副溶血弧菌致食物中毒56例

1997年8月,某部发生一起经粪培养和血清学证实的副溶血性弧菌(嗜盐菌)致食物中毒56例。1　临床资料1.1　一般情况　56例均为男性,年龄22～26岁。1997年8月15日晚在本单位食堂集体就餐,所进食物为红烧肉、酸菜鱼、空心菜,次日凌晨2时许至19日相继出现头痛、乏力、发热、腹痛、腹泻、恶心、呕吐等症状56例,其中发热39例,最高体温达39.8℃,恶心、呕吐6例,腹泻呈稀水样或糊状29例,里急后重7例,经对症支持治疗3～4d后,有20例出现心率缓慢,其中50～59/min6例,40～49/min9例,34～40/min5例,2例伴心慌、胸闷、头晕。1.2　实验室检查　白细胞为(7～13…     

副溶血弧菌肠炎91例

海产食品常因被副溶血弧菌污染而引起食物中毒 ,也可通过皮肤引起伤口感染或侵入血流引起败血症[1] 。为提高对本病的认识 ,将我院 2 0 0 1年收治的副溶血弧菌肠炎 91例特点分析如下。1　临床资料1 1　一般情况　男 6 0例 ,女 31例 ;年龄 13～ 70岁 ,平均 2 8 8岁。均经大便培养鉴定证实为副溶血弧菌肠炎。有明确不洁饮食史 4 0例。其中食用海鲜类食物后发病 36例。均有腹泻 ,每日大便多于10次 19例 ,5～ 10次 5 2例 ,5次以下 2 0例。伴发热 4 2例 ,呕吐 5 7例 ,腹痛 81例 ,里急后重 2 0例。1 2　实验室检查　黄色黏液便 4 5例 ,黄色稀水样…     

盐度和温度对副溶血弧菌运动能力的影响

目的：研究盐度和温度调节副溶血弧菌（ Vibrio parahaemolyticus）的运动能力。方法将副溶血弧菌接种于不同盐度（0．5％、1．0％、2．0％和4．0％）的爬动和泳动平板上,37℃静置培养4．5 h后,通过比较不同盐度条件菌苔直径的差异来判定盐度对运动能力的影响。接种副溶血弧菌至含2．0％盐的爬动和泳动平板上,并分别置于37℃和26℃静止培养4．5 h后,通过比较不同温度下菌苔直径的差异来研究温度对运动能力的影响。结果与结论副溶血弧菌爬动不受盐度的影响,而其泳动与盐度呈正相关,2．0％时达到极值,4．0％时稍微下降;与26℃培养的结果相比,37℃培养时爬动和泳动均显著增强。这些结果表明盐度和温度能够调节副溶血弧菌的运动能力。     

拟核结合蛋白H-NS调控副溶血弧菌vp1667的转录

目的 研究副溶血弧菌H-NS对vp1667的转录调控机制.方法 提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对vp1667的转录调控关系;采用引物延伸实验研究vp1667的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对vp1667的调控关系;将vp1667的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入Δhns和WT中获得LacZ菌株.通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对vp1667的调控关系.PCR扩增vp1667的启动子区序列并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS对vp1667启动子区是否具有直接的结合作用;采用DNaseⅠ足迹实验研究His-H-NS对vp1667启动子区的具体结合位点.结果与结论 引物延伸结果显示,vp1667只有一个转录起始位点T(-28)(翻译起始位点为+1),且其转录活性受H-NS的抑制;EMSA和DNaseⅠ足迹实验结果显示,His-H-NS不能结合到vp1667的启动子区,表明H-NS只能间接抑制vp1667的转录.     

