蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

目的通过基因工程手段实现牵引丝关键组成蛋白MaSp1在大肠杆菌中的异源表达,并对其进行分离纯化,从而建立基因工程蜘蛛丝基因序列串联拼接、载体构建以及原核表达与纯化的关键技术体系。方法利用同尾酶连接法对合成的基因工程蜘蛛丝基因单体序列进行串联拼接,获得多倍串联体克隆重组子,将鉴定正确的多倍串联体克隆重组子与原核表达载体pET28a（＋）连接,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导其表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western印迹进行鉴定。在此基础上对工程菌进行高密度发酵,所获蛋白通过硫酸铵分级分离方法进行纯化。结果与结论成功构建了基因工程蜘蛛丝MaSp1多串联体的表达载体,原核表达蛋白的相对分子质量与预期一致,且纯化的目的蛋白纯度达80%以上。上述研究工作为开展基因工程蜘蛛丝蛋白的规模化制备建立了关键技术方法,并为后续基因工程蜘蛛丝的人工纺丝提供必要的前提和工作基础。     

人自噬相关基因LC3 B原核表达载体的构建及活性检测

目的：构建带GST标签的人LC3B基因原核表达载体,得到GST-LC3B重组质粒并纯化出GST-LC3B融合蛋白,体外检测并证实该蛋白的生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出LC3B基因的编码序列,将该序列插入到pGEX-KG载体中,得到GST-LC3B重组质粒,转化大肠杆菌Rossate,经小量诱导后利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化GST-LC3B融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western印迹方法进行检测,GST pull-down技术证实其生物学活性。结果利用PCR技术从人乳腺文库中成功扩增得到大小约400 bp的目的基因片段,插入pGEX-KG载体中得到GST-LC3B质粒,经双酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量（ Mr）约为40×103的目的蛋白;GST pull-down技术检测出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在体外作用,具有较好的生物学活性。结论成功构建了人自噬相关基因LC3B的原核表达产物,为进一步研究LC3 B在自噬中的作用机制奠定了基础。     

人血管生成素-1原核表达载体的构建与表达

目的　构建人血管生成素 - 1的原核表达载体 ,并进行表达。方法　利用PCR技术扩出人血管生成素 - 1基因片段 ,并克隆到PQE - 31载体中 ,转化E .coliM 15菌株后进行诱导表达。结果　构建了PQE31Ang - 1原核表达载体 ,在M 15中进行了高效表达。结论　通过原核表达得到人血管生成素 - 1蛋白 ,其具有良好的抗原性 ,为进一步的生物活性和应用研究奠定了基础     

抗人TNF-α单链抗体rScFvH22原核表达及纯化

目的：应用PET32-c原核表达载体快速、高效地表达及纯化单链抗体。方法：将单链抗体H22基因克隆到PET32-c原核表达载体中，通过酶切及测序鉴定正确后，进行原核诱导表达和纯化。并检测纯化后单链抗体的功能。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳表明，单链抗体基因克隆成功；SDS-PAGE结果表明，单链抗体得到成功表达和纯化；ELISA和Western印迹结果表明，单链抗体H22能够特异性结合人TNF-α。结论：成功地表达及纯化抗人TNF-α单链抗体rSeFvH22。     

重构型人caspase-8基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体，转染大肠杆菌并诱导其表达。方法：将人caspase—8催化结构域基因及两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase—8基因克隆人原核表达载体pBV220，转染大肠杆菌并诱导表达。结果：成功构建了三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体。转染大肠杆菌后，经温度诱导，重构型人caspase—8基因获得了高效的表达。结论：在大肠杆菌中成功表达了三种重构型人caspase—8基因。     

人乳酸脱氢酶A基因的原核表达及其蛋白的纯化

目的 构建带有His标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)基因原核表达载体,并进行蛋白纯化,为研究LDHA蛋白功能奠定基础.方法 以人乳腺文库作为模板,通过PCR技术扩增得到LDHA基因的编码序列,插入到pET-28a(+)载体中并测序.LDHA在大肠杆菌中进行诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE及Western印迹检测蛋白...     

人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

目的 在大肠埃希菌中表达人神经元正五聚蛋白2(NPTX2),并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 双酶切 pReceiv-er-M15 NPTX2质粒获得人NPTX2全长cDNA,经Not I 和EcoR I 双酶切后,连接至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1中,经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,采用Western blotting鉴定表达产物,亲和层析法纯化GST-NPTX2蛋白.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pGEX4T-1-NPTX2构建成功,表达产物相对分子量为70kD左右,与预期值相符,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,亲和层析法获得了纯化的GST-NPTX2蛋白.结论 构建了pGEX-4T-NPTX2原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了GST-NPTX2融合蛋白.亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究NPTX2的生物学功能奠定了基础.     

