肺癌相关基因LSCC-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建含有肺癌相关基因LSCC-3全长ORF片段的真核表达载体,并验证其在细胞内的表达。方法PCR方法获取LSCC-3基因全长ORF片段,构建含有上述片段的真核表达载体（含3’端绿色荧光蛋白尾）并验证、纯化;将该真核表达载体转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下对LSCC-3基因的表达进行观察和验证。结果成功将LSCC-3基因全长ORF片段装入真核表达载体pLPS-3’EGFP（pLPS-LSCC-3-3’EGFP）并转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下观察到了核外细胞浆内LSCC-3基因蛋白表达产物的存在。结论成功构建了LSCC-3真核表达载体pLPS-LSCC-3-3’EGFP,该载体可在肺癌细胞胞浆内顺利表达。     

新的白血病相关基因LRP15真核表达载体构建及在K562细胞中的表达

 目的构建LRP15基因开放阅读框架(ORF)序列的真核表达载体,并观察其在K562细胞中的表达情况.方法采用RT-PCR方法自1例白血病患者中克隆LRP15cDNA片段,将目的基因LRP15克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LRP15.脂质体介导法将其转染K562细胞,72 h以RT-PCR方法检测转染细胞中LRP15基因的表达情况.结果酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人LRP15基因ORF序列;转染实验表明LR15基因能在K562细胞中表达.结论成功构建LRP15基因真核表达载体,并在K562细胞中获得表达,为进一步研究LRP15基因的功能奠定了基础.     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

人G250真核表达载体pIRES-neo-G250的构建及表达

目的构建包含人的G250真核表达载体,并将该载体转导入293 T细胞检测其表达,为构建以G250为靶点的肾癌模型提供研究基础。方法通过聚合酶链反应获得G250基因,将其连接至PMD18T过渡载体,然后克隆到载体pIRES-neo中。把构建后的重组质粒pIRES-neo-G250转染到293 T细胞,用流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测其表达。结果 PCR扩增出的G250基因测序正确,酶切鉴定重组质粒pIRES-neo-G250正确,说明质粒构建成功;流式细胞术、免疫荧光和RT-PCT检测结果表明,重组质粒pIRES-neo-G250在293 T细胞中得到表达。结论该实验成功构建了重组质粒pIRES-neo-G250,并且在293T细胞中能够有效表达,为后续构建转染人G250的基因细胞株工作奠定了基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-p93的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达

目的 :构建肿瘤抑制基因DOC - 2的真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93,将其转入人源性卵巢癌细胞株HO - 8910中 ,并得到稳定表达。方法 :利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA基因片段 ,将其正向连接入真核表达载体pIRES2 -EGFP ,并通过酶切鉴定。用脂质体介导的方法 ,将真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93转染人卵巢癌细胞系HO - 8910 ,通过G4 18筛选稳定表达克隆 ;分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察人DOC - 2蛋白在卵巢癌细胞系HO - 8910中的表达。结果 :构建了DOC - 2的真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93,并通过酶切鉴定。在荧光显微镜下 ,转染了pIRES2 -EGFP -p93的人卵巢癌细胞HO - 8910发出绿色荧光 ,荧光全部集中于胞浆内。免疫细胞化学染色结果显示转染了pIRES2 -EGFP -p93的人卵巢癌细胞HO - 8910胞浆呈棕黄色 ,而转染空载体的细胞呈阴性染色。结论 :成功构建了真核表达载体转染了pIRES2 -EGFP -p93,并在人卵巢癌细胞系HO - 8910中稳定表达 ,为研究DOC - 2蛋白对卵巢癌细胞的作用奠定了基础     

Flag-Tinagl1真核表达载体的构建及功能验证

目的 构建带Flag标签的肾小管间质性肾炎抗原样蛋白1(Tinagl1)基因真核表达载体,检测其对肝癌细胞HepG2 ERK/AKT磷酸化、生长和迁移的影响.方法 以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增Tinagl1基因片段,将其插入pcDNA3.0载体,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染到肝癌HepG2细胞中,采用...     

