缺氧诱导因子-1α靶向siRNA重组表达载体的构建和鉴定

目的构建缺氧诱导因子-1α靶向siRNA重组表达载体。方法根据GeneBank提供的人缺氧诱导因子-1α的核苷酸序列选择设计4对发夹状结构的核苷酸序列,克隆到质粒PGenesil-1中,转化至DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析。结果经基因测序等证实缺氧诱导因子-1α靶向siR-NA重组表达载体碱基序列与设计完全一致。结论缺氧诱导因子-1α靶向siRNA重组表达载体构建成功,为进一步研究肿瘤生物学行为奠定了实验基础。     

CoCl2模拟缺氧环境下肝癌细胞生物钟基因表达的变化

目的：观察氯化钴（CoCl2）模拟缺氧环境下肝癌细胞生物钟基因表达的变化。 方法：以不同浓度（0,50,100,200 μmol/L）的CoCl2处理肝癌细胞系Huh7细胞24 h后,用Western blot检测细胞中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的蛋白表达,real-time PCR检测细胞中生物钟基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε的mRNA表达。 结果：Western blot结果显示,未处理Huh7细胞（0 μmol/L CoCl2）无HIF-1α表达,而各浓度的CoCl2处理后,Huh7细胞出现明显的HIF-1α的蛋白表达,且表达水平随CoCl2浓度增加而升高。real-time PCR结果显示,CoCl2处理后的Huh7细胞中Bmal1、Per1、Cry2的mRNA水平明显上调,而CLOCK、Cry1、Per2、Per3、CKIε的mRNA水平明显下调,且均呈CoCl2浓度依赖性（均P<0.05）。 结论：缺氧微环境可能是引起肝癌细胞生物钟基因表达异常的原因之一。

     

HIF-1α 及肿瘤相关巨噬细胞在乳腺癌组织中的表达及其意义

目的：探讨缺氧诱导因子1α（HIF-1α）及肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在乳腺癌组织中的表达及两者间关系。 方法：应用免疫组化法检测40例乳腺癌和癌旁组织中HIF-1α、TAM标记抗原CD68的表达。 结果：乳腺癌组织中HIF-1α、CD68的表达均高于与癌旁组织（均P<0.05）;乳腺癌组织中CD68与HIF-1α表达呈正相关（r=0.823,P<0.01）;两者表达均与乳腺癌的病理分期、淋巴结转移有关（均P<0.05）。 结论：乳腺癌中HIF-1α和CD68的表达明显高于癌旁组织,提示HIF-1α与TAM的共同作用可能参与了乳腺癌的发生与发展。     

Caveolin-1在乳腺癌中的表达及其意义

目的 探讨caveolin-1在乳腺癌中的表达及其意义.方法 采用免疫组化二步法,检测105例乳腺癌和50例非癌乳腺组织中caveolin-1的表达情况,同时检测组织中CK5/6、EGFR、E-cadherin表达情况,研究其与eaveolin-1表达的关系,并对105例乳腺癌患者的临床病理资料进行回顾性分析.结果 105例乳腺癌按基因分型分为基底细胞样乳腺癌20例,腔上皮A型乳腺癌22例,腔上皮B型乳腺癌23例,HER2高表达型乳腺癌23例,正常乳腺表型乳腺癌17例.Caveolin-1蛋白在乳腺癌和非癌乳腺组织的表达率分别为24.8％ (26/105),88％ (44/50).Caveolin-1在基底细胞样型,腔上皮A型,腔上皮B型,HER2高表达型,正常乳腺表型乳腺癌的表达率分别为75.0％ (15/20)、4.8％ (1/22)、17.4％ (4/23),17.4％ (4/23)、11.8％ (2/17),Caveolin-1蛋白在基底细胞样型的表达水平强于腔上皮A、腔上皮B型、HER2高表达型和正常乳腺表型(P＜0.01).基底细胞样型caveolin-1蛋白表达与CK5/6、EGFR水平正相关(P＜0.01),与E-cadherin水平无关(P＞0.05).乳腺癌中表达caveolin-1蛋白者淋巴结转移率亦高(69.2％ vs.46.8％,P=0.047).乳腺癌患者中caveolin-1(±)5年无瘤生存率(10/26,38.46％)显著低于caveolin-1(一)患者(59/79,74.68％,P=0.0004).但多因素分析未证明caveolin-1为乳腺癌患者无瘤生存的预后因素(P＞0.05).结论 Caveolin-1可作为基底细胞样乳腺癌的一个筛选标记,可能促进癌细胞的转移,但不是影响乳腺癌患者预后的独立因素.     

