重组抗基因RNA与铁蛋白基因双启动子慢病毒表达载体的构建

目的 构建共表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.方法 将铁蛋白重链基因构建入线性化的慢病毒载体pGC-FU,以获得中间质粒pGC-FU-HF;进而将具有基因沉默效应的β-arrestin2抗基因RNA构建人中间质粒,以获得目的质粒pGC- agRNA- HF;通过病毒的包装和浓缩,应用Realtime PCR法检测重组慢病毒的滴度,应用NG108-15细胞,采用Western blot和实时定量PCR检测抗基因RNA的基因沉默效应和铁蛋白的表达.结果 抗基因RNA与铁蛋白均成功构建入慢病毒表达载体,病毒滴度2.00×109 TU/ml,该病毒转染NG108-15细胞后,β-arrestin2表达下调,铁蛋白表达上调.结论 成功构建了表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.     

小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.Western blot鉴定最有效的siRNA序列为5'-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3',病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.     

人分化抑制蛋白1慢病毒干扰载体的构建、筛选及其沉默效应的鉴定

目的探索以小干扰RNA（si RNA）慢病毒干扰载体组建的慢病毒对人Hep G2细胞分化抑制蛋白1（Id1）基因的沉默效应。方法构建4种针对Id1基因不同干扰靶点的Id1-siRNA慢病毒干扰载体（pCGSIL-GFPId1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）,将其转染至293T细胞,以筛选出针对Id1基因的最有效的RNA干扰（RNAi）靶序列。再以沉默效果最优的干扰载体进一步构建慢病毒（Id1-RNAi-LV）,感染人HepG2细胞后,采用实时定量PCR法和Western blot法分别检测其Id1 mRNA及其蛋白的表达水平。结果与pCGSIL-GFP-Id1-1组、pCGSIL-GFP-Id1-2组及p CGSIL-GFP-Id1-3组比较,pCGSIL-GFP-Id1-4组的Id1蛋白表达水平最低（P〈0.05）,沉默效果最优。以pCGSIL-GFP-Id1-4干扰载体组建慢病毒后,测得慢病毒的病毒滴度为2.0×10^9 TU/mL。与空白对照组和阴性对照组比较,以组建的慢病毒感染人HepG2细胞后,人HepG2细胞中Id1m RNA及其蛋白的表达水平均降低（P〈0.05）。结论本实验构建的特异性慢病毒可稳定地介导Id1基因的沉默。     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

人CCL5基因RNA干扰慢病毒载体的构建

目的 构建人CCL5基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 根据人CCL5基因信息,构建4个携带RNAi序列的pGCSIL-GFP质粒,与pHelper 1.0、Helper 2.0质粒一起利用293T细胞进行慢病毒包装.用CCL5 RNAi慢病毒载体感染人宫颈癌细胞(Hela),使用RT-PCR方法验证其干扰效率.结果 4个靶点中有3个靶点(a1、a2、a3)在Hela细胞上对CCL5基因的表达都有非常显著的敲减效果,敲减效率均达到95%以上.结论 构建的CCL5 RNAi慢病毒载体在Hela细胞中有较高的敲减效率,提示RNAi技术能够使细胞CCL5基因沉默.     

慢病毒介导的RNA干扰对小鼠胰腺星状细胞中半乳糖凝集素-1基因沉默效应的研究

目的:评价慢病毒介导的RNA干扰技术对小鼠胰腺星状细胞(mPSC)中半乳糖凝集素-1(galectin-1)基因的沉默效应,并观察其对mPSC增殖的影响。方法:设计并合成3条galectin-1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒PLKO.1-PURO载体中。从慢病毒包装转染的293T细胞,获得病毒上清感染的mPSC;采用嘌呤霉素(2μg/μL)筛选出慢病毒感染成功的mPSC。实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法检测mPSC中galectin-1 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测mPSC的增值能力。结果:PCR扩增和测序表明成功构建galectin-1慢病毒干扰载体,可以有效沉默mPSC中galectin-1基因的表达。构建的RNAi慢病毒载体感染mPSC后galectin-1 mRNA表达量同对照组比较,分别为(19.4±4.8)%、(6.2±4.3)%、(27.6±5.7)%,galectin-1蛋白表达量同对照组比较分别为(25.9±3.6)%、(10.8±4.1)%、(30.2±3.2)%。稳定的galectin-1沉默mPSC在第4天细胞增殖能力下降(22.9±2.7)%(P     

介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础.方法：以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定.结果：Ppif的短发夹RNA（shR-NA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致.结论：构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础.     

