利用CRISPR/Cas9系统构建HeLa细胞Cdc25C基因敲除稳定细胞株

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类宫颈癌细胞HeLa中的细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C)基因,构建Cdc25C基因稳定敲除细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别Cdc25C基因第一外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选稳定敲除Cdc25C基因细胞株,再用免疫印迹方法鉴定细胞Cdc25C敲除效果.最后用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响.结果 筛选出稳定敲除Cdc25C基因细胞株,且Cdc25C敲除显著影响G2/M期进程.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源Cdc25C基因敲除细胞株,为研究Cdc25C在细胞周期进程的功能以及相关癌症的发生奠定了基础.     

利用CRISPR/Cas9系统构建HepG2细胞THRAP3基因敲除细胞系

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7核酸内切酶筛选出切割效率最高的载体,构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HepG2细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选细胞株,挑取单克隆,再用PCR、测序等方法鉴定细胞基因型,免疫印迹方法鉴定细胞THRAP3敲除效果.使用高通量测序的方法进行基因表达分析.用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响,CCK-8试剂盒检测细胞增殖.结果 成功构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒,筛选出特异性敲除THRAP3基因的细胞系,验证了THRAP3敲除对细胞周期以及细胞增殖的影响.结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建并获得了THRAP3基因敲除细胞系并初步探究了THRAP3基因功能.     

内源性MGF在IGF-I Pre-mRNA选择性剪接中的作用

目的利用CRISPR/Cas9敲除小鼠成肌细胞系C2C12机械生长因子(mechano-growth factors,MGF),研究MGF在IGF-I pre-mRNA选择性剪接和C2C12增殖分化中的作用。方法针对IGF-I第五个外显子设计并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒,通过细胞转染并筛选出MGF发生移码突变的细胞株。采用RT-q PCR技术,检测这些细胞株MGF和IGF-IEa表达变化,以及细胞增殖和肌向诱导分化能力的变化。结果成功构建了针对MGF的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并筛选出3株MGF移码突变细胞株。这些细胞株的MGF和IGF-IEa表达上升,细胞增殖活性减弱,在诱导分化过程中,肌细胞标志性基因myogenin、MGF和IGF-IEa表达升高。结论内源性MGF敲除能够影响IGF-I pre-mRNA的选择性剪接以及增殖分化能力。     

内源性MGF在IGF-Ⅰ Pre-mRNA选择性剪接中的作用

目的 利用CRISPR/Cas9敲除小鼠成肌细胞系C2C12机械生长因子(mechano-growth factors,MGF),研究MGF在IGF-Ⅰ pre-mRNA选择性剪接和C2C12增殖分化中的作用.方法 针对IGF-Ⅰ第五个外显子设计并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒,通过细胞转染并筛选出MGF发生移码突变的细胞株.采用RT-qPCR技术,检测这些细胞株MGF和IGF-IEa表达变化,以及细胞增殖和肌向诱导分化能力的变化.结果 成功构建了针对MGF的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并筛选出3株MGF移码突变细胞株.这些细胞株的MGF和IGF-IEa表达上升,细胞增殖活性减弱,在诱导分化过程中,肌细胞标志性基因myogenin、MGF和IGF-IEa表达升高.结论 内源性MGF敲除能够影响IGF-Ⅰ pre-mRNA的选择性剪接以及增殖分化能力.     

应用CRISPR/Cas9技术构建MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株

目的 运用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术,构建线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,研究MAVS对细胞生长的影响.方法 针对MAVS基因第一外显子设计小向导RNA(sgRNA),构建pX459-sgRNA重组质粒.然后利用嘌呤霉素筛选ZR-751 MAVS基因敲除的阳性克隆,Western印迹检测MAVS基因敲除情况,提取克隆基因组进行测序鉴定.平板克隆实验检测MAVS被敲除后对细胞增殖的影响,再利用MTS实验检测在DFX培养基刺激下,MAVS对细胞死亡的影响.结果 Western印迹结果说明ZR-751细胞株内MAVS已完全敲除;且在凋亡诱导剂DFX刺激下,MAVS被敲除后促进细胞增殖.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,初步实验提示MAVS抑制乳腺癌细胞生长,为后续研究MAVS在肿瘤中的功能奠定了基础.     