缺氧诱导因子1α在肝癌细胞上皮-间充质化中的作用

目的:探讨缺氧诱导因子1 α(HIF-1 α)在肝癌上皮-间充质化(EMT)中的作用.方法:采用可调控HIF-1 α表达的肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α细胞系,首先用real-time PCR与Western blot方法检测低氧环境中HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子(E-cadherin,vimentin,FSP-1)及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平,然后在常氧环境下,采用强力霉素(Dox)诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,以及HepG2Tet-on-HIF-1α细胞经Dox处理后再转染HIF-1αsiRNA,观察上述分子的表达情况.结果:低氧处理后,HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平较常氧状态下均明显增加(均P＜0.05);常氧环境下,Dox能诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,同时明显增加EMT相关分子的mRNA和蛋白表达水平(均P＜0.05),但转染HIF-1αsiRNA后,Dox的诱导作用被取消.结论:HIF-1α促进HepG2细胞EMT,并可能是肝癌基因治疗的有效靶点.     

c-Met抑制剂SU11274对基底样乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响

目的 研究c-Met抑制剂SU11274对c-Met阳性基底样乳腺癌细胞系MDA-MB-231凋亡和运动的影响.方法 荧光染料Hoechst33342、MitroTrackerRed和Yo-pro-1染色,观察SU 11274诱导细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测不同处理组的细胞早期凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化和c-Met及Akt磷酸化水平的改变;划痕试验及趋化试验观察SU 11274对细胞迁移、趋化能力的影响.结果 SU11274(10 μmol/L)处理MDA-MB-231细胞48 h后,与对照组比较,荧光染色可见处理组细胞核绿染,胞核碎裂;各加药组MDA-MB-231的早期凋亡率分别为(7.3±0.9)％、(14.1±0.6)％、(35.5±4.4)％、(48.2±5.3)％,与对照组相比明显升高(P＜0.05).同时,抗凋亡蛋白Bcl-XL表达减少,凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP蛋白剪切增加,量效关系明显.SU11274可显著延长划痕愈合时间以及减少趋化穿膜细胞个数(P＜0.05),并有效抑制c-Met及Akt的磷酸化水平,呈剂量依赖性关系. 结论 SU11274可通过抑制c-Met/PI3 K/Akt的磷酸化水平而诱导c -Met阳性基底样乳腺癌细胞系MDA-MB-231凋亡,并抑制其运动.     

胰岛素调节人胰腺癌细胞ASPC-1中HIF-1α的表达研究

目的 探讨胰岛素对胰腺癌细胞株ASPC-1中缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表达的影响.方法 将ASPC-1细胞分为5组:常氧组,常氧加胰岛素组,缺氧组,同一缺氧时间不同胰岛素浓度组以及相同胰岛素浓度不同缺氧时间组,实时定量PCR检测HIF-1α基因表达,免疫细胞化学与Western blot检测HIF-1α蛋白表达水平的变化.Transwell实验检测加入胰岛素后肿瘤细胞侵袭能力的变化.结果 常氧下ASPC-1细胞即有一定水平HIF-1α表达,加入胰岛素刺激后HIF-1α蛋白表达随着胰岛素浓度的升高和作用时间的延长而逐渐升高,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);缺氧条件下HIF-1α表达较常氧时升高(P＜0.05);相同缺氧时间使用不同浓度胰岛素刺激时,高浓度胰岛素刺激下HIF-1α的表达较单纯缺氧更高(P＜0.05),低浓度胰岛素对HIF-1α无明显作用(P＞0.05);使用相同胰岛素处理后再进行缺氧处理,随着时间延长HIF-1α的表达先升高后下降,但各处理组较对照组差异均有统计学意义(P＜0.05).Transwell实验显示胰岛素可增强胰腺癌细胞的侵袭能力(P＜0.05).结论 胰岛素可上调胰腺癌细胞ASPC-1中HIF-1蛋白表达,并且这种作用具有一定的剂量依赖性和时间依赖性.胰岛素还可以增加ASPC-1的侵袭能力.