人细胞外基质磷酸糖蛋白MEPE的表达纯化及抗体制备

目的 原核表达、纯化人细胞外基质磷酸糖蛋白(Mepe)基因,并制备多克隆抗体.方法 设计出扩增人Mepe全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性.结果 原核表达了人Mepe全长基因,纯化了MEPE蛋白,并获得了抗MEPE的多克隆抗体,抗体效价达到1∶25 600,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的MEPE蛋白.结论 MEPE蛋白能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础.     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.     

人血管生成素-1真核表达载体的构建与表达

目的构建人血管生成素-1的真核表达载体,真核表达人血管生成素-1蛋白并进行纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）将人血管生成素-1基因片段插入B7载体中构建真核表达载体,通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行真核表达。结果成功构建了B7Ang-1真核表达载体,在CHO细胞中进行了稳定表达,获得了纯化的人血管生成素-1蛋白。结论真核系统表达的人血管生成素-1蛋白具有良好的抗原性,为进一步的生物活性研究和临床应用奠定了基础。     

人NR1靶片段的原核表达

目的 :克隆人N_甲基_D_门冬氨酸受体 (NMDAR ,NR)靶片段cDNA ,构建其原核表达载体并建立相应的表达体系。方法 :用常规RT_PCR法从脑肿瘤切除组织中克隆人NR1靶片段cDNA ,测序鉴定后构建其原核表达载体 ,并在大肠杆菌DH5α中升温诱导表达 ,表达产物通过SDS_PAGE分析及免疫印迹分析进行鉴定。结果 :成功克隆了人NR1靶片段 4 89bp长cDNA ,测序结果与文献报道一致 ,原核表达载体在宿主菌中诱导表达后得到了NR1蛋白靶片段的高效表达产物 ,占全菌体 15 %～ 30 %。SDS_PAGE及免疫印迹分析与预计相同。结论 :人NR1靶片段可通过改构设计在原核体系中获得高效表达     

功能未知基因LOC410296的表达载体构建及小鼠抗血清制备

目的：为深入研究功能未知基因LOC401296,首先获取其全长序列,实现LOC401296分子的真核和原核表达,并制备针对 LOC401296蛋白的抗血清。方法采用 PCR 方法克隆 LOC401296编码区全长序列,利用pET28B和pCMV-Myc质粒构建LOC401296原核表达和真核表达载体,用异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导目的蛋白原核表达,目的蛋白经纯化、复性后免疫小鼠制备抗血清。结果 PCR克隆得到LOC401296编码区全长序列,成功构建LOC401296原核及真核表达载体,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌体内表达,用纯化蛋白免疫小鼠获得抗人LOC401296蛋白血清, ELISA检测抗血清效价达1∶64000,Western印迹证实LOC401296真核表达载体成功表达且抗血清特异性良好。结论获得LOC401296基因编码区全长序列,成功构建了LOC401296基因表达载体,分别在大肠杆菌和真核细胞内实现LOC401296蛋白原核表达和真核表达,获得小鼠抗人LOC401296蛋白抗血清,为LOC401296基因功能研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒E1E2蛋白原核表达载体的构建及表达产物的鉴定

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)包膜糖蛋白 (E1E2 )基因的原核表达载体 ,为研究HCVE1E2蛋白属性及基因免疫奠定基础。方法 :设计HCVE1E2区基因上、下游引物 ,分别引入BglⅡ及EcoRI酶切位点 ,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV1- 30 11为模板 ,通过PCR扩增获得HCVE1E2区基因片段 ,将其克隆入原核表达载体pRSETA ,然后通过酶切和序列测定对其进行鉴定 ;将此表达载体转化入表达菌BL2 1(DE3)pLySs诱导表达 ,并采用SDS -PAGE对表达产物进行鉴定。结果 :经酶切及序列测定分析表明 ,成功地构建了重组原核表达载体pRSETA -HCVE1E2 ;SDS -PAGE显示目的蛋白大量表达 ,且呈非溶状态。结论 :HCVE1E2融合蛋白可以在大肠杆菌中大量表达 ,为HCVE1E2蛋白的制备及基因疫苗的研制奠定了基础。     

组蛋白甲基转移酶SET7的原核表达及纯化鉴定

目的：原核表达并纯化组蛋白甲基转移酶 SET7。方法以乳腺文库为模板,PCR 扩增 SET7基因,克隆到 pGEX-KG 载体,构建 pGEX-KG-SET7;经酶切鉴定后转化进行小量诱导,通过 SDS-PAGE 检测融合蛋白 GST-SET7的纯化效果。结果DNA 测序结果表明,pGEX-KG-SET7原核表达载体构建成功。SDS-PAGE 检测显示获得相对分子质量为72×103的融合蛋白。结论纯化得到原核表达的 GST-SET7融合蛋白,为进一步研究 SET7在乳腺癌中的功能奠定了基础。