BHA和β-ME对表观修饰后的NIH/3T3细胞向神经方向诱导的实验研究

目的通过联合应用表观修饰药物5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dC)和曲古抑菌素A(TrichstatinA,TSA)对NIH/3T3细胞进行重编程,应用β-羟基酸(betahydroxyacid,BHA)和β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)进一步诱导,以期表达与神经细胞密切相关的基因。方法应用流式细胞技术检测实验组(4.5μM5-aza-dC+0.35μMTSA+1mMβ-ME+200μMBHA作用后的NIH/3T3细胞)和对照组中NIH/3T3细胞的DNA甲基化水平。应用RT-PCR的方法检测Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4的表达,免疫细胞化学染色检测巢蛋白(nestin)和神经丝轻链(neurofilamentlightchain,NF-L)的表达情况。结果实验组NIH/3T3细胞DNA甲基化水平较对照组明显降低,细胞均呈现出Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4基因的阳性表达。经过BHA和β-ME诱导后,NIH/3T3细胞呈巢蛋白和神经丝轻链阳性。结论表观修饰后的细胞经诱导后可以呈现nestin和NF-L的阳性表达。     

5-Aza-dC和TSA对肝细胞癌细胞株中3-OST-2甲基化和基因表达的影响

目的 探讨5-Aza-dC和TSA对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中3-OST-2甲基化水平、基因表达以及对核转录因子UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1,也称为ICBP90/NP95)表达的影响.方法 采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法检测药物作用前后HCC细胞株中3-OST-2甲基化的状态改变;采用实时荧光定量RT-PCR法检测3-OST-2和UHRF1 mRNA的表达变化;采用细胞爬片免疫组化法检测UHRF1蛋白表达.结果 3-OST-2在HCC细胞株中呈完全甲基化状态,5-Aza-dC或TSA均能部分逆转3-OST-2甲基化,其mRNA表达分别增加2.7倍和4.9倍,两种药物联合处理后,3-OST-2甲基化被完全逆转,其mRNA表达增加9.1倍.5-Aza-dC或TSA均能降低UHRF1 mRNA和蛋白的表达,TSA比5-Aza-dC疗效更好(P<0.01),两种药物联用具有协同作用(P<0.01).结论 启动子甲基化和组蛋白修饰共同导致3-OST-2基因表达降低.5-Aza-dC和TSA单独作用均能部分逆转3-OST-2甲基化,增加其mRNA表达,抑制核蛋白UHRF1表达可能是其中机制之一.     

巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程为诱导多能性细胞的研究

目的探讨巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程为诱导多能性细胞的方法。方法应用经典的逆转录病毒介导方法,将Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4四种人源性转录因子转导入巴马小型猪的胎儿成纤维细胞中,建立形态和特征类似猪上胚层细胞来源的猪多能性细胞(pig induced pluripotent cells,piPCs)。免疫荧光化学方法检测多能性细胞标记物,RT-PCR检测了该细胞体外三胚层相关基因表达水平。结果巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程的piPCs细胞呈AKP染色阳性,体外长期传代都保持正常的染色体核型,猪上胚层多潜能性细胞标记分子Oct4,Sox2,Nanog,Tra-1-60,Tra-1-81和SSEA-4呈阳性表达,并且表达小鼠胚胎干细胞(ES)多潜能性细胞标记分子SSEA-1,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达,但是体内分化能力存在缺陷。结论巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程成功诱导成多能性细胞。     

淫羊藿苷对小鼠皮肤成纤维细胞重编程为心肌样细胞的作用

目的研究小鼠成纤维细胞重编程为心肌样细胞(induced cardiomyocytes,iCMs)过程中淫羊藿苷(icariin,ICA)的作用及心血管发育中胚层相关蛋白1(mesoderm posterior 1,Mesp1)的表达。方法 MTT法筛选ICA的最佳药物浓度。GMT转染小鼠皮肤成纤维细胞,建立重编程心肌样细胞模型。qRT-PCR检测转染后重编程细胞中肌球蛋白重链6(myosin heavy chain 6, Myh6)的mRNA表达,免疫荧光细胞化学方法检测心肌肌钙蛋白I (cardiac troponinI, cTnI)及Mesp1的表达情况。结果 ICA最佳药物浓度为10-7mol/L。ICA组诱导iCMs高表达cTnI,是GMT组的1.3倍。Myh6 mRNA在重编程第3周达到高峰,且ICA组显著高于GMT组(P0.01)。Mesp1与c TnI的表达趋势正好相反。结论 ICA可以提高成纤维细胞重编程为心肌样细胞的效率;Mesp1参与促进成纤维细胞重编程的过程。     

