核基质对成骨细胞的调控作用

核基质蛋白及核基质结合蛋白在成骨细胞的增殖分化、信号转导以及凋亡等过程中均扮演着重要角色.本文概述了Nmp4/CIZ、Satb2、DNA TopoisomeraseⅡ等重要核基质蛋白在成骨细胞上述过程中的调控作用.     

烟草MAR的克隆及序列分析

目的克隆烟草核基质结合区（matrix attachment region,MAR）序列。方法根据MAR序列特征设计2对富含A/T引物,以提取的烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳鉴定后与T-载体连接,测序并进行序列分析。结果PCR扩增出三条DNA带,将其命名为TM1、TM2和TM3。与GenBank中注册的MAR进行序列同源性比较,结果显示TM1与Rb7之间DNA同源性高达99%。结论序列分析表明,三段DNA均具备MAR序列特征,其中TM2和TM3是两个新的MAR。     

引入CpG基序的嗜肺军团菌lgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达.方法 采用PCR方法 将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆人真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞.结果 通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpC中lvgA/CpC克隆片段长为657 bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7 Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合.用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达.结论 本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号.     

核骨架/核基质结合区及其功能研究的进展

长期以来的研究只能用结合试验来证明核基质结合区(MARs)的存在,对其真正的功能了解甚少.直到最近,人们才发现了MARs的一些生物学活性,MARs参与襻环的形成和染色体的高级包装,在真核生物的转录调控和凋亡方面起到了重要作用.对MARs的生物学功能仍在进一步的研究中,本文主要就MARs的结构、在转录调控中的作用及其它一些研究进展作一综述.     

运用蛋白质组学研究三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中核基质蛋白的变化

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对慢性粒细胞性白血病细胞系K562细胞核基质蛋白的影响. 方法:用DNA梯度电泳观察As2O3作用后K562细胞凋亡的情况.单向、双向电泳观察As2O3对K562细胞核基质蛋白分布影响. 结果:2.5 μmol/L As2O3处理72 h后,DNA电泳已能检测到发生凋亡的K562细胞,但早在As2O3处理48 h时, 即能观察到核基质蛋白分布的改变,此时尚不能观察到凋亡特征性的DNA片段梯形条带.双向电泳可检测出200多个核基质蛋白点,其中约18个点与As2O3处理相关. 结论:As2O3对K562细胞的影响是时间和剂量依赖性的.双向电泳检测As2O3对K562核基质蛋白分布的影响较DNA梯度电泳检测更为敏感.核基质蛋白成分可能是砷作用的靶蛋白,并且可能是药物发挥抗癌作用的关键点之一.     

人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用表达上调基因的鉴定

目的 探讨人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用后基因表达的变化。方法 人外周血单个核细胞（PBMC）与猪内皮细胞系PIEC共培养18h，对照组为未共培养的PBMC和PIEC。合成两组细胞的cDNA进行抑制消减杂交（SSH）。共培养中上调的cDNA用pGEM-T Easy载体进行T／A克隆，然后测序。用BLAST程序进行同源性分析。结果 经过SSH和克隆，获得一包含300克隆的消减文库。从文库中随机挑取24个克隆进行测序，并在GenBank中进行同源性比较，其中4个为已知的人的基因片段，8个为猪的表达序列标记（EST），9个片段与人的基因有高度的同源性。3个片段未检索到相匹配的同源性序列。结论 人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用的后有许多基因的表达上调。     

Raji 细胞基因组文库的构建与筛选

目的:构建Raji细胞基因组文库,用EBV DNA探针对文库进行筛选.方法:Raji细胞基因组DNA经Bam HI酶切消化后,低熔点琼脂糖回收9～23 kb的酶切DNA片段,通过匹配黏性末端与磷酸化的Lambda DASH Ⅱ Bam HI酶切载体臂连接,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体,测定原始文库与扩增文库的滴度,用同位素标记的EBV DNA探针对Raji细胞基因组文库进行筛选.结果:Raji细胞原始文库与扩增文库的滴度分别为1.8×105和2.8×108 pfu/mL.文库经筛选获得4个阳性克隆,随机挑取1个阳性克隆稀释后铺平板作进一步杂交鉴定,发现所有噬菌斑均有杂交信号,证明该克隆确为阳性克隆.抽提该阳性克隆DNA,进行BarnHI酶切鉴定,证实插入片段的长度为8.5 kb.经测序、BLAST序列比对,结果显示插入片段一侧为EBV Bam HI W片段,另一侧与人类15号染色体RP11-665A22克隆高度同源.结论:Raji细胞基因组文库的成功构建,为进一步克隆包含EBV整合位点的细胞基因组序列、探讨EBV整合参与肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础.     

扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。     

核基质研究现状与展望

引言Berezney和Coffey首先报导了真核细胞内核基质蛋白的存在。核基质是细胞桩内的一种动态非染色质结构，它调节DNA的功能并提供调控核酸功能活动的场所．近年来研究表明，视网膜母细胞瘤基因产物与棱基质间的互相作用对细胞周期的调节显得十分重要。核基质蛋白数量庞大且可变化，因化学修饰．浓度或某种新型蛋白出现而使核基质蛋白发生改变，     

核骨架/核基质结合区及其功能研究的进展

长期以来的研究只能用结合试验来证明核基质结合区(MARs)的存在,对其真正的功能了解甚少。直到最近,人们才发现了MARs的一些生物学活性,MARs参与襻环的形成和染色体的高级包装,在真核生物的转录调控和凋亡方面起到了重要作用。对MARs的生物学功能仍在进一步的研究中,本文主要就MARs的结构、在转录调控中的作用及其它一些研究进展作一综述。     

鸡α-珠蛋白基因5′端MAR调控GFP基因在COS7细胞中表达的研究

目的研究鸡α-珠蛋白基因5′端核基质结合区(matrix association region,MAR)的基因表达调控作用。方法采用PCR方法扩增鸡α-珠蛋白基因5′端1 600 bp长度的MAR,并将该MAR连接在pCMV/GFP载体CMV启动子上游和GFP报告基因下游,构建含2个MAR的真核表达载体pGFP/2MAR。采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS7细胞,用荧光显微镜和流式细胞术对荧光表达进行观察、定量。结果荧光显微镜观察pGFP/2MAR在转染48 h后荧光表达量明显高于pCMV/GFP的荧光表达量;流式细胞仪分析表明,在COS7细胞中pCMV/GFP和pGFP/2MAR的荧光表达量分别为17.9%和33.6%。结论该MAR确实能提高GFP在真核细胞中的表达量。     

从葎草花粉cDNA表达文库中筛选过敏性哮喘特异性变应原

目的 从葎草花粉cDNA表达文库中筛选过敏性哮喘特异性变应原.方法 应用葎草花粉过敏性哮喘患者血清对自行构建的葎草花粉cDNA λTripIEx2噬菌体表达文库进行免疫学筛选,提取阳性噬菌体DNA,EeoR I和HindⅢ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行DNA序列测定、重复序列分析和同源性分析.结果 经过3轮筛选,从cDNA表达文库中筛选获得3个葎草花粉特异性变应原cDNA克隆,其序列大小分别为868、550和592 bp.测序结果表明这3个克隆代表3个不同的cDNA序列,重复序列分析未发现重复序列,同源性分析表明与现有的基因均无高度同源性.结论 所获得的与过敏性哮喘相关的3个葎草花粉特异性变应原cDNA克隆可能为新基因,此发现为进一步制备重组变应原疫苗或核酸疫苗打下了良好基础.     

噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽

目的 用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽.方法 采用酶联免疫吸附测定法(EUSA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性.结果 经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列.序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列.MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显.结论 获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽.     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)功能区表位。方法 应用差减筛选法,以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库,通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选,从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合,而不与正常小鼠IgG结合,其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41.6%)及亲水氨基酸(最高达91.67%)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位,为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTEIH)功能区表位。方法 应用差减筛选法，以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库，通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选，从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合，而不与正常小鼠IgG结合，其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41．6％)及亲水氨基酸(最高达91．67％)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位，为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

河豚鱼基因组格式化粘粒文库的构建

目的 构建河豚鱼基因组文库,为人类基因组的研究提供资料。方法 以红鳍东方豚的精子ＤＮＡ为材料,采用含有”外显子捕获”元件的粘粒（ｓＣＯＧＨ２）作为载体,构建肖豚鱼的基因组粘粒文库。结果 该文库共有５７６００个克隆,分别被保存在６００块９６孔细胞培养板中,插入片段的大小平均为３５ｋｂ,相当于５．０个库容量,即从本文库中筛选到河豚鱼基因组任一单拷贝序列的机率为９９．２％。     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。