高尔基体膜蛋白GP73小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰GP73细胞株的筛选

目的构建高尔基体膜蛋白73（Golgi membrane protein 73,GP73）小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,筛选出稳定干扰GP73的细胞株。方法根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对GP73的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo＋gfp上,经测序分析正确后,质粒命名为psiGP73。用脂质体转染质粒到肝癌细胞系HepG2中,经G418加压筛选稳定表达GP73 siRNA的细胞株,用免疫印迹检测质粒对内源GP73的干扰效果,将干扰效果好的细胞株命名为HepG2/siGP73。用MTT法检测GP73被干扰下调后对细胞增殖的影响。再通过贴壁非依赖性生长试验检测GP73被干扰下调后对细胞贴壁非依赖性生长的影响。结果免疫印迹结果证实构建的psiGP73质粒能够有效干扰细胞内源GP73的表达。GP73被干扰下调后,HepG2细胞的增殖速度降低,在软琼脂中克隆形成减慢。结论成功构建了表达GP73 siRNA的质粒psiGP73,筛选出稳定干扰GP73表达的细胞株HepG2/siGP73,为深入研究GP73在肝癌发生中的作用提供了平台。     

NCAPH基因敲除对胰腺癌细胞增殖迁移及侵袭能力的影响

目的 探究NCAPH基因敲除对胰腺癌PANC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法 利用Oncomine数据库分析NCAPH在胰腺癌及其他癌组织中的表达水平;Kaplan-Meier plotter数据库分析NCAPH高低表达与胰腺癌患者预后的相关性;使用CRISPR/Cas9技术构建NCAPH基因敲除慢病毒建立NCAPH基因敲除细胞株;通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验及划痕实验检测敲除NCAPH基因对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,Western blotting检测MEK及ERK等蛋白的表达。结果NCAPH在胰腺癌、胃癌、结直肠癌及结肠癌组织中的表达均显著上调。Kaplan-Meierplotter数据库分析显示,NCAPH高表达组胰腺癌患者的预后不良(P<0.05);Western blotting检测结果显示,CRISPR/Cas9基因编辑技术能有效敲除胰腺癌PANC细胞系的NCAPH基因,从而抑制NCAPH蛋白的表达。CCK-8实验及克隆形成实验结果显示,与对照组相比,NCAPH敲除明显抑制了PANC细胞在48、72、96及120 h的增殖能力(0...     

利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除BMDM巨噬细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除骨髓衍生巨噬细胞系(BMDM),为研究Nedd4在巨噬细胞中的作用和机制奠定基础.方法 利用在线软件筛选了评分较高的3个针对Nedd4基因的单向导RNA(sgRNA),然后将合成的sgRNA序列插入到PX330质粒中;将重组质粒转入BMDM细胞,通过有限稀释法获取单克隆,采用Western印迹检测单克隆细胞中NEDD4蛋白水平;通过序列测定确认单克隆细胞的DNA序列.结果 通过Western印迹检测获取1株NEDD4蛋白缺失的BMDM细胞;测序结果表明该细胞系中Nedd4基因发生了16 bp的缺失突变.结论 利用CRISPR/Cas9技术构建的Nedd4敲除BMDM细胞系将成为研究Nedd4在巨噬细胞中的功能和机制的有力工具.     

Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化

目的：利用CRISPR／Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞（ HCT116细胞）中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系,检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒,进行慢病毒包装,感染HCT116细胞,嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平,筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒正确,蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强,Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系,便于后期Apak功能的研究。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7 EDL933wz3672基因缺失突变体的构建

目的：构建EHEC O157∶H7 EDL933wz3672基因缺失突变体。方法：根据已知的O157∶H7 EDL933基因组全序列,采用pKOBEG介导的Red重组系统,筛选卡那霉素抗性基因替换z3672基因的阳性克隆,然后FLP位点特异性重组去除两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因,最后通过PCR和测序手段证实。结果：获得了z3672基因缺失而且不含有卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7 EDL933w突变菌株。结论：为进一步研究O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