低氧微环境对胎鼠成纤维细胞HIF-1α和PTEN表达及细胞周期的影响

目的探讨低氧条件下HIF-1α和PTEN在胎鼠成纤维(MEFs)细胞增殖、分化中可能的调控作用,以及低氧对细胞周期的影响。方法低氧条件(5%O_295%N_2)下培养MEFs不同时间(0、2、4、6、8h)后,应用免疫细胞化学、RT-PCR检测方法,观察MEFs中HIF-1α和PTEN的表达并检测其细胞周期。结果免疫组化结果表明,HIF-1α及PTEN蛋白的表达均随低氧时间增长而逐渐增强。RT-PCR结果显示,HIF-1αmRNA吸光度值常氧组为(0.93±0.06),低氧2～4h组达高峰分别为(1.46±0.05)和(2.30±0.05),随后开始下降;PTENmRNA吸光度值常氧组为(0.78±0.08),低氧2～6h组逐渐达到高峰分别(1.10±0.11)和(1.61±0.23),8h开始呈现下降趋势(<0.05)。流式细胞仪分析显示,随着低氧时间延长,G0/G1期细胞从(86.72±0.41)%上升至(92.41±1.10)%,低氧使MEFs细胞周期阻滞于G1/G0期。结论低氧微环境阻滞MEFs细胞周期于G0/G1期可能与PTEN和HIF-1α过表达相关。     

控制人类诱导多能干细胞多能性和决定早期细胞命运的信号通路

胚胎源性人类多能干细胞和重编程的(reprogrammed)体细胞来源的人类多能干细胞的共同特征包括无限增殖和持久、广泛地向各种类型细胞分化的潜能。     

体外构建3D细胞压力培养模型研究压力对增生性瘢痕成纤维细胞的作用

目的 采用Flexcell-5000C压力系统和鼠尾Ⅰ型胶原构建3D细胞压力培养模型,在体外细胞水平探讨压力对增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)的作用.方法 胶原酶消化法分离培养原代HSFb,采用Flexcell-5000C压力系统和鼠尾Ⅰ型胶原体外构建HSFb 3D培养模型.实验分为对照组(未施压)、10 mmHg压力...     

γ射线对C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺成纤维细胞生物学行为影响的比较研究

目的比较C57BL/6J和C3H/HeN两种小鼠肺成纤维细胞以不同剂量的60Coγ射线照射后生物学行为的异同。方法原代分离培养C57BL/6J和C3H/HeN两种小鼠肺成纤维细胞(LF),应用2、4、6和8Gy的60Coγ射线照射后,通过MTT比色法、流式细胞术、AgNOR染色和免疫荧光细胞化学染色法,检测照射后两种LF的增殖活力、细胞周期以及a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)表达的变化。结果以2~8Gy照射后,C57BL/6J和C3H/HeN小鼠的LF增殖活力与正常对照组相比较未见明显增强。照射后,C57BL/6J小鼠的LF非整倍体增多,a-SMA高表达,MMP-1的表达呈弱阳性,TIMP-1的表达呈增强趋势。照射后,C3H/HeN小鼠的LF出现G2-M期阻滞,a-SMA的表达减弱至消失,MMP-1和TIMP-1的表达均呈增强趋势。结论以60Coγ射线照射后,C57BL/6J和C3H/HeN两种小鼠的LF生物学行为不同,C57BL/6J小鼠的LF呈“活化”状态,为该种小鼠易发生肺纤维化的细胞学基础提供了实验依据。     