评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型的建立与应用

 目的建立评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型,并以此评价副溶血弧菌临床分离株RIMD2210633株与其重要致病相关基因opaR基因敲除株的毒力。方法以Raw-264细胞为靶细胞,RIMD2210633株及其opaR基因敲除株为效应细胞,通过优化条件,利用CytoTox96Non-RadioactiveCytotoxicityAssay建立细胞模型。结果以5倍于靶细胞的菌量感染靶细胞,37℃孵育1.5h,离心所得上清稀释10倍后,加底物液避光显色10min,反应条件最佳。opaR基因敲除后,菌株的Raw-264细胞毒性升高,并有统计学差异。结论利用副溶血弧菌标准强毒株RIMD2210633菌株建立了评价副溶血弧菌毒力的RAW-264细胞模型,并利用此平台比较了该毒株与其opaR基因敲除株的毒力,为研究副溶血弧菌的致病机制奠定了基础。     

多重荧光定量PCR法检测食品中的沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌

目的 建立一种可同时检测沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR技术。方法 利用沙门菌invA毒力基因、副溶血弧菌gyrase基因和金黄色葡萄球菌Sa442基因的特异性引物、探针,建立多重荧光定量PCR反应体系,完成特异性、敏感性评价,并用该法与国标法进行40份留样食品的检测比较。结果 各对引物、探针均能扩增出目标靶序列,3种检测通道无交叉干扰,对非目标菌无扩增信号,对沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的核酸检测限均达到102拷贝/μl;用多重荧光定量PCR法在40份食品样本中检出3份金黄色葡萄球菌阳性样本,其中1份国标法检测为阴性,其他样本检测结果完全一致。结论 建立了一种针对沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法,该方法具有良好的特异性与敏感性,可为食品安全提供技术支持。     

多重环介导等温扩增快速检测沙门菌、副溶血弧菌和单核细胞增生性李斯特菌方法的建立

目的：建立能够同时检测沙门菌、副溶血弧菌（VPH）和单核细胞增生性李斯特菌（LM）的多重环介导等温扩增（mLAMP）方法。方法分别针对沙门菌 bcfD 基因、VPH 的 tlh 基因和 LM的 iap 基因设计 mLAMP 引物,以LAMP 进行单重 LAMP 检测。实时浊度监测扩增结果,优化引物浓度配比,进而建立此3种食源性致病菌的mLAMP 检测体系,以 PCR 检测灵敏性作为比较,进行特异性和灵敏性分析。结果实时浊度监测表明,该 mLAMP体系具有良好特异性,可在45 min 内一次性检测以上3种致病菌,且无非特异扩增产生。这3种菌的检测最低限分别为300 fg／μl、4．2 pg／μl 和4．5 pg／μl,与 PCR 检测灵敏度相当。结论该多重 LAMP 可同时检测食品中的沙门菌、VPH 和 LM,可作为大规模样品的初筛或传统方法的辅助方法,用于快速判定样品中是否含有这3种致病菌。     

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种快速检测副溶血弧菌的实时荧光定量PCR方法.方法 根据副溶血弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针,利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血弧菌实时荧光定量PCR检测方法.结果 以副溶血弧菌DNA为模板克隆了tdh基因,得到阳性质粒.利用阳性质粒建立了定量PCR方法,得到标准曲线y=-4.9197x+58.72,决定系数(R2)为0.9864.此方法具有很好的特异性,在对15种肠道致病菌的检测中,只有副溶血弧菌基因组DNA的扩增结果为阳性.对粪便和食物模拟标本进行检测,敏感性均为102cfu/μl.此方法重复性较好,对4种浓度(105、104、103、102cfu/μl)的菌液各进行3次检测,结果均为阳性,且Ct值的变异系数＜2%.结论 建立了一种检测副溶血弧菌的荧光定量PCR方法,该法的敏感性和特异均较好,适用于快速、准确地检测食品和粪便中的沙门菌.     