登革2型病毒43株NS1基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的：研究含登革2型病毒43株（D2－43）NS1基因的重组质粒DNA在幼地鼠肾细胞BHK－21的表达。方法：将含信号肽的NS1基因片段插入到pcDNA3．1的KpnⅠ位点和EcolRⅠ位点之间,获得重组表达载体pcDNA-NS1。用电穿孔法将其导入BHK－21细胞,G418选择培养。挑取单细胞克隆,RT－PCR及蛋白质印迹法鉴定NS1基因的稳定表达,结果：在随机挑取的5个单细胞克隆中,有4个克隆的RT－PCR鉴定为阳性,蛋白质印迹结果表明NS1基因获表达。结论：构建的pcDNA-NS1质粒在BHK－21细胞中有稳定表达,因此含NS1基因的该重质粒DNA可作作核酸免疫。     

东部马脑炎病毒E2基因的表达及DNA免疫的初步研究

目的：构建东部马脑炎病毒E2基因的重组真核表达载体，对其DNA免疫原性进行观察。方法：采用RT-PCR扩增东部马脑炎病毒全长E2基因，构建真核表达载体pcDNA-E2，以脂质体法转染COS7细胞，经蛋白印迹法和免疫荧光法证明E2基因可以表达后，用庐重组质粒DNA免疫Balb/c小鼠，并用免疫荧光法检测鼠血清中病毒的特异抗体。结果：免疫印迹法、免疫荧光法检测表明E2基因在COS7细胞中获得瞬时表达，pcDNA-E2基因免疫小鼠可产生抗东部脑炎病毒的特异抗体。结论：东部马脑炎病毒E2基因的重组质粒DNA可刺激小鼠产生特异性的抗东部马脑炎病毒体液免疫应答，为基因疫苗的研制奠定了基础。     

腺病毒介导CTLA4Ig及CTLA4双基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的制备CTLA4Ig及CTLA4双基因共表达腺病毒载体,检测重组腺病毒在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)中的表达。方法构建大鼠CTLA4Ig融合基因,将CTLA4Ig及CTLA4基因经IRES2连接,通过同源重组获得重组腺病毒表达载体,并在293细胞中进行病毒包装和扩增。检测CTLA4Ig和CTLA4在BMMSCs中的共表达情况及其免疫抑制功能。结果通过同源重组获得携带CTLA4Ig-IRES2-CTLA4的重组腺病毒表达载体,PacⅠ酶切鉴定正确,与脂质体共转染293细胞获得重组腺病毒。用重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达CTLA4Ig及CTLA4,且此类细胞具有明显抑制淋巴细胞反应的功能。结论重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达分泌型CTLA4Ig和膜结合型CTLA4,通过阻断协同刺激通路方式进一步增强BMMSCs的免疫抑制功能。     

利用groupⅡ intron构建产气荚膜梭菌突变体

目的通过插入失活α毒素基因获得产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)突变体。方法利用MobilegroupⅡintron的自我剪切作用,对本室保藏的1株野生型C.perfringens的α基因plc插入失活。通过菌落PCR检测,以及观察突变株在哥伦比亚血琼脂培养基和脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上的形态变化,进行阳性筛选。蛋白质免疫印迹分析α毒素蛋白活性。结果 PCR检测到α毒素突变体的plc基因中,存在Mobile groupⅡintron片段,并且观察到该菌在哥伦比亚鲜血琼脂平板培养基上的α毒素溶血环消失,在脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上无白晕。蛋白质免疫印迹分析表明,plc突变体不表达α毒素蛋白。结论成功构建C.perfringensα毒素突变体,为后期探索C.perfringens口服疫苗打下了重要基础。     

利用groupⅡ intron构建产气荚膜梭菌突变体

目的通过插入失活α毒素基因获得产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）突变体。方法利用MobilegroupⅡintron的自我剪切作用,对本室保藏的1株野生型C.perfringens的α基因plc插入失活。通过菌落PCR检测,以及观察突变株在哥伦比亚血琼脂培养基和脑心浸液培养基（4%卵黄）平板上的形态变化,进行阳性筛选。蛋白质免疫印迹分析α毒素蛋白活性。结果 PCR检测到α毒素突变体的plc基因中,存在Mobile groupⅡintron片段,并且观察到该菌在哥伦比亚鲜血琼脂平板培养基上的α毒素溶血环消失,在脑心浸液培养基（4%卵黄）平板上无白晕。蛋白质免疫印迹分析表明,plc突变体不表达α毒素蛋白。结论成功构建C.perfringensα毒素突变体,为后期探索C.perfringens口服疫苗打下了重要基础。