牛结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的原核表达和纯化

构建牛结核分枝杆菌ESAT-6基因的原核表达载体,诱导表达、纯化并初步鉴定该蛋白。方法:以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-22b(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)polys菌体,经IPTG诱导表达蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果:所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现在6kDa处有特异性蛋白条带。纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论:成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

重组结核杆菌rCFP10-ESAT6融合抗原基因在HIV感染者中的特异性T细胞反应

目的检测人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者的结核(TB)特异性T细胞反应,为艾滋病合并结核杆菌感染诊断方法的建立提供理论依据。方法应用融合PCR和基因重组技术,重组并表达结核杆菌蛋白rCFP10-ESAT6抗原蛋白,按照HIV感染和是否伴发结核病将实验对象分为健康对照组(14例)、TB组(7例)、HIV(+)/TB组(14例)及HIV(+)组(72例),以合成的rCFP10-ESAT6蛋白作为抗原,通过酶联免疫斑点技术(ELISPOT)分别检测四组患者外周血的特异性T细胞反应,并对HIV(+)患者相关检测结果及其CD4+计数进行相关性分析。结果重组合成28kD的rCFP10-ESAT6融合蛋白,以此蛋白作为抗原通过ELIS-POT方法检测,在TB组和HIV(+)/TB组中阳性率达到100%,在健康对照组中为7.1%(1/14),在HIV(+)组为20.8%(15/72)。TB组阳性率明显高于HIV(+)组以及健康对照组(P<0.05),HIV(+)组阳性率亦明显高于健康对照组(P<0.05)。HIV感染者可能存在较高比例的潜在结核杆菌感染。相关性分析结果表明ELISPOT检测结果与HIV感染者的CD4+计数之...     

炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a( )-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a( )载体的Trx编码区融合产生pET-32a( )-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a( )-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2 金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a( )-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.     

IL-6、IL-6R及PCNA的表达与胃癌的临床关系研究

目的 研究胃癌患者外周血中(IL-6)、胃癌组织中IL-6及其受体(IL-6R)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平及它们之间的相关性,探讨三者与胃癌临床生物学指征的关系.方法 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)技术半定量、平行地检测30例胃癌患者外周血、胃癌及其相应癌旁组织中IL-6及其受体的水平,同时运用免疫组织化学法(ABC法)检测胃癌组织中PCNA的表达情况,分析IL-6、IL-6R、PCNA与胃癌临床生物学指征的相关性.结果 胃癌患者血清中IL-6水平显著增高,手术后则明显下降;胃癌组织中IL-6、IL-6R水平较癌旁组织显著增高,且二者呈明显正相关;IL-6、IL-6R、PCNA在胃癌患者外周血和癌组织中的表达水平与患者肿瘤的大小、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移以及临床分期等临床生物学特征显著相关.结论 IL-6、IL-6R和PCNA是反映胃癌细胞恶性程度和浸润转移深度的重要指标,对它们的水平进行检测,特别是对血清IL-6水平的测定,有利于指导临床诊治,判断胃癌的发生、发展和预后情况.     

重组人瘦素融合蛋白在大肠杆菌中的低温自诱导表达、纯化和活性鉴定

目的:建立低温自诱导表达重组人瘦素(leptin)融合蛋白的系统方法,经体外纯化获得大量具有生物活性的瘦素蛋白.方法:从cDNA文库中扩增瘦素编码区,克隆到pGEM-T easy载体,测序正确后亚克隆到A1.3表达载体,转入BL21(DE3),低温自诱导表达.用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定表达产物.对低温自诱导表达产物rMBP-10His-Leptin进行纯化和酶切,获得可与瘦素单抗发生特异性反应的瘦素蛋白.用Km小鼠减肥实验检验其生物学活性.结果:在22×103处有明显的新增蛋白带,含量超过总蛋白的40%,Western印迹证实为瘦素蛋白.Km小鼠减肥实验证实其具有生物学活性.结论:成功建立了低温诱导表达rMBP-10His-Leptin的系统方法,获得大量瘦素蛋白,经验证表达产物具有免疫活性和生物学活性,可供进一步基础及临床研究应用.     