亚洲副溶血弧菌临床菌株的基于碱基序列和肽链序列的多位点序列分型研究

目的：了解来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株的群组结构和克隆复合体构成。方法在 pubMLST 公共数据中筛选具有完整 ST 型及 pST 型的来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株数据,进行亚群分析和克隆复合体分析,并分别构建基于 ST 型和 pST 型的最小生成树。结果从数据库中共筛选到具有 ST 型及 pST 型的来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株数据341条,共含有157个 ST 型,以 ST3型为最多。其中有214条菌株数据来自中国（包括港台地区）,覆盖了133个 ST 型,其中仍以 ST3型为最多。利用 eBURST 软件对数据进行分析,共发现了17个组,94个单体。STRUCTURE 软件分析显示,来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株的适宜亚群数为7,各亚群内的样品平均距离为0．9113。结论来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株具有高度多态性,可细分为7个亚群,MLST 分型时以 ST3型为多,AA-MLST 分型时以 pST2型为主。     

t-PA突变体乳腺表达载体的构建及其在乳腺中的瞬时表达

目的 :探索建立乳腺瞬时性表达系统 ,用于快速检测所构建的乳腺表达载体的有效性 ,为进行转基因动物实验奠定基础。方法 :DNA常规操作 ;孕小鼠乳腺注射 ;纤维蛋白琼脂糖平板法检测Mut PA。结果 :构建了含有Mut PA基因的乳腺表达载体pB3mt PA ,将此载体直接注射到孕小鼠乳腺中进行暂时性表达 ,产仔后第 4天采乳汁 ,用纤维蛋白琼脂糖平板法检测t PA的活性 ,表达活性可达 2 0～ 4 0U/ml,其活性能被天然的t PA多克隆抗体所中和 ,表达持续期 8d。结论 :所克隆的牛BLG基因 70 5bp的 5′端调控序列包含了必需的调控元件 ,并具有调控外源基因的表达的功能 ,克隆的 3′端序列是适合的。构建的表达载体可用于制备转基因动物。     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记（SILAC）技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

海水环境创伤弧菌感染的病理学研究

目的观察总结海水环境中感染创伤弧菌（vibrio vulnificus，Vv）后局部组织和器官的病理学特点，为临床Vv感染的诊治提供一定的实验依据。方法128只SPF级昆明小鼠，随机分成4组，每组32只，分别为海水Vv菌液浸泡组（A组）、等渗盐水Vv菌液浸泡组（B组）、单纯无菌海水浸泡组（c组）以及单纯无菌致伤组（D组）。每组又随机分成0，6，12，24h4个不同时间组，每组8只。D组小鼠仅无菌致伤，A、B、C组小鼠在无菌致伤后按分组设计均浸泡于相应液体中45～60min。于不同时段对各组局部肌组织及主要脏器组织进行取材、制片、HE染色和观察；采鼠尾血进行Vv的分离培养。结果A组创伤组织的损伤最为严重：0h时，可见肌纤维变性、溶解和断裂，但炎症反应不明显；12h时肌组织溶解坏死更加明显，肌间隙增宽，渗出及出血明显，并伴有大量中性粒细胞浸润；24h时，肌组织大片溶解坏死，微脓肿形成。总体来讲，Vv感染的A、B两组要比未感染的c、D两组病变严重，而组织修复过程也要缓慢。海水菌液浸泡组脱离浸泡后24h时仍无好转趋势，并且该组部分小鼠Vv血培养结果为阳性。Vv血培养阳性的小鼠其主要脏器也出现不同程度的损伤，以肺和肾脏的广泛出血性损伤为主。结论在海水环境中Vv经由皮肤伤口侵入后，其伤口往往表现为感染早、发展快且病变严重的特点。感染组织病理学特点为组织大片的溶解坏死和大量中性粒细胞浸润并伴有脓腔形成；Vv可经伤口人血，引发败血症，并导致小鼠肺、肾等多脏器的损伤。     

霍乱弧菌O139实时荧光PCR检测方法的建立及应用

目的：建立检测霍乱弧菌O139的实时荧光PCR检测方法，为霍乱弧菌0139的检测提供快速、敏感、特异的检测手段。方法：用复合探针法荧光PCR检测技术，检测0139特异基因——编码糖基转移酶的基因。结果：本方法特异性好，检测非0139肠道菌均无响应；灵敏度高，可检测低至10CFU的细菌；重复性较好，批间批内变异系数均小于3％。对采自浙江省0139霍乱弧菌感染患者的335份标本进行检测，共有133份为阳性，而采用常规细菌培养法，仅检测出90份阳性。结论：本方法的建立为霍乱的诊断提供了又一有效手段。