人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。     

靶向线粒体转录因子A大鼠活体RNA干扰实验动物模型的建立

目的：在体外构建并筛选出靶向线粒体转录因子A（TFAM）的有效RNA干扰慢病毒载体,用于大鼠整体RNAi实验,观察其对肝组织中目的基因表达的干扰效果。方法：设计4条siRNA序列并合成双链DNAoligo,制备目的基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染目的细胞,利用RT-PCR和Western blot的方法检测目的基因TFAM的表达情况,从而筛选出有效的干扰靶点。构建大鼠活体RNAi动物模型,观察大鼠肝脏中靶基因表达的变化情况。结果：酶切鉴定及测序结果均提示siRNA序列成功连接入载体中。RT-PCR结果提示3号靶点的干扰效率最高,达到了55%左右,Western blot也验证了其干扰的有效性。大鼠活体RNAi结果显示,肝脏中目的基因的表达也明显减少,这种表达减弱具有特异性和靶向性。结论：TFAM靶向RNA干扰慢病毒载体构建成功,能有效抑制目的细胞中线粒体转录因子A的表达。构建的慢病毒载体在大鼠活体内也具有良好的干扰效果。该研究为下一步利用此慢病毒载体进行活体RNA干扰打下了基础。     

稳定沉默Rictor表达的前列腺癌CWR22RV1的构建

目的 应用RNA沉默技术下调前列腺癌CWR22RV1细胞株的Rictor基因表达,并筛选具有稳定转染Rictor-shRNA的细胞株,为进一步研究Rictor在前列腺癌中的作用打下基础.方法 针对Rictor基因设计合成siRNA序列;鉴定、测序并转染293T细胞观察基因表达情况;构建Rictor-shRNA慢病毒载体;进行Rictor-shRNA慢病毒包装及滴度测定;筛选稳定表达Rictor-shRNA的前列腺癌CWR22RV1细胞株;Western blot检测稳定转染前列腺癌CWR22RV1细胞株Rictor的表达水平.结果 Rictor-shRNA慢病毒成功包装后转染前列腺癌CWR22RV1细胞,进行嘌呤霉素筛选,获得沉默Rictor基因的前列腺癌CWR22RV1细胞株,Western blot检测显示该细胞株Rictor水平明显降低(P＜0.01).结论 成功构建了稳定沉默Rictor表达的前列腺癌CWR22RV1细胞株,为后续的实验了打下坚实的基础.     

PKCγ基因RNAi慢病毒载体的构建

目的 构建蛋白激酶Cγ(PKCγ)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的PKCT基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸序列(Oligo)DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCSIL-GFP载体[含U_6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接,转化DH5a大肠杆菌,挑选重组阳性克隆行PCR鉴定和DNA测序.用pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,逐孔稀释滴度法测定病毒滴度.结果 PCR鉴定结果显示,以经双酶切后未插入片断的pGCSIL-GFP空载体(PCR产物为306 bp)为对照,重组细菌克隆的PCR产物为343 bp(插入片段为37 bp),鉴定结果与预期相符.测序结果显示,合成的PKCT基因shRNA寡核苷酸链序列插入正确.包装慢病毒,浓缩慢病毒悬液的滴度为1×10~9 TU/ml.结论 成功构建了PKCT基因shRNA慢病毒载体.     

shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞CXCR7表达的影响

目的 探讨CXCR7的shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞HT-29 CXCR7表达的影响.方法 设计CXCR7的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的plVTHM载体连接,构建3种重组穿梭质粒plVTHM shRNA1,plVTHM shRNA2和plVTHM shR-NA3,并转化于DH5α感受态细胞,Amp筛选阳性克隆,抽取质粒行酶切鉴定并测序.分别将3种重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度.将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人结肠癌细胞HT-29,实时定量PCR和Western blot分别检测CXCR7 mRNA和蛋白的沉默效果.结果 酶切鉴定及测序结果 证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为6×107 TU/mL,4×107 TU/mL和5×107 TU/mL.感染HT-29后,CXCR7 mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P＜0.05);其中以LV-CXCR7 shRNA-2和LV-CXCR7 shRNA-3作用显著,mRNA表达分别下调72%和67%,蛋白表达下调68%和55%(P＜0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P＞0.05)结论 成功构建了3种CXCR7 shRNA慢病毒表达,可有效下调HT-29细胞CXCR7mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础.     

转铁蛋白受体介导的Survivin对U251细胞生长的抑制作用

目的 构建Survivin短发夹状RNA(shBNA)序列的表达载体并观察其对神经胶质瘤细胞U251生长的抑制作用.方法 针对Survivin基因编码shRNA的序列,克隆到携带绿色荧光蛋白基因的载体,经酶切电泳和DNA测序鉴定.采用转铁蛋白.多聚乙烯亚胺(Tf-PEI)介导的转染方法 将重组的shRNA质粒转入U251细胞后,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测Survivin inRNA和蛋白表达;采用MTF法测定细胞增殖.结果 编码短发夹状的RNA序列被成功地插入到预期位点.转染Survivin shRNA1、shRNA2载体分别入U251细胞后,其bcl-2蛋白表达水平均显著降低,P＜0.05.U251细胞在48、72和96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的Survivin shRNA可特异性地抑制U251细胞生长.     

