腺病毒载体对骨髓间充质干细胞体外分化能力的影响

目的 研究腺病毒栽体对Wistar大鼠骨髓间充质干细胞体外分化能力的影响.方法 密度梯度离心加贴壁培养法自2周龄Wistar大鼠骨髓中分离培养MSC,用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)感染,48 h后用流式细胞议拴测感染效率;在特殊诱导剂诱导下,用碱性磷酸酶(ALP)染色、ALP活性及油红O染色分别鉴定腺病毒栽体对MSCs成骨和成脂分化潜能的影响.结果 Ad-GFP感染MSC 48 h后97.82%的细胞表达GFP;MSC经特异性诱导剂诱导后可向脂肪及成骨细胞分化,Ad-GFP感染对MSC成脂及成骨分化能力无显著影响.结论 腺病毒载体对大鼠骨髓MSC感染效率高,且不影响其体外多向分化潜能,是基因修饰MSC的理想载体.     

绿色荧光蛋白标记人脂肪基质细胞成骨分化能力体外实验研究

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)基因体外转染人脂肪基质细胞的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法体外分离培养人脂肪基质细胞,用重组腺病毒载体Ad-GFP及脂质体介导质粒pEGFP-C1两种方法转染GFP基因,通过流式细胞术观察比较GFP转染和表达的结果;倒置显微镜下观察细胞生长情况;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果重组GFP基因的腺病毒Ad-GFP转染的脂肪基质细胞的感染率达(42.5±1.5)%,16h即有GFP表达,7d时表达趋于稳定,感染6周时仍可见有GFP表达,明显优于脂质体转染组(转染效率最高为11.4%)。感染Ad-GFP后的脂肪基质细胞与未感染的对照组脂肪基质细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶(ALP)表达均逐渐增高,两组间差异无统计学意义(P>0.05);诱导21d后两组均见到茜素红钙盐染色阳性。结论重组GFP基因的腺病毒载体Ad-GFP可高效率感染脂肪基质细胞,基因转染后细胞的增殖分化能力未受到影响,可以作为一种高效可靠的人脂肪基质细胞标记方法。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

5-氮杂胞苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化过程中PPARγ表达及其作用

目的探讨5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞(MSC)分化过程中PPARγ的表达情况及其在细胞分化过程中的作用.方法利用原代培养小鼠MSC,5-氮杂胞苷诱导分化;脂质体转染法,将pEGFP-N1-PPARγ2表达质粒转入MSC中,G418筛选,RT-PCR检测PPARγmRNA表达,免疫组化检测myosin及PPARγ表达.油红O染色检测细胞内脂滴.结果 MSC在未诱导时不表达PPARγ,经5-氮杂胞苷诱导后,多数细胞向成肌细胞分化,部分细胞表达PPARγ且向成脂肪细胞分化;pEGFP-N1- PPARγ2转染成功的细胞均分化为脂肪细胞.结论 5-氮杂胞苷不仅诱导MSC向成肌细胞分化,也诱导其向成脂肪细胞分化;其诱导MSC向成脂肪细胞分化可能与PPARγ表达有关.     

OCT4介导肝细胞去分化过程中巢蛋白的表达及意义探讨

目的探讨OCT4介导的原代肝细胞去分化过程中巢蛋白（nestin）的表达及其意义。方法体外分离培养小鼠原代肝细胞。包装、浓缩表达OCT4的慢病毒并感染肝细胞。观察细胞的形态变化,用RT-PCR法监测nestin、白蛋白（albumin,ALB）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）以及叉头框A2（FOXA2）的表达并进行定量分析。结果 OCT4慢病毒感染后,肝细胞内颗粒逐渐释出,并在7 d左右开始出现肝细胞增殖。在肝细胞ALB减弱,AFP、FOXA2增强的过程中,nestin从第3天持续至第9天,表达逐渐增强,从12 d起开始减弱,至18 d时上述基因的表达几近消失。结论 Nestin的表达伴随肝细胞去分化和增殖的过程。     

