白组和阴性抗体组相比,两抗体与移植瘤结合荧光更强;用蛋白芯片筛选抗原蛋白表达谱,初步确定NFC 20b结合的抗原蛋白为细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)。结论 荧光标记的小分子抗体可以通过血液循环分布到斑马鱼的卵黄囊,并能与移植瘤有明显的聚集结合效应,可以用于检测食管癌患者外周血CTCs;利用蛋白芯片技术可以辅助鉴定抗体所结合的抗原种类。