人载脂蛋白C3基因转基因小鼠的建立及血脂变化分析

目的制备系统性表达人载脂蛋白C3(APOC3)基因的转基因小鼠,建立高血脂小鼠模型。方法将人APOC3基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOC3转基因C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标,脂肪染色观察肝脏脂肪水平。结果建立了高表达人APOC3基因的转基因小鼠品系;转入的人APOC3基因在血液、肝脏、小肠、肌肉、心脏、肾脏、脾脏中均有明显表达;不同月龄转基因小鼠的血浆甘油三酯水平明显高于同龄野生型小鼠;转基因小鼠的肝脏脂肪含量高于野生型小鼠。结论系统性表达人APOC3基因的转基因小鼠表现高脂血症表型,可以作为高血脂以及高血脂相关的心血管病的工具动物。     

Dkk3系统性表达转基因小鼠的建立

目的建立系统性表达Dkk3转基因模型小鼠,为研究Dkk3生理功能及对骨生长发育的作用提供工具动物。方法通过ISH来观察Dkk3于C57BL/6J小鼠全身组织中的表达。把Dkk3基因插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J Dkk3转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测Dkk3在骨髓中的表达,Western Blot检测Dkk3在肺脏、脑及肝脏中的表达,BrdU标记染色观察转基因小鼠骨生长情况。结果在生理状态下,Dkk3基因广泛表达,在骨、心脏及脑等组织高表达。建立的2个转基因小鼠品系中,转入的Dkk3基因在骨髓、脑、肝脏及肺组织中均有明显表达。BrdU整合率实验显示转基因小鼠长骨骺区细胞增殖明显低于同龄对照小鼠。结论建立了系统性表达Dkk3转基因小鼠,转入的Dkk3基因明显抑制小鼠长骨骨骺区细胞增殖,为Dkk3对骨生长发育的作用研究提供了有价值的工具动物。     

Nestin转基因小鼠模型的建立及nestin基因在器官中的表达

目的构建人nestin基因表达载体,制备nestin过表达转基因小鼠。方法以人神经胶质瘤细胞株U251的cDNA为模板,分
3段扩增出nestin基因cDNA全序列,并将其克隆入含有强启动子ROSA26的pBROAD3载体,酶切鉴定、测序,除去原核序列,
纯化。显微原核注射建立转基因小鼠。PCR验证nestin基因整合,确定建立首建者。将阳性鼠传代。Western blot方法检测F3
代转基因小鼠与野生型小鼠主要器官（心、肺、脑、肾）的nestin 表达。结果测序结果证明成功构建了受ROSA26启动子调控的
nestin转基因载体。出生34只小鼠,PCR检测证实存在首建者2只。Western blot方法证实,与野生型小鼠相比,F3代转基因小
鼠脑、肺组织存在较高水平nestin 表达。结论首次成功建立nestin过表达转基因小鼠,外源基因可遗传到子代并在脑和肺组织
中稳定表达,为深入研究nestin在肿瘤转移、细胞“干性”的维持和细胞的分化等功能提供了良好的实验动物模型。
     

人载脂蛋白A1基因转基因小鼠的建立

目的 建立系统性表达人载脂蛋白Al(APOA1)基因的转基因小鼠.方法 将人APOA1基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOA1转基因C57BL/6J小鼠.并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标.结果 建立了2个不同表达水平的人APOA1基因的转基因小鼠品系;转入的人APOA1基因在血液、肝脏、心脏、肾脏、脾脏、血管组织中均有明显表达;血生化分析结果显示不同月龄转基因小鼠的血浆高密度脂蛋白胆固醇水平高于同龄的野生型小鼠,甘油三酯水平低于同龄野生型小鼠.结论 成功建立了系统性表达人APOA1基因的转基因小鼠,为研究高血脂以及高血脂相关的心血管病提供了工具.     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用.方法 Western blot检测小鼠NOL3表达谱.构建αMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠.PCR 鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型.结果 NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变.通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加.单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化.结论 成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具.     

异种肝移植转基因小鼠模型的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59cDNA的启动子，CMV作为报告基因GFP的启动子，构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV—GFP—OMT-CD59基因片断注射入昆明种白小鼠受精卵。结果 产生出86只F0代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性，进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠，可用于进一步异种移植研究。     

β-肌动蛋白启动子指导下人bcl-2转基因小鼠模型的建立

目的: 通过原核注射法将肌动蛋白启动子/bcl-2基因转入小鼠受精卵,制作转bcl-2基因的小鼠. 方法: 构建β-actin启动子/bcl-2表达载体,小鼠进行超排获得原核期胚胎,应用原核注射法进行转基因操作,对新生小鼠通过基因组DNA PCR和Southern blot方法进行鉴定. 结果: 注射成功率为58%(580/1000),新生小鼠为33只,PCR检测转基因阳性为8只,经过Southern杂交检测有4只转基因阳性鼠. 结论: 通过原核注射法获得转bcl-2基因的阳性小鼠,建立bcl-2转基因动物模型,为脑缺血再灌注损伤的机制研究提供手段.     