雌激素受体α和β在间充质干细胞体外成骨、成脂肪分化中的表达变化

目的：研究间充质干细胞（MSC）体外成骨、成脂肪分化与雌激素受体α和β表达变化的关系及其意义。方法：体外分离培养人MSC,流式细胞术鉴定其表型,加入成骨和成脂肪诱导剂,使用RTPCR法检测骨桥蛋白（Osteopontin）和脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase,LpL）的表达,半定量RT-PCR检测雌激素受体α（ERα）和β（ERβ）在成骨和成脂肪分化中的表达变化。结果：①体外分离培养的人MSC具有多向分化潜能,能向成骨细胞和脂肪细胞分化．分别表达Osteopontin和LpL。③MSC构成性表达雌激素受体α和β,雌激素受体α表达占优势。③在成骨分化中,雌激素受体α和β表达无明显改变,而在成脂肪分化中,雌激素受体α表达减低,β表达增高。结论：MSC成骨和成脂肪分化与雌激素受体α和β表达变化有关。调节雌激素受体α和β的表达,或使用一些雌激素受体激动剂、拮抗剂,将有可能抑制骨髓脂肪细胞的形成,促使MSC向成骨细胞分化,为骨质疏松及其它成骨障碍性疾病的治疗提供一个新的思路。     

MHP 36神经干细胞体外经Ⅳ型胶原诱导向平滑肌细胞分化的研究

目的研究MHP 36神经干细胞在体外经Ⅳ型胶原诱导向平滑肌细胞的分化潜能。方法体外培养MHP 36神经干细胞,采用Ⅳ型胶原在37℃培养箱促分化,在分化第1、2、4天分别收获细胞并通过PCR和Western免疫印迹分别检测平滑肌细胞特异性标志物(SMαA,SMMHC,SM22,Myocardin)基因和蛋白表达。最后对分化第4天的细胞进行细胞免疫荧光染色来鉴定SMαA、SMMHC的表达。结果 MHP36神经干细胞在37℃培养条件下从第2天开始逐渐变长、呈梭形,并在培养基中形成螺旋状结构。PCR及免疫印迹证实SMαA,SMMHC,SM22,Myocardin的基因和蛋白表达从分化第1天到第4天显著增加(P<0.05)。此外,分化第4天的细胞表达成熟的SMαA,SMMHC胞浆蛋白。结论 MHP36神经干细胞在体外经Ⅳ型胶原诱导可向平滑肌细胞分化,并表达平滑肌细胞的特异性标志物。     

胎儿心脏间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的建立胎儿心脏间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的分离培养方法,并检测其表面标志及多向分化潜能。方法取胎龄4~5月水囊引产胎儿心脏,用1.073 g/mL的Percoll密度梯度离心分离低密度细胞,MSC培养基纯化贴壁细胞,用流式细胞术检测其表面标志,成脂肪及成骨诱导鉴定多向分化潜能,并与胎儿骨髓MSC对比,研究其增生及生长特征。结果流式细胞术证明,胎心MSC表达干细胞标志,具有间充质细胞的特征及多向分化能力。原代及传代培养显示,同胎儿骨髓MSC一样,胎儿心脏MSC具有活跃增生的能力。结论胎儿心脏中可成功地分离MSC,为组织工程的种子细胞和基因工程的载体细胞提供了新的可行的来源。     

糖稳态调节细胞定向分化的基因改造方案探讨

目的:探索糖稳态调节细胞定向分化的基因改造方案思路.方法:①研究构建的解除干细胞分化抑制状态的信号传导与转录激活因子-3(STAT-3)基因载体,检测其介导目的基因感染ARIP等细胞基因表达;②研究构建的活化配体DL诱导N信号、在"旁侧抑制"过程中扮演重要角色的Kuzbanian(KUZ)基因载体在转基因小鼠表达后糖稳态调节细胞的分化.结果:在完成的STAT-3腺病毒基因载体生产了腺病毒,用带有目的基因的腺病毒对ARIP靶细胞进行感染,3 d后,荧光显微镜观察时,活细胞、固定液固定细胞均看到了构建基因中绿色荧光蛋白成功、高效的阳性表达报告.在完成的Kuzbanian(KUZ)基因载体构建、转基因、动物模型、小鼠品系鉴定后,用非放射性原位杂交实验对胰腺靶细胞的mRNA进行检测,获得了预期的阳性结果.结论:通过用某些分化抑制性基因的显性失活形式(DN)竞争性预先解除干细胞分化的抑制状态,然后再定向分化诱导使之朝向期望的目标细胞方向分化,可能是糖稳态细胞定向分化的可行途径之一.     