GRP78在HepG2细胞的亚细胞定位及真核表达

目的 构建GRP78的真核表达载体以检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.方法采用激光共聚焦显微镜观察GILP78在HepG2细胞中的定位,用RT-PCR方法从HepG2细胞中扩增GRP78 cDNA序列,构建真核表达载体peDNA3.1-GRP78,转染HEK293细胞,分别用Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.结果 GRP78在HepG2细胞的胞膜和胞质均有表达,GRP78在细胞膜上均匀分布.双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-GRP78真核表达质粒构建成功,该表达质粒转染HEK293细胞后可以瞬时表达GRP78蛋白.结论 正常状态下,GRP78在HepG2细胞胞膜和胞质均有表达.pcDNA3.1-GRP78转染HEK293细胞后能瞬时表达GRP78蛋白,为进一步研究GRP78的功能提供了重要工具.     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

小鼠新基因 msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征

目的：研究小鼠系统性RNAi相关基因msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征。方法：通过生物信息学方法寻找小鼠中与线虫的sid-1基因同源的基因，用RT-PCR方法从小鼠大脑中分离到其全长cDNA；将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1，用脂质体介导转入CHO细胞，确定其亚细胞定位。结果与结论：基因msid2的cDNA全长1353bp，编码450个氨基酸，定位于小鼠16号染色体，其基因组全长16kb，包括14个外显子和13个内含子。亚细胞定位试验结果初步表明，该蛋白定位于内质网及质膜。RT-PCR结果显示msid2在小鼠大脑、小脑中高表达，而在其他组织表达水平较低。     

双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES的构建与鉴定

目的:为适应恶性肿瘤免疫治疗中多基因联合应用的需要,在真核表达载体pVAX1的基础上,利用内部核糖体进入位点IRES序列,构建双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES,以增强DNA疫苗的免疫疗效.方法:通过PCR扩增获得目的基因IRES并定向克隆到pVAX1载体中,然后在IRES序列的上下游分别插入红色荧光蛋白基因DsRed1和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP,瞬时转染人胚胎肾细胞293T,通过流式细胞术和免疫荧光验证基因表达.结果:pVAX1-IRES经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致,DsRed1基因和EGFP基因在pVAX1-IRES载体中,不仅可以分别表达,而且可以同时表达,显示该双顺反子真核表达载体构建成功.结论:pVAX1-IRES双顺反子表达载体的构建,为基因联合表达和恶性肿瘤的免疫治疗作了必要准备.     

Sema3A-Fc真核表达载体构建及诱导少突胶质细胞祖细胞迁移作用观察

目的 构建真核表达载体pIGSema3A-Fc,并观察Sema3A-Fc融合蛋白对少突胶质细胞祖细胞(OPCs)迁移的作用.方法 运用DNA重组技术自原核表达载体上将鸡来源的Sema3A基因克隆到真核表达载体pIGIsG1Fc上,并用双酶切、测序法进行鉴定.采用脂质体法转染非洲绿猴肾细胞株(COS-7)细胞进行融合蛋白表达,培养3天后提取上清液,经蛋白A亲和纯化,Western blotting进行鉴定.利用插入式细胞迁移小室(millicell-PCF)细胞迁移仓观察其对OPCs细胞迁移的诱导作用.结果 重组质粒双酶切产生了2.24kb目的 片段及5.7kb载体片段.测序证实构建的Sema3A膜外区与Sema3A-Fc cDNA阅读框完整,连接部位序列正确;Western blotting证实有Sema3A-Fc融合蛋白表达.迁移试验证明其对少突胶质细胞祖细胞迁移具有推斥作用.结论 成功构建了Sema3A-Fc真核表达载体,并使有生物学活性的Sema3A-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达,为进一步研究OPCs细胞定向迁移奠定了基础.     