大鼠CTLA4-FasL融合基因的克隆、表达及体外生物活性研究

目的 表达并纯化CTLA4-FasL重组融合蛋白,鉴定其体外生物活性,为今后将该重组基因用于真核或者病毒载体递送系统的体内研究做准备.方法 用RT-PCR方法从大鼠脾细胞中钓取CTLA4和FasL胞外区基因,搭建二者融合的重组基因,以pGEX-6P-1载体表达和纯化融合蛋白;去除GST标签,获得的目的 蛋白经体外流式检测分析与细胞表面的相应配体B7和受体Fas分子的结合;CCK8检测系统分析其抑制T淋巴细胞的增殖作用.结果 与结论成功调取了目的 基因,获得并纯化了CTLA4-FasL目的 蛋白,该蛋白既可与细胞表面的B7配体结合,又可与细胞表面的Fas受体结合,并能明显抑制T淋巴细胞的增殖,为今后动物体内研究奠定了基础.     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

新型重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白复性及纯化

目的：对高效表达的重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白进行包涵体的分离、变性与复性以及纯化。方法：对表达菌体进行超声破碎、洗涤、氧化还原法变性及复性，经离子交换层析。结果：工程菌HB101／pE01T的表达产物是以包涵体形式存在，菌体的破碎以高渗蔗糖溶液进行预处理后，再超声破碎效果最好；包涵体的洗涤则先用Triton-X-100洗2次，再用8mol／L尿素洗涤一次效果更优；最佳变性条件为在7mol／L盐酸胍中加入0．065mmol／L的DTT和0．2mol／L的盐酸精氨酸；最佳复性奈件为在10℃复性保持24h，蛋白浓度保持在30～80μg/ml，并需加入0．2mol／L盐酸精氨酸；利用谷胱甘肽的氧化还原法，当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的浓度比在2：1时所获得的活性成分得率最高；利用强弱离子交换结合的方法能获得纯度为95％的目的蛋白，所得融合蛋白可与IL-6及PEA抗体相结合并能特异性地杀伤高表达IL-6R的人多发性骨髓瘤细胞。结论：本研究获得重组IL-6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白包涵体的分离、变性与复性条件和一条能获得大量高纯度该融合蛋白的纯化路线。     

油酸一内毒素致伤大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、1L-6和IL-4、IL-10、1L-13的mRNA表达

目的研究油酸加内毒素脂多糖(LPS)序贯性两次致伤大鼠肺组织促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抗炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13的mRNA表达时相性,探讨这些细胞因子在全身炎症反应失控和急性肺损伤中可能的作用.方法分别在油酸第1次致伤后1、4、12和24h实施小剂量LPS第2次致伤,采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测两次序贯性致伤大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-4、IL-10、IL-13的mRNA表达.结果 TNF-α和IL-1β的mRNA表达高峰在油酸第1次致伤后1h LPS第2次致伤组,而IL-6和IL-4、IL-10、IL-13的mRNA表达峰值则在油酸致伤后4h第2次致伤组;油酸-内毒素两次序贯性致伤后的促炎症细胞因子和抗炎细胞因子的mRNA表达与单油酸致伤比较均显著增强(P《0.05).结论在急性肺损伤中,TNF-α和IL-1β是早期表达的促炎细胞因子,而IL-6在炎症进一步发展中发挥作用;抗炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13高表达亦可能促进炎症的放大而不是起保护作用.     

胃癌及癌前病变组织中PCNA、Cyclin D1及P27的表达

目的研究与细胞增殖及周期相关的PCNA、Cyclin D1和P27在胃癌及癌前病变组织中的表达。方法采用组织芯片技术构建包含正常胃黏膜组织、肠化生、异型增生、胃癌组织的组织芯片．组织诊断由病理科医师对每一点进行检查、确定。用免疫组化技术研究PCNA、Cyclin D1和P27从正常胃黏膜到胃癌组织的表达变化趋势。结果PCNA和Cyclin D1在胃癌、异型增生、肠化生组织中表达均较正常胃黏膜增高;P27在胃癌、异型增生、肠化生组织中的表达较正常胃黏膜降低。结论PCNA、Cyclin D1和P27在胃癌及癌前病变组织的表达与正常胃黏膜比较均有较大差异,且有逐渐增加或减少的趋势,均与胃癌的演变密切相关。