DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素（ puromycin,puro）筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR,RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。     

慢病毒载体介导E6AP基因敲低乳腺癌细胞株的构建及其功能检测

目的：构建E6AP基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成两条E6AP基因的siRNA,并将其与siRNA表达载体pSIH-H1连接。经过酶切和测序鉴定成功后,人胚肾细胞293T包装E6AP siRNA的慢病毒,然后感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低E6AP表达的稳定细胞株。稳定细胞株建立后通过实时定量PCR（ qRT-PCR）和Western 印迹等方法检测RNAi的干扰效果,并利用细胞生长实验检测E6AP siRNA对乳腺癌细胞生长的影响。结果 DNA测序证明,成功构建了E6AP siRNA的表达载体。实时定量PCR和Western 印迹实验证明,构建的siRNA确能有效抑制E6AP基因的表达,并建立了敲低E6AP表达的稳定细胞株。生长实验表明,E6AP siRNA可有效抑制细胞的生长。结论成功构建E6AP基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制E6AP基因的表达,且抑制细胞ZR75-1的生长。     

透明质酸介导运动受体真核表达载体的构建及其对乳腺癌增殖和迁移的影响

目的 构建透明质酸介导运动受体(HMMR)真核表达重组质粒并在乳腺癌ZR75-1细胞中转染和鉴定,探究HMMR对乳腺癌细胞生长、增殖和迁移的影响.方法 采用PCR技术以人乳腺文库为模板扩增HMMR基因并与pcDNA3.0-FLAG载体在EcoR V和Xho Ⅰ酶切位点进行连接,构建真核表达载体(pcDNA3.0-FLAG-HMMR),并转染乳腺癌ZR75-1细胞;通过Western印迹法、CCK8实验和克隆形成检测HMMR基因表达对ZR75-1生长的影响,划痕实验验证真核表达载体对ZR75-1细胞迁移的影响.结果 经酶切鉴定及序列测序验证真核重组表达载体构建成功,并在ZR75-1细胞中表达;并且发现HMMR对ZR75-1细胞的增殖和迁移具有显著的促进作用.结论 构建的真核表达载体转染至ZR75-1细胞后,明显促进ZR75-1增殖和迁移,这为研究HMMR基因在乳腺癌发生发展机制奠定了基础.     

BPOZ抑制乳腺癌细胞系增殖的初步研究

目的：研究BTB／POZ（ broad complex, tramtrack and bric a brac／poxviruses and zinc finger）基因对乳腺癌细胞系增殖能力的影响。方法以人脾脏 cDNA 文库为模板, pCMV－HA－Vector 为载体,构建真核表达载体pCMV－HA－BPOZ;免疫印迹实验鉴定重组蛋白pCMV－HA－BPOZ的表达;细胞生长实验检测BPOZ对细胞增殖能力的影响;平板克隆实验检测BPOZ对细胞生长能力的影响。结果免疫印迹实验结果证实,构建的真核表达载体pCMV－HA－BPOZ能正确表达;过表达HA－BPOZ可显著抑制MCF7和ZR－75－1细胞的增殖和生长。结论成功构建了真核表达载体pCMV－HA－BPOZ,并在细胞中成功表达;BPOZ可明显抑制MCF7和ZR－75－1细胞的增殖和生长能力,为进一步研究BPOZ在乳腺癌发生发展中的作用打下基础。     

慢病毒介导的敲低UBC9表达抑制ERβ类泛素化修饰水平

目的建立稳定敲低UBC9蛋白表达的293T细胞株,检测其对雌激素受体β(ERβ)类泛素化修饰水平的调节作用。方法构建4条针对人UBC9基因的慢病毒短发夹RNA(shRNA)的干扰载体,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后,收集病毒上清,感染293T细胞,经嘌呤霉素(puromycin)筛选后获得稳定表达慢病毒介导UBC9 shRNA的混合细胞集落,分别用实时(real-time)PCR和Western印迹方法检测UBC9的表达情况,瞬时转染方法检测UBC9表达水平对ERβ类泛素化修饰水平的影响。结果建立了稳定敲低UBC9的293T细胞株,UBC9降低能够抑制ERβ类泛素化修饰水平。结论 UBC9在ERβ类泛素化修饰反应中发挥重要作用。     