沉默胰岛素样生长因子1类受体基因对胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术建立稳定低表达胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的人胰腺癌Panc-1细胞株,并观察其对吉西他滨化疗敏感性的影响.方法 设计并合成3条针对IGF1R基因特异性的RNA干扰靶点,构建慢病毒pFU-GW-RNAi载体,经包装后转染293T细胞,获得病毒上清并测定其相应滴度;感染Panc-1细胞,通过实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染人胰腺癌Panc-1细胞,获得稳定转染细胞株.噻唑蓝(MTT)比色法检测干扰IGF1R后Panc-1细胞对吉西他滨敏感性的变化.裸鼠移植瘤模型检测干扰IGF1R前后体内成瘤能力及吉西他滨对移植瘤生长的抑制作用.结果 在Panc-1细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,吉西他滨对Panc-1细胞的半数抑制剂量(IC50)从(0.774±0.001)mg/L下降到(0.330±0.003)mg/L,Panc-1细胞对吉西他滨的敏感性增加了2.35倍.裸鼠移植瘤模型中,干扰IGF1R基因后皮下种植瘤生长缓慢,联合应用吉西他滨后对肿瘤生长的抑制作用进一步增加.结论 慢病毒介导的RNA干扰技术特异性沉默IGF1R基因,能显著增强胰腺癌细胞株Panc-1对吉西他滨的敏感性.

Abstract：

Objective To construct the lentiviral expression vector for RNA interference of insulin like growth factor-1 receptor (IGF1R) gene in human pancreatic cancer cells and to evaluate its effect on chemosensitivity to gemcitabine.Methods Three sequences of RNA interference targeting IGF1R gene were designed, synthesized and cloned into the pFU-GW-RNAi vector. After transfection of 293T cells with lentiviral vector, the lentivirus was produced and the titer of virus was tested. Panc-1 cells were infected with the lentivirus and the expression of IGF1R mRNA in Panc-1 cells was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR). The changes of gemcitabine sensitivity after RNA interference were examined by methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay. In vivo nude mice tumorigenicity model was used to determine the effect of RNA interference targeting IGF1R gene combined with or without gemcitabine on growth inhibition of xenograft tumors.Results A recombinant lentiviral vector expressing shRNA against IGF1R gene was obtained. After RNA interference, the median inhibition concentration (IC50) of gemcitabine against Panc-1 cells was reduced from (0.774±0.001) mg/L to (0.330±0.003) mg/L, indicating that the sensitivity to gemcitabine was increased by 2.35 times after interference. In vivo xenograft formation assay resulted in a significant growth-inhibiting effect by IGF1R RNA interference. Furthermore, the RNA interference targeting IGF1R gene enhanced the antiproliferative effect of gemcitabine on nude mice xenografts.Conclusion The sensitivity of Panc-1 cells to gemcitabine could be enhanced by RNA interference targeting IGF1R gene.     

人胸腺素β4 RNA干扰载体的构建及其对293T细胞目的基因表达的影响

目的探讨人胸腺素β4（thymosin β4,TMSB4）基因RNA干扰慢病毒载体的构建,观察病毒感染293T细胞后TMSB4 mRNA和蛋白表达,为进一步研究TMSB4基因的功能提供基础。方法设计特异性干扰人TMSB4基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNAoligo,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生慢病毒载体。转化感受态大肠杆菌DH5a并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定。慢病毒载体、包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将获得的慢病毒感染293T细胞,分别采用实时定量PCR和免疫细胞化学染色方法观察TMSB4 mRNA和蛋白的表达情况,利用生成的TMSB4 shRNA慢病毒感染原代成纤维细胞。结果感染重组慢病毒的293T细胞与空病毒转染阴性对照细胞的TMSB4 mRNA表达分别为0.56±0.11和1.00±0.06（P=0.0006）,实验组细胞的敲减率为44%。实验组TMSB4蛋白表达水平0.042±0.007比阴性对照组细胞0.093±0.009的表达降低55%（H=461.342,P〈0.001）。感染重组慢病毒的原代培养的成纤维细胞与空病毒转染的对照细胞相比,TMSB4蛋白表达水平亦明显降低。结论TMSB4基因干扰慢病毒构建成功并能显著降低TMSB4基因和蛋白在293T细胞中的表达,成功感染原代成纤维细胞使其目的基因蛋白减少,为进一步研究TMSB4基因的功能奠定研究基础。     