人突变的载脂蛋白E对转基因小鼠学习与记忆能力的影响

目的 研究突变的人载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）对大脑皮层功能的影响。方法 以Ｆ１代ａｐｏＥ４与ａｐｏＥ７转基因小鼠为研究对象,分别用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析及ＥＬＩＳＡ检测人ａｐｏＥ基因在Ｆ１代小鼠染色体上的整合与在血中的表达;以主动回避实验检测小鼠的学习能力和短期与长期记忆能力的变化,同时用酶法测定Ｆ１代小鼠的血脂水平。结果 （１）人ａｐｏＥ４和ａｐｏＥ７基因稳定地整合于Ｆ１代小鼠染色体上并高效表达于     

Plunc序列启动子转基因小鼠模型的建立

目的利用携带有鼻咽组织相对特异性启动子plunc构建的载体建立转基因动物模型。方法将plunc-EGFP质粒用XhoⅠ酶切线性化,胶回收线性化片段,稀释浓度4 μg/ml。采用显微注射法将外源基因注射入小鼠受精卵细胞内。结果产13只小鼠。PCR检测基因整合,其中阳性12只,阳性率92.30%;Southern blot检测阳性3只,阳性率23%。结论鼻咽组织相对特异性启动子plunc可有效地将外源基因整合入小鼠体内。     

脑组织特异表达胆囊收缩素转基因小鼠的建立

目的建立在脑内特异表达胆囊收缩素(CCK)转基因小鼠,研究CCK表达在中枢对饮食行为和代谢的影响。方法构建PDGF-CCK表达载体,利用显微注射法将目的片断注射到受精卵的雄原核中,建立CCK转基因小鼠。通过PCR的方法鉴定转基因鼠的基因型。采用Western Blotting方法鉴定CCK在脑内的表达。用试剂盒测定小鼠血脂并进行统计学分析。结果得到了3个CCK转基因品系,其中2个转基因品系脑内CCK表达量比野生鼠明显增加。高表达CCK的转基因小鼠在正常饲养的情况下体重低于阴性鼠,但血脂未发现显著差异。结论脑内高表达CCK可在一定程度上导致小鼠体重减轻。     

神经组织特异表达CTF1转基因小鼠的建立

目的建立神经组织特异表达CTF1的转基因模型小鼠,为研究CTF1生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制的关系提供工具动物。方法把CTF1基因插入神经组织特异的启动子PDGF下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J CTF1转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Western Blot方法鉴定CTF1在脑组织中的表达,对转基因小鼠脑组织进行石蜡切片,HE染色,显微镜观察组织结构形态的改变。结果建立了2个不同表达水平的CTF1转基因小鼠品系。转入的CTF1基因在脑组织的表达水平均高于同龄对照小鼠。组织学分析显示CTF1转基因小鼠大小脑组织基本结构形态未见异常。结论成功建立了稳定遗传的神经组织特异表达CTF1转基因小鼠品系,为CTF1的生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制关系的研究提供了有力的模型工具。     

IL34转基因小鼠的建立和表型分析

目的建立白介素34转基因小鼠,研究该基因在小鼠中表达对小鼠免疫系统的作用。方法把人的IL34基因插入CMV启动子下,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立IL34转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定IL34转基因小鼠的基因表型,Western blotting检测IL34蛋白的表达水平,组织化学染色观察IL34转基因小鼠重要器官的病理改变。结果建立了2个品系的IL34转基因小鼠。转入的人IL34基因在脾脏中的表达水平高于内源性IL34。组织学分析显示IL34转基因小鼠各重要器官如脑,心,肝,肾,肠等的形态结构均正常,但脾脏的生发中心比较活跃,白髓的范围比野生型小鼠大。结论成功建立了IL34转基因小鼠,IL34基因的过度表达对免疫系统作用需要进一步探讨。     

HBsAg转基因小鼠模型的建立及其用于基因治疗研究初探

目的构建HBsAg转基因小鼠模型,并利用其进行基因治疗研究。方法显微注射外源基因pcDNAHBsAg至FVB小鼠原核,注射胚胎移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。通过ELISA方法比较分析转基因小鼠经pcDNAHBsAg质粒基因免疫后抗体产生的情况。结果PCR结合Southern检测到了HBsAg阳性小鼠。基因免疫有抗体产生。结论得到的HBsAg转基因小鼠,基因免疫可诱发转基因小鼠产生抗体。     