BRCA1基因真核表达载体的构建及其功能验证

目的：构建人乳腺癌易感基因BRCA1的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人BRCA1基因,将其克隆到pXJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染到乳腺癌ZR75-1细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,并用CCK8法测定细胞生长曲线。结果从人乳腺文库中扩增获得大小为5600 bp的DNA片段,并成功克隆至pXJ-40-myc载体上,经测序与目的序列完全一致;转染乳腺癌ZR75-1细胞后目的基因成功表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-BRCA1的乳腺癌细胞较空载体细胞生长缓慢;划痕实验说明,转染myc-BRCA1的乳腺癌细胞较空载体细胞迁袭缓慢。结论成功构建了带myc标签的人BRCA1真核表达载体,为进一步研究BRCA1在乳腺癌发生发展中的功能奠定了基础。     

敲低PES1基因抑制舌癌细胞的生长

目的：构建稳定表达PES1 shRNA的舌癌细胞系,研究敲低PES1基因对舌癌细胞生长的影响。方法在293 T细胞中包装并获得敲低PES1基因的病毒,然后将病毒感染Tca8113、SCC6和SCC153种舌癌细胞并筛选稳定克隆,Western印迹检测PES1蛋白的表达水平;利用生长曲线检测敲低PES1对舌癌细胞生长的影响,流式细胞术检测敲低PES1对舌癌细胞周期的影响。结果成功构建稳定表达PES1 shRNA的舌癌细胞系,敲低PES1基因能够抑制舌癌细胞的生长,使细胞周期阻滞在G0／G1期,敲低PES1抑制cyclin D1的表达。结论敲低PES1抑制舌癌细胞的生长,诱导细胞周期阻滞在G0／G1期,抑制cyclin D1的表达,因此PES1可能成为舌癌基因治疗的靶标。     

Erbin表达缺失诱导MDA-453人乳腺癌细胞对曲妥珠单抗耐药

目的：探索Erbin表达缺失导致Her2阳性的人乳腺癌细胞MDA-453对曲妥珠单抗敏感性的影响。方法设计、构建含人Erbin基因特异性的短发夹RNA（ shRNA）及对照shRNA的干扰载体,转染MDA-453人乳腺癌细胞。经G418加压筛选,获得稳定敲低Erbin的MDA-453细胞（ MDA-453-Erbin sh）和稳定表达对照shRNA的MDA-453细胞（ MDA-453-NC）,以后者作为对照细胞。应用Western印迹法检测MDA-453-NC和MDA-453-Erbin sh细胞中Erbin表达水平。分别通过细胞增殖活性实验及细胞集落形成实验,观察敲低Erbin的MDA-453细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。通过免疫组化染色法,分析Erbin在人乳腺癌及正常乳腺组织中的表达。结果建立了稳定敲低Erbin的MDA-453细胞株,发现敲低Erbin表达可诱导MDA-453细胞对曲妥珠单抗产生抗性。与正常乳腺上皮组织相比,人乳腺癌组织标本中Erbin表达水平降低。结论 Erbin表达缺失可能影响乳腺癌对曲妥珠单抗治疗的敏感性。     

人miR-139高效真核表达载体的构建及其功能初探

目的 构建人miR-139高效真核表达载体,初步探究miR-139在乳腺癌ZR75-1细胞中的功能.方法 设计成熟miR-139的PCR引物,扩增包含miR-139成熟序列的基因组序列.将扩增产物亚克隆到真核表达载体PIRES2-EGFP(IE)上,构建miR-139真核表达载体IE-139.将IE-139转染至乳腺癌ZR75-1细胞中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-139的表达情况,同时检测过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc、EIF4G2和ZBTB34的mRNA水平.结果 酶切、测序结果表明,人miR-139真核表达载体构建成功;qRT-PCR表明,miR-139能在乳腺癌ZR75-1细胞中高效表达(P<0.01),过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),但ZBTB34的下降水平不明显.结论 成功构建了人miR-139真核表达载体IE-139,通过qRT-PCR检测,证明该载体能成功实现miR-139的高效过表达,并且miR-139能明显抑制乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平,这为进一步研究miR-139的功能及调控靶基因的分子机制奠定了基础.     