G_0S_2基因参与调节鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞分化

目的:探讨G_0S_2在调节鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞分化过程中的作用.方法:利用原代培养小鼠骨髓基质细胞(Marrowstrom cell,MSC),脂质体转染法将表达质粒pCAG-PPARγ2及含报告基因的pGL_2-COL_1A质粒共转染至MSC,G418筛选,RT-PCR检测PPARγ及G0S2mRNA表达,免疫组化检测PPARγ的表达,westen blot检测G_0S_2的表达,油红O染色检测细胞内脂滴.结果:MSC在未分化状态下不表达G_0S_2,经PPARγ基因转染后,G_0S_2开始表达,转染细胞最终分化为脂肪细胞.结论:PPARγ通过调节G_0S_2启动子调节后者表达,进而调节MSC向脂肪细胞分化,G_0S_2基因参与调节MSC向脂肪细胞分化.     

基本转录元件结合蛋白2反义基因转染对血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的:探讨基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)反义RNA对血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化的影响。方法:采用Ⅰ型胶原酶消化法培养大鼠VSMC;通过RT-PCR法检测血清诱导的VSMC表型标记基因(SMαA和SMemb)mRNA表达的变化;用反义BTEB2重组腺病毒转染VSMC后,采用RT-PCR法检测SMαA和SMemb的mRNA表达,用免疫细胞化学技术检测SMαA和SMemb蛋白表达。结果:血清剌激后,SMemb mRNA表达增加,而SMαA mRNA表达减少;BTEB2反义基因转染显著抑制血清诱导的SMemb mRNA和蛋白表达的增加以及SMαA表达的减少。结论:BTEB2反义RNA可显著抑制血清诱导的VSMC表型转化。     

Deltex-1对骨髓间充质干细胞增殖及其向平滑肌细胞分化的影响

目的 探讨Deltex-1对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bMSCs)增殖及其向平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)分化的影响.方法 分离培养大鼠骨髓bMSCs,采用流式细胞仪检测鉴定.通过Deltex-1过表达腺病毒载体pAd/Deltex-1感染bMSCs后,采用CCK-8(cell count kit-8)法检测Deltex-1过表达对bMSCs增殖的影响;将未感染、经Deltex-1病毒感染及经空病毒感染的bMSCs与SMCs共培养,采用免疫荧光细胞化学、RT-PCR及Western blot分别检测其bMSCs中SMCs标志物平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM-MHC)及Notch信号通路相关因子Notch-1的表达,单纯培养的bMSCs、SMCs的相同检测作正常对照.结果 成功分离、培养大鼠bMSCs.CCK-8检测证实:与对照比较,经Deltex-1病毒感染的bMSCs生长减慢,48 h开始显得更为明显(P＜0.05,P＜0.01);免疫荧光细胞化学、RT-PCR及Western blot检测显示:与对照比较,经Deltex-1病毒感染的bMSCs与SMCs共培养后显著表达SMCs的标志物SM-MHC,较弱表达Notch信号通路相关因子Notch-1 (P ＜0.01).结论 Deltex-1过表达可抑制bMSCs的增殖,并促进其向SMCs分化.     

沉默核仁素可诱导大鼠神经干细胞的分化

目的 探讨核仁素(nucleolin)对原代神经干细胞(NSCs)分化的影响及其相关机制.方法 构建核仁素siRNA腺病毒表达载体,将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染HEK293A细胞,包装得到具有感染能力的nucleolin-siRNA重组腺病毒.病毒体外感染原代NSCs,采用Western blot检测nucleolin蛋白的表达情况,Nucleolin-siRNA对神经干细胞Nestin、Wnt3、β-catenin蛋白表达的影响;采用免疫细胞化学检测nucleolin-siRNA对神经干细胞分化的影响.结果 经酶切和测序鉴定均证实nucleolin-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误.Western blot检测结果显示,转染nucleolin-siRNA2的细胞nucleolin表达明显受到抑制.siRNA+组NSCs分化为NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞的分化率明显比CON组、siRNA-组增加,且差异具有统计学意义(P<0.01).与阴性对照组相比,siRNA+组Nestin的表达明显减少,Wnt3表达明显增多,β-catenin入核明显增多,其差异具有统计学意义(P<0.05).结论 本研究成功地构建了针对nucleolin基因的siRNA重组腺病毒载体,沉默nucleolin可诱导神经干细胞的分化,其机制可能与Wnt信号转导通路的激活有关.     