建立转bcl-xL基因小鼠的研究

目的 建立转bcl—xL基因小鼠，继而传代建系，用于缺血性脑血管疾病的研究。方法 采用显微注射法，将人bcl—xL基因注入民明小白鼠受精卵获得子代鼠，然后作PCR、Southern—blot、mRNA、Western—blot检测以获得阳性鼠。结果 实验中注射受精卵1654枚，移植卵数1448枚，受体鼠49只，怀孕鼠7只，子代鼠13只，整合4只并均有表达。注射受精卵的存活率87．54％，受精卵的总存活率0．78％，受体鼠的怀孕率14．28％，整合效率30．77％，总有效率为0．24％。结论 获得了转bcl—xL基因小鼠，但转基因的效率较低，表达不稳定。     

人载脂蛋白E7转基因小鼠肾脏cDNA削减文库与cDNA文库

目的　以人apoE7基因制备的高脂血症转基因小鼠模型已建成 ,要用于探查这一突变基因致病的分子机制 ,首先揭示人apoE7在小鼠体内诱发了那些基因的表达异常 ,是重要的环节之一。cDNA削减文库是寻找异常高表达的已知和未知基因有效的手段 ,而cDNA文库更是获取全长基因所必须。方法　自正常小鼠与转基因小鼠肾脏同时提取总RNA ,再分离mRNA ,逆转录制备cDNA后 ,用两次分子杂交削除转基因鼠cDNA中与正常小鼠相同的部分 ,再用PCR与择需PCR法扩增转基因鼠特异的基因 ,克隆入pGEM T载体后 ,制备削减文库。未经削减的转基因小鼠cDNA克隆入λgt11载体 ,制备基因表达文库。结果和结论　自高脂血症转基因小鼠肾脏构建的削减文库得到约 4 0 0个削减克隆 ,测定了部分克隆的序列 ,并进行同源性比较。λgt11 cDNA文库滴度 1 7× 10 7pfu ml,随机测定的克隆其插入片段长约 5 0 0bp以上。     

心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠的建立和表型分析

目的建立心脏特异表达小鼠24-脱氢胆固醇还原酶基因（Dhcr24）转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用。方法RT-PCR法克隆小鼠24-脱氢胆固醇还原酶基因,把Dhcr24基因插入-αMHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dhcr24 C57BL/6J转基因小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR和Western Blotting检测基因表达水平,光学显微镜和超声检测不同月龄Dhcr24转基因小鼠心脏的组织结构改变。结果建立了2个品系的心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠。转入的Dhcr24基因在心脏组织的表达水平超过内源性Dhcr24的3倍。心脏组织学和超声检查证实：Dhcr24转基因小鼠的心室壁变厚,心腔变小,但心脏功能保持正常。结论成功建立了心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠,Dhcr24基因在心脏组织的过度表达对小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步探讨。     

系统表达HB-EGF转基因小鼠的建立

目的建立系统表达肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的转基因动物模型,利用转基因动物模型研究HB-EGF与组织纤维化的关系。方法RT-PCR法克隆小鼠HB-EGF基因,将其插入Chickenβ-actin启动子下游,构建Chickenβ-actin-HB-EGF表达载体,利用显微注射的技术把表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立HB-EGF转基因小鼠。利用特异引物PCR的方法鉴定转基因的基因型,采用Western Blot方法鉴定HB-EGF基因在全身组织的表达。分别取HB-EGF转基因鼠与同窝阴性小鼠的肝、肾、肺及膀胱组织进行Massion染色。结果建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,Western Blot发现其HB-EGF在肝、肺、肾及膀胱的表达与同窝阴性对照小鼠相比明显增加。Massion染色结果表明转基因鼠肝、肺、肾及膀胱组织纤维化程度明显高于同窝阴性对照小鼠。结论成功建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,HB-EGF的过度表可显著加重组织纤维化程度。     

Cramp转基因小鼠的构建及鉴定

目的建立系统性表达Cramp转基因模型小鼠,为研究Cramp在衰老中的作用提供模型动物。方法把Cramp cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立Cramp转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,用RT-PCR和Western blotting方法筛选高表达品系。结果成功构建Cramp cDNA转基因载体,建立了Cramp转基因小鼠,通过RT-PCR和Western blotting方法筛选出3个高表达品系。结论建立了系统表达Cramp转基因小鼠,转入的Cramp基因在骨髓、脾脏、肝脏等组织高表达,为研究Cramp基因在衰老中的作用及机制提供了动物模型。