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用

目的：了解DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（ DNA-PKcs）在电离辐射诱发细胞自噬中的作用。方法通过慢病毒载体（ pSicoR ）构建DNA-PKcs短发夹RNA （ shRNA ）表达载体,并转染HeLa细胞敲低DNA-PKcs表达。CCK-8实验检测细胞增殖活性及细胞放射敏感性,免疫印迹检测自噬相关蛋白表达,免疫荧光实验检测自噬标志物GFP-LC3的表达。结果成功构建shRNA敲低DNA-PKcs表达的HeLa细胞模型,通过该细胞模型观察到抑制DNA-PKcs蛋白表达导致细胞增殖能力降低、放射敏感性增高。 P62和LC3蛋白表达变化,以及细胞内绿色荧光蛋白（ GFP）-LC3免疫荧光斑检测结果显示,DNA-PKcs基因敲低后,明显增加X射线诱发细胞自噬。抑制DNA-PKcs导致哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白（ mTOR）第2481位丝氨酸磷酸化水平降低。结论抑制DNA-PKcs增强受照射宫颈癌HeLa细胞的自噬及放射敏感性,mTOR信号通路可能参与DNA-PKcs对自噬的调节作用。     

慢病毒介导的Ⅰ型胶原shRNA在大鼠系膜细胞中的表达

目的探讨慢病毒介导的Ⅰ型胶原(ColⅠ)短发夹RNA(shRNA)在大鼠系膜细胞的表达情况。方法利用三质粒合成法将表达质粒合成慢病毒表达载体,分别用感染增强剂(对照组)、空慢病毒载体(pSC-GFP组)和慢病毒表达载体(pSC-GFP/ColⅠ组)感染大鼠系膜细胞。采用流式细胞仪检测各组大鼠系膜细胞的转染效率,并采用RT-PCR和Western blotting方法检测各组ColⅠmRNA及ColⅠ蛋白表达情况。结果pSC-GFP和pSC-GFP/ColⅠ均能高效感染大鼠系膜细胞,其中pSC-GFP感染效率为72.42%,pSC-GFP/ColⅠ感染效率高达75.42%。RT-PCR检测提示pSC-GFP/ColⅠ组细胞ColⅠmRNA表达量较对照组、pSC-GFP组显著降低(P<0.05),其抑制效率为32.64%±0.12%,而后两组ColⅠmRNA表达差异无统计学意义。Western blotting检测显示,与对照组、pSC-GFP组比较,pSC-GFP/ColⅠ组蛋白表达明显降低(P<0.05),而对照组与pSC-GFP组之间ColⅠ蛋白表达差异无统计学意义。结论慢病毒载体能稳定、高效地将ColⅠs...     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

RNA干扰抑制pyk2表达对大肠癌细胞凋亡和增殖的影响

 目的 探讨富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2(proline-rich tyrosin kinase-2,pyk2)对Lovo大肠癌细胞凋亡和增殖的影响.方法 利用两组构建有pyk2 shRNA(短发夹RNA,会在细胞内顺序反应而产生siRNAs)的质粒载体瞬时转染Lovo细胞系,设立空白对照组和阴性对照组,应用PCR 和western blot方法检测转染组和对照组细胞中pyk2 mRNA与蛋白表达水平的变化,通过细胞计数法来绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术(FCM)检测转染组与对照组细胞在凋亡和细胞周期S期分布的差异.结果 转染pyk2shRNA质粒的Lovo细胞凋亡水平明显低于对照组,S期细胞数显著增多,细胞绝对数增加,生长更加活跃.结论 pyk2能够升高Lovo大肠癌细胞的凋亡水平,降低其增殖水平.     