人骨形成蛋白-7基因在人骨髓间充质干细胞中的表达和对其分化表型的影响

目的：观察人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达及对其成骨表型的影响。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP-7基因表达腺病毒AdB7V，体外感染hMSC后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达及RT-PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达，通过对感染细胞的碱性磷酸酶(ALP)染色和钙盐染色鉴定其成骨分化表型。结果：hMSC经AdB7V感染后72h可观察到GFP表达，RT-PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP-7在hMSC中表达，感染细胞的ALP染色和钙盐染色均为阳性。结论：外源性的人BMP-7基因可在hMSC中表达并诱导其向成骨细胞分化。     

Human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces human mesenchymal stem cell proliferation and differentiation in vitro

To identify eukaryotie expression veetor of human bone morphogenetie protein 2 peDNA3/BMP2, verify its expression in transfected hulnan mesenchynlal stem cells(hMSCs) and the effect on hMSCs differentiation. Methods: The BMP2 gene was cloned into a eukaryotic expression veetor pcDNA3. Transfeeted the reeombinant into hMSCs by liposome, Lmmunnohistochemistry and it situ hybridization methods were used to identify the expression of BMP2 mRNA and protein; ALP and Von Kossa stains were performed to identify the BMP2 gene differentiated effect on the hMSCs. Resuits: The pcDNA3/BMP2 fragments were as large as theory. BMP2 mRNA and protein were espressed and synthesized both in 48 h and 4 weeks after transfeetion, the ALP and Ca deposit eshibitiio, which marked the osteogenie lineage of hMSCs, were enhanced and Sped. Conclusion: Transfeetion of pcDNA3/BMP2 is able to provide transient and persistent expressionin hMSCs, and promote the MSCs differentiation to osleogenic lineage.     

腺病毒介导人IL-2基因治疗的抗肿瘤作用及机理分析

目的　观察重组人白介素 2腺病毒 (advh IL- 2 )在小鼠肝癌 H2 2中的转染效率、表达时程、体内抗肿瘤作用及其免疫机理。方法　小鼠皮下接种肝癌 H2 2 ,将肿瘤生长至体积为 10 0～ 2 0 0 mm3的荷瘤小鼠随机分组 ,经肿瘤局部注射给药。用 X- gal染色法检测重组腺病毒载体 adv L ac Z的转染效率 ;用 RT- PCR检测人 IL- 2基因的持续表达时间 ;以 H2 2瘤体生长及荷瘤小鼠存活时间评价 advh IL - 2抗肿瘤作用 ;以 51 Cr 4小时释放法测定治疗小鼠脾细胞的 L AK与 CTL 杀伤活性 ,免疫荧光法分析肿瘤组织内 CD4 +与 CD8+ T细胞浸润情况。结果　肿瘤局部单次注射 1× 10 9pfu重组腺病毒 ,可在肿瘤组织中进行有效的转染及表达 ,人 IL- 2基因的表达时间长于 12 d。AdvhIL- 2的抗肿瘤作用具有剂量依赖性 ,与 PBS组比较 ,2× 10 9pfu advh IL- 2可非常明显地抑制 H2 2皮下瘤的生长、延长荷瘤小鼠的生存时间 (P<0 .0 1) ,同时明显增强脾细胞 L AK与 CTL杀伤活性 (P<0 .0 1) ,增加肿瘤组织内CD4 + 与 CD8+ T细胞的浸润。结论　 Advh IL - 2通过介导人 IL - 2基因在小鼠 H 2 2肿瘤组织中的持续表达 ,产生明显的体内抗肿瘤作用 ,其机理与激活荷瘤小鼠抗肿瘤免疫反应有关     

Construction of a bicistronic recombinant adenoviral vector for human interleukin-10 and enhanced green fluorescent protein expression in bone marrow mesenchymal stem cells

Background  Human interleukin-10 (hIL-10) is a cytokine synthesis inhibitory factor, which is involved in various immune responses. The purpose of this study was to construct an adenoviral vector carrying the hIL-10 gene for expression of biologically active hIL-10 in rat bone marrow mesenchymal stem cells (rMSCs).