人血管生成素-1真核表达载体的构建与表达

目的构建人血管生成素-1的真核表达载体,真核表达人血管生成素-1蛋白并进行纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）将人血管生成素-1基因片段插入B7载体中构建真核表达载体,通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行真核表达。结果成功构建了B7Ang-1真核表达载体,在CHO细胞中进行了稳定表达,获得了纯化的人血管生成素-1蛋白。结论真核系统表达的人血管生成素-1蛋白具有良好的抗原性,为进一步的生物活性研究和临床应用奠定了基础。     

C反应蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

丙型肝炎病毒NS3区7个抗原表位融合基因载体的构建及在真核细胞的表达

目的 建立丙型肝炎病毒非结构蛋白3（NS3）区7个辅助T细胞抗原表位融合基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达产物,为进一步研究应用HCV NS3序列进行预防HCV感染的DNA免疫的研究创造条件。方法合成3对相互重叠的寡核苷酸引物,涵盖NS3区7个辅助T细胞抗原表位,细胞通过重叠延伸PCR方法,将它们拼接在一起构建了一个多肽融合基因,经克隆测序后,插入真核表达载体pEGFP-N3和pBuDCE中,用构建的pEGFP-DR4质粒分别转染293T和B淋巴细胞系046W,用pBuDCE-DR4质粒转染293T细胞,用Western印迹和流式细胞仪检测其表达。结果经测序证实成功的将丙型肝炎病毒NS3区7个辅助T细胞抗原表位基因序列拼接成融合基因,构建的pEGFP-DR4质粒在293T和B淋巴细胞系046W中均表达了预期的融合蛋白36kD。构建的pBuDCE-DR4质粒在293T细胞中可观察到预期的13kD的多肽融合蛋白。结论本研究建立了能够在真核细胞表达HCVNS3区7个辅助T细胞抗原表位融合基因的细胞系。     

microRNA-7真核表达载体的构建及其对细胞增殖能力的影响

目的构建miR-7真核表达载体,以研究miR-7过表达后对细胞增殖能力的影响。方法以人全血标本基因组为模板,PCR扩增miR-7序列,然后将该序列克隆入pHRS-1cla-CMV-EGFP载体中,构建pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体。将构建好的载体瞬时转染入293FT细胞中,利用RT-PCR技术对转染前后293FT细胞中miR-7的表达水平进行检测。将pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体瞬时转染入乳腺癌细胞系MCF-7中,利用CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后细胞增殖能力的变化。结果构建的pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体质粒酶切和测序鉴定结果正确,实时定量RT-PCR结果表明,与转染pHRS-1cla-CMV-EGFP对照载体细胞相比,转染pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体72 h后的293FT细胞成功地过表达miR-7达76.8倍。CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后乳腺癌细胞系MCF-7的增殖能力显著性下降（P〈0.05）。结论成功构建了pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体,瞬时转染后细胞可以有效地高表达miR-7,同时证明过表达miR-7可以使细胞的增殖能力受到明显抑制。     

人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.     

人CDK7基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建带Myc标签的细胞周期蛋白依赖性激酶7（cyclin－dependent kinase 7, CDK7）的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶与已知相互作用蛋白P53之间的相互作用。方法应用PCR技术从人乳腺文库中扩增出CDK7全长编码区基因,将其克隆到pXJ－40载体中;继而重组质粒转染人胚肾293 T细胞,以SDS－PAGE和Western印迹鉴定表达情况;免疫共沉淀检测Myc－CDK7与FLAG－p53的相互作用。结果双酶切和基因测序鉴定显示,Myc－CDK7真核表达质粒克隆构建成功;SDS－PAGE和Western印迹结果表明,Myc－CDK7转染人胚肾293T细胞后成功表达;免疫共沉淀显示,重组Myc－CDK7与已知相互作用蛋白P53在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论成功构建Myc－CDK7的真核表达载体,为进一步探讨Myc－CDK7对细胞周期的调控奠定了实验基础。