互隔交链孢霉提取物诱发V_(79)细胞突变和NIH/3T3细胞转化作用的研究

本文报告首次用从食管癌高发区林县粮食中分离的互隔交链孢霉提取物261-B_2-3诱发体外培养的V_(79)细胞6-巯基鸟嘌呤耐受(TG~r)突变和NIH/3T3细胞形态转化获得成功。在实验组每毫升培养基中加入互隔交链孢霉提取物4、8、16和33微克可诱发V_(79)细胞突变,这一作用在有、无肝微粒体酶制作物激活的情况下,均获阳性。当互隔交链孢霉提物物浓度为每毫升培养基32、64和128微克时,可诱发NIH/3T3细胞产生相当高的克隆转化率,分别为35.47%、36.60%和43.14%。与对照组比有非常显著差异(p<0.01)。结果表明,该霉菌提取物中含有直接诱变物,并有可能含有致癌物。林县粮食中互隔交链孢霉的较重污染可能在该地区食管癌的发生中起一定作用。     

miR-425-5p靶向FOXJ3对乳腺癌细胞的作用研究

目的 探讨微小RNA-425-5p(miR-425-5p)靶向FOXJ3对乳腺癌细胞的作用.方法 用Lipofiectamine2000分别将miR-425-5p inhibitor及NC转染至MDA-MB-231乳腺癌细胞作为miR-425-5p inhibitor组和NC组,不做任何处理的为对照组.通过RT-qPC...     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古霉素A联合应用对胶质瘤细胞增殖和侵袭的作用

目的胶质瘤的化疗一直都是研究热点,近来有研究表明甲基化与胶质瘤的发生和发展关系密切,本研究的目的是探讨去甲基化试剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)和曲古霉素A(TSA)联合应用对胶质瘤细胞系侵袭和转移的调节。方法分别将浓度为50μM的5-氮杂-2'-脱氧胞苷和300ng/ml的曲古霉素A加入胶质瘤细胞系U251细胞中,并将两者联合应用加入U251细胞系中,应用MTT法检测不同处理组细胞的增殖能力,Transwell细胞侵袭实验检测不同处理组和对照组中细胞的侵袭能力的变化。结果 5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古霉素A单独处理后,U251细胞的增殖能力明显减弱(<0.05),两者联合应用时对U251细胞的增殖抑制更明显(<0.01)。Transwell细胞侵袭实验显示5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古霉素A单独处理后,U251细胞的侵袭细胞数明显减少(<0.05),而两者联合应用时对U251细胞的侵袭能力抑制更为明显(P<0.01)。结论 5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古霉素A都可以抑制胶质瘤细胞系的增殖和侵袭,两者具有协同作用。     

模拟微重力对NIH3T3细胞近日节律基因的影响

目的:研究模拟微重力对NIH3T3细胞近日节律基因表达水平的影响。方法:NIH3T3细胞按照模拟微重力的天数分为5组,RT-PCR检测节律基因mRNA的相对表达水平。结果:实验结果显示五组样品Per1、Per2、Cry1、Bmal1、Clock的相对表达水平存在显著性差异。Per1和Per2基因mRNA的相对表达水平在模拟微重力的第2天、第3天较0天显著升高(P0.05),Per2、Cry1和Clock基因mRNA的相对表达水平在模拟微重力的第4天较其他四组显著降低(P0.05)。结论:近日节律基因的相对表达水平在模拟微重力第2、3天升高,第4天后降低。模拟微重力影响近日节律基因的表达且具有时间依赖性。     

CT测定胸腰椎椎弓根进钉点与TSA及其在术中的应用

目的：通过术前CT测定胸腰椎椎弓根进钉点及水平椎弓根钉植入角（transverse screw angle,TSA），为术中椎弓根置钉操作提供一参照数据。方法：本组22例病人术前均行CT扫描，以关节突下缘为参照物，测定椎弓根进钉点的横线；以关节突外侧缘为参照物，测定椎弓根进钉点的纵线，从而确定了椎弓根进钉点，并测定TSA。结果：22例病人共置钉88枚，最高为T80，最低为L1，术后X光片及CT复查螺钉位置准确。结论：以关节突为参照物，通过术前CT测定椎弓根进钉点为TSA指导中置钉操作，有简便，直观及可靠的优点。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA诱导人乳腺癌细胞凋亡及自噬