Methods  A pSNAV2.0-hIL10 plasmid was used as a template to obtain a hIL-10 cDNA fragment that was subcloned by restriction enzyme digestion and ligation into a pDC316-IRES-EGFP-lacZ alpha plasmid carrying an enhanced green fluorescent protein (EGFP) marker gene. The pDC316-hIL-10-IRES-EGFP plasmid was linearized by PmeI digestion and used to transfect HEK293 packaging cells using the adenovirus packaging system AdMax. Virus particles were amplified by repeatedly infecting HEK293 cells with the seed virus and then purified by ion exchange. After the number of virus particles and titer was determined, rMSCs were infected with the adenoviral vector. The infection rate was determined by fluorescence microscopy and flow cytometry, and hIL-10 protein expression in rMSCs was measured by Western blotting.

Results  The virus particle concentration, OD260/280 value and virus titer of the amplified and purified recombinant adenovirus were 3.2×10¹¹ VP/ml, approximately 2.0, and 1.1×10¹⁰ TCID50/ml, respectively. Bright green fluorescence was observed by fluorescence microscopy and flow cytometry in the recombinant adenovirus-infected rMSCs. GFP expression was considered the multiplicity of infection (MOI) and was time-dependent. The infection rate was 92.9% at 100 MOI.

Conclusions  A bicistronic recombinant adenoviral vector for hIL-10 and EGFP gene expression were successfully constructed. The infection rate of rMSCs by the adenovirus was high (92.9% at 100 MOI) and the target gene hIL-10 was highly expressed in cells. The present study provides an experimental basis for further research of immunosuppressive therapy using hIL-10. The expression level of hIL-10 protein as detected by Western blotting was also MOI- and time-dependent.

     

成人骨髓源性神经干细胞中nestin表达的实时定量RT—PCR检测

目的建立快速获取成人骨髓源性神经干细胞（Human adult bone marrow—derived neural stem cells,Md—NSCs）的方法,并对Md—NSCs中神经巢蛋白nestin的表达进行定量比较分析。方法抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells,hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为成人骨髓源性神经干细胞（Human adult bone marrow—derived neural stem cells,Md—NSCs）;以实时定量RT—PCR检测Md—NSCs中nestin基因的表达,以hMSCs作为对照组。结果hMSCs呈长梭形,贴壁生长,于体外诱导培养可快速有效地获取Md—NSCs,Md—NSCs不贴壁生长,由神经干细胞克隆组成神经球样结构;Md—NSCs中nestin基因的表达比hMSCs增高2．04×10^2倍。结论hMSCs经诱导分化成为Md—NSCs后细胞的生物特征发生显著改变,Md—NSCs高度表达神经巢蛋白nestin具有神经干细胞的特征,并非hMSCs的简单聚集成球。     

Apoptin引起肿瘤细胞G2-M阻滞

目的:研究凋亡素(apoptin)特异诱导肿瘤细胞凋亡的作用,探讨其用于肿瘤治疗的可能性.方法:用PCR技术克隆了apoptin基因,将其插入预先装有FLAG标签的真核表达质粒pcDNA3.1中,并构建了带有apoptin基因的腺病毒载体,观察转染pcDNA3.1/FLAG/apoptin和/或Ad/apoptin重组腺病毒感染后apoptin在几种细胞中的表达及细胞形态的改变,用流式细胞术分析PI染色后Ad/apoptin感染细胞的DNA含量变化.结果:apoptin在Hela、Bcap37、A549、HepG2、SKOV3等肿瘤细胞核中表达,apoptin重组腺病毒感染后细胞核染色质呈颗粒状,最后凝聚成不规则大块并出现核固缩.正向和反向插入apoptin的重组腺病毒均引起G2-M细胞增多,但前者引起G2-M阻滞更为显著,需要的感染复数(MOI)也较低.结论:apoptin可引起肿瘤细胞周期G2-M阻滞和染色质凝聚.     

腺病毒介导的THANK基因在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建THANK腺病毒载体,观察腺病毒感染后THANK在SMMC-7721细胞中的表达情况.方法:把THANK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒,再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取THANK重组腺病毒,以不同感染复数(MOI)腺病毒感染SMMC-7721细胞,观察腺病毒对SMMC-7721细胞的感染情况.结果:成功地构建了THANK腺病毒,该腺病毒可高效介导THANK在SMMC-7721细胞中表达,基因转染后第5天,THANK表达高于35 ng/ml,且随时间延长增加.结论:腺病毒可诱导THANK基因在SMMC-7721细胞中高表达.