人白介素-8 shRNA慢病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携载人白介素-8(IL-8)shRNA的慢病毒并鉴定其对MDA-MB-231细胞该基因的沉默效率。方法:设计两个IL-8基因特异性siRNA靶点,与pMagic7.1慢病毒载体质粒重组,经PCR鉴定并测序,通过293T细胞实现慢病毒包装,DNA定量试剂盒分别检测两种慢病毒滴度。将这两种慢病毒分别以最佳感染复数感染MDA-MB-231细胞,通过Real-time PCR检测IL-8沉默效率。结果:PCR鉴定阳性的shRNA重组质粒测序正确,包装后两种病毒滴度分别为1.93×109 IU/mL和1.89×109IU/mL;分别以MOI=40感染MDA-MB-231细胞后,IL-8沉默效率分别为80%和90%。结论:成功构建IL-8 shRNA慢病毒并达到较高的沉默效率,为下一步研究沉默靶基因后细胞生物学功能变化提供实验基础。     

慢病毒介导的RNA干扰对大鼠神经元PKCγ mRNA及蛋白表达的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大鼠神经元PKCymRNA及蛋白表达的影响.方法 孕16 d的SD大鼠,原代培养大鼠胚胎皮层神经元,随机分为3组,每组6孔,对照组(C组):不行任何处理;阴性对照组(NC组):每孔加入阴性对照慢病毒3×105个;RNAi组:每孔中加入编码PKCγ shRNA的慢病毒载体(LV-PKCγ shRNA)颗粒3×105个.5 d后采用RT-PCR和Western blot法检测PKCγ mRNA和蛋白的表达水平,并计算干扰效率.结果 与C组比较,RNAi组大鼠神经元PKCγ mRNA及其蛋白表达水平均降低(P<0.05),NC组上述指标差异无统计学意义(P>0.05).基因干扰效率99.3%,蛋白干扰效率85.2%.结论 慢病毒介导的RNAi可有效地下调大鼠原代神经元PKCγ基因及其蛋白的表达.     

腺病毒载体介导的Polo样激酶1短发夹环RNA对胶质瘤体内外增殖的抑制作用

目的探讨重组腺病毒载体介导的Polo样激酶1（PLK1）短发夹环RNA（shRNA）对人胶质瘤细胞株U251在体内外增殖的抑制作用。方法设计并合成针对PLK1的shRNA,并克隆至真核表达载体pEGFP—H1上,再将H1启动子和shRNA亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack上,通过在携带有pAdeasy-1质粒的BJ5183细菌内同源重组,生成针对PLK1的shRNA重组腺病毒载体pAD-H1／PLK1,经293细胞包装产生重组腺病毒AD-H1／PLK1,感染U251细胞。应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）的方法检测U251细胞PLK1mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡以及细胞G2／M期转变情况,以噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞的增殖活性。同时制备裸鼠U251细胞移植瘤模型并注射重组腺病毒,观察肿瘤生长情况。结果成功构建针对PLK1基因的RNA干扰腺病毒表达载体,与AD-H1组比较AD-H1／PLK1组在转染24h和48hU251细胞PLK1mRNA表达水平分别降低50．4％（P〈0．01）和71．9％（P〈0．01）。且感染AD-H1／PLK1病毒48h后的U251细胞凋亡率从8．3％升至65．6％（P〈0．01）,而G2／M期的细胞从21．5％增至51．4％（P〈0．01）,细胞的增殖能力则下降50％（P〈0．01）。体内实验表明重组腺病毒载体介导的PLK1shRNA也明显抑制肿瘤生长（P〈0．01）。结论腺病毒介导的RNA干扰技术可有效降低PLK1在胶质瘤细胞中的表达水平,抑制肿瘤细胞在体内外的增殖活性。     

LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的：构建人LMP-1重组慢病毒载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,检测LMP-1基因在大鼠骨髓间充质干细胞的表达。方法：利用PCR法从cDNA文库中钓取LMP-1基因,将其与经AgeI酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU-EGFP相连接,转化感受态大肠杆菌,筛选出阳性克隆pGC-FU-LMP-1-EGFP,基因测序对其鉴定。经293T细胞包装后,收集富舍病毒颗粒LV-LMP-1-EGFP的细胞上清,浓缩并标定滴度,RT-PCR检测并鉴定。以最佳MOI值体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察转染是否成功,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Westernblot检测转染细胞LMP-1基因的表达。结果：①基因测序及RT-PCR检测证实携带人LMP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为2×10^8 TU／ml的LV-LMP-1-EGFP。②以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率可达93．5％,经RT-PCR与Westernblot检测,被转染细胞内有LMP-1基因表达。结论：成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因。