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素(TSA)对人乳腺癌细胞凋亡及自噬的作用及其可能的分子机制。方法采用MTT法检测T47D细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;Western blot法检测凋亡及自噬相关蛋白的表达。结果 TSA对人乳腺癌细胞T47D具有增殖抑制作用(P0.05);TSA诱导T47D细胞发生凋亡,下调BCL-2/Bax比值,上调Caspase-3的表达(P0.05);同时自噬相关蛋白LC3B及Beclin-1的表达也明显增加(P0.05,P0.01)。结论 TSA体外能抑制乳腺癌细胞的增殖,其机制与诱导细胞凋亡和自噬作用有关。     

The effect of mouse interferon on the transformation of NIH/3T3 mouse cells by murine sarcoma virus.

The effect of interferon (IF) on transformation of NIH/3T3 cells by murine sarcoma virus (MSV) was studied. Two assays of MSV transformation independent of virus replication were used, focus formation under conditions where foci developed from cells infected with MSV alone and colony formation in agar suspension medium. Pretreatment of cells with purified IF (10⁴ units/ml) substantially inhibited transformation upon infection with MSV by about 90%. Reconstruction experiments showed that such IF treatment did not block focus or colony formation by cells already stably transformed by MSV. These results indicate that there is an IF sensitive early step in the transformation process.     

过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对不明原因复发性流产的治疗作用

目的观察过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（CD4＋CD25＋Treg）对不明原因流产的作用机制及妊娠预后的影响。方法以雌性CBA/J×雄性BALB/c为正常妊娠模型,以雌性CBA/J×雄性DBA/2J为自然流产模型,使用免疫磁珠方法分选雌性CBA/J小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg细胞,并使用流式细胞术检测分选纯度。采用TSA对流产孕鼠外周CD4^＋/CD25^-T细胞Foxp3基因特定位点进行表观修饰,以实现Foxp3稳定、持久的表达,并将CD4^＋Treg分别转输至流产模型孕4d（着床期）的雌性CBA/J孕鼠,于孕14d分别观察宿主孕鼠的胚胎吸收率。结果与对照组比较,过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋Treg细胞的宿主孕鼠的胚胎吸收率（11.27%）显著下降。结论孕早期过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋Treg细胞疗法能诱导宿主母胎免疫耐受,有利于妊娠的维持。     

几种促癌剂对NIH／3T3细胞经缝隙连结细胞间通信的影响

利用抓扒负荷法将荧光染料引入细胞内,观察细胞间荧光染料的扩散以判断经缝隙连结的细胞间通信。分析了促癌剂TPA、MZR和PB对细胞通信的影响。三者均能抑制细胞通信,在蛋白激酶C抑制剂PMC或STS存在下,TPA和MZR对细胞间通信的抑制作用被拈抗,而PB的作用不受影响。提示前两者对细胞间通信的抑制作用可能通过蛋白激酶C的中介,而PB可能通过其它途径起作用     

风湿性关节炎患者T细胞表达CCR5和CXCR3的三色流式细胞分析

目的 在单细胞水平上，研究类风湿性关节炎（RA）患者滑液及外周血中T淋巴细胞上CCR5及CXCR3的表达，并结合临床资料分析其在RA发病中的可能作用机制及临床应用。方法 分离15例RA患者的滑液单个核细胞（SFMC）、外周血单个核细胞（PBMC），及15正常人PBMC（对照），以三色荧光素标记物进行流式细胞术分析T细胞上CCR5及CXCR3的表达。结果 与PBMC相比较，RA患者SFMC中T细胞上CCR5及CXCR3的表达显著增高（特别是CCR5）；而CXCR3的表达个体差异较大；与正常人相比较，RA患者初发或活动期未治时，PBMC中CCR5及CXCR3的表达明显增多。CCR5及CXCR3的表达率与患者的ESR及CRP相关。结论 CCR5^ T细胞积聚在RA患者的病变关节内，且与RA的病情密切相关。