串联MS2衣壳蛋白和MS2特异结合RNA表达载体构建及应用

目的构建体内研究RNA-蛋白相互作用的表达载体。方法利用MS衣壳蛋白可与MS2结合位点（MS2bs）RNA特异性结合的特点,通过设计特异引物,构建pcDNA3．0-Flag．2XMS2和pcDNA3．0—12XMS2％s表达载体,以及表达MEG3非编码RNA的表达载体pcDNA3．0-EG3V1—12XMS2bs。共转染细胞,进行RNA免疫沉淀,所得RNA进行实时定量PCR分析验证。结果成功构建了pcDNA3．0-Flag-2XMS2和pcDNA3．0．12XMS2bs表达载体,实时定量PCR结果表明,与对照相比能明显富集MEG3V1非编码RNA分子。结论成功构建了体内研究RNA-蛋白质相互作用的表达载体,为RNA一蛋白相互作用研究提供了新的技术方法。     

shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中的长期高效表达

目的构建在小鼠造血干细胞中高效表达的shRNA重组慢病毒载体并研究其在小鼠造血系统中的长期稳定表达。方法将p-CMV和重组并鉴定正确的p-SFFV慢病毒载体与辅助病毒载体PAX2和PMD2G混合后,采用磷酸钙方法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟慢病毒感染经流式细胞仪分选并体外培养的小鼠骨髓造血干细胞,分析其表达效率后,选取感染效率较高的p-SFFV慢病毒载体感染小鼠骨髓造血干细胞,并通过骨髓移植技术输入放射线照射后的小鼠体内。在移植后4周和9周分别获取小鼠外周血样本,移植后16周获取小鼠骨髓样本,分析供体细胞在小鼠体内的表达。结果成功重组了p-SFFV慢病毒载体并在小鼠骨髓造血干细胞中高效表达（感染效率72.4%）;骨髓移植实验表明,携带外源性shRNA的慢病毒载体可在小鼠造血系统内长期稳定表达（感染效率92%）。结论shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中可长期稳定表达。     

microRNA-7真核表达载体的构建及其对细胞增殖能力的影响

目的构建miR-7真核表达载体,以研究miR-7过表达后对细胞增殖能力的影响。方法以人全血标本基因组为模板,PCR扩增miR-7序列,然后将该序列克隆入pHRS-1cla-CMV-EGFP载体中,构建pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体。将构建好的载体瞬时转染入293FT细胞中,利用RT-PCR技术对转染前后293FT细胞中miR-7的表达水平进行检测。将pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体瞬时转染入乳腺癌细胞系MCF-7中,利用CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后细胞增殖能力的变化。结果构建的pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体质粒酶切和测序鉴定结果正确,实时定量RT-PCR结果表明,与转染pHRS-1cla-CMV-EGFP对照载体细胞相比,转染pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体72 h后的293FT细胞成功地过表达miR-7达76.8倍。CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后乳腺癌细胞系MCF-7的增殖能力显著性下降（P〈0.05）。结论成功构建了pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体,瞬时转染后细胞可以有效地高表达miR-7,同时证明过表达miR-7可以使细胞的增殖能力受到明显抑制。     

组蛋白甲基转移酶SET7的原核表达及纯化鉴定

目的：原核表达并纯化组蛋白甲基转移酶 SET7。方法以乳腺文库为模板,PCR 扩增 SET7基因,克隆到 pGEX-KG 载体,构建 pGEX-KG-SET7;经酶切鉴定后转化进行小量诱导,通过 SDS-PAGE 检测融合蛋白 GST-SET7的纯化效果。结果DNA 测序结果表明,pGEX-KG-SET7原核表达载体构建成功。SDS-PAGE 检测显示获得相对分子质量为72×103的融合蛋白。结论纯化得到原核表达的 GST-SET7融合蛋白,为进一步研究 SET7在乳腺癌中的功能奠定了基础。