Abstract：

Objective To investigate the effect of insulin on the expression of hypoxia-inducible factor-1α in human pancreatic cancer cell line ASPC-1. Methods We divided ASPC-1 cells into five groups: normoxia; normoxia stimulated with insulin; hypoxia; hypoxia pretreated with different concentration of insulin; hypoxia of different time points pretreated with same concentration of insulin. Real-time PCR was used to test the expression of HIF-1α mRNA. Immunohistochemistry was used to examine the expression of HIF-1α in ASPC-1 of insulin treated cancer cells. Western blot was used to determine the expression of HIF-1 α protein in those cells. Transwell was used to test whether insulin could enhance the invasion ability of ASPC-1 pancreatic cancer cells. Results Insulin promotes HIF-1α protein expression. ASPC-1 cells expressed low levels of HIF-1α protein under normoxic condition. After stimulated with insulin, the expression of HIF-1 α protein significantly increased (P ＜ 0. 05 ). After treated with hypoxia, the expression of HIF-1α protein also increased(P ＜ 0. 05 ). Low concentrations of insulin didn't increase the expression of HIF-1α under hypoxic environment ( P ＞ 0. 05 ), while high concentration of insulin could increase its expression(P ＜ 0. 05). When ASPC-1 cells pretreated with insulin suffered from hypoxia, the expression of HIF-1α first increased then decreased moderately( P ＜0. 05). Insulin could enhance the invasion ability of pancreatic cancer cells( P ＜ 0. 05 ). Conclusions Insulin mediates the expression of HIF-1α protein in human pancreatic cancer ASPC-1 cells with the characteristics of dose and time dependency. Insulin could enhance the invasion ability of ASPC-1 cells.     

siRNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对胰腺癌细胞TLR4表达的影响

目的 观察体外乏氧培养条件下胰腺癌细胞系Panc-1中HIF-1α和TLR4的表达,探讨HIF-1α在低氧条件下对胰腺癌细胞TLR4的调控作用.方法 低氧箱培养和CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境,RT-PCR、免疫荧光法和流式细胞法分别检测缺氧状态下HIF-1α和TLR4在mRNA和蛋白水平的表达.采用化学合成小干扰RNA( siRNA)介导的RNA干扰技术(RNAi)用siRNA转染Panc-1细胞.观察转染后HIF-1α沉默效果.结果 低氧条件下,Panc-1细胞HIF-1αmRNA水平稳定,蛋白表达显著升高,而TLR4 mRNA和蛋白的表达均显著升高.siRNA转染Panc-1后能够显著下调HIF-1α的基因表达,同时TLR4基因的表达上调也受到明显抑制.结论 缺氧促使胰腺癌Panc-1细胞TLR4在蛋白水平表达升高,TLR4信号通路可能和HIF-1α信号通路存在相互联系,并且共同促进了胰腺癌的恶性进展.     

ADAM23|αvβ3在大肠癌中的表达与大肠癌肝转移的关系

目的：探讨ADAM23,αvβ3在大肠癌中的表达及其与肝转移等临床病理因素的关系。方法：应用免疫组化和RT-PCR方法检测53例大肠癌及其癌旁组织及20例良性病变组织中ADAM23,αvβ3的表达情况,并分析两者的蛋白表达与临床病理因素的关系。结果：大肠癌组织中ADAM23蛋白与mRNA阳性表达率明显低于癌旁组织与良性病变组织（均P<0.05）,而αvβ3蛋白与mRNA阳性表达率明显高于癌旁组织与良性病变组织（均P<0.05）。大肠癌组织中ADAM23和αvβ3蛋白的表达呈负相关（χ2=10.3390;r=-0.637,P<0.01）。ADAM23和αvβ3的蛋白表达与患者的性别,年龄及分化程度无关（均P>0.05）,而与临床分期,淋巴转移及肝转移有关,此外ADAM23蛋白的表达还与大肠癌浸润深度有关（均P<0.05）。结论：大肠癌中ADAM23呈低表达,αvβ3呈高表达,两者可能与大肠癌的肝转移等不良临床转归有关。

     

Glut1和HIF-1α在原发性肝细胞癌中的表达和意义

目的探讨葡萄糖转运蛋白1（Glut1）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在原发性肝细胞癌中的表达,以及在肝细胞癌发生发展过程中相互关系。方法应用免疫组织化学方法（SP法）,检测108例肝细胞癌及其癌旁组织、15例正常肝组织中Glutl,HIF-1α的表达。结果Glutl和HIF-1α在108例肝细胞癌组织中的阳性表达率分别为74.1%和78.7%,明显高于其在癌旁组织（χ^2=15.27,χ^2=8.727）和正常肝组织（χ^2=31.78,χ^2=27.19）中的表达率（P〈0.05）。Glutl的表达强度与HCC的分化程度（χ^2=27.80）,Edmondson分级（χ^2=6.260）,有无转移（χ^2=11.54）等显著相关（P〈0.05）。HIF-1α在原发性肝癌中的表达强度与HCC分化程度（χ^2=13.05）和肿瘤大小（χ^2=11.74）相关（P〈0.05）。统计学分析显示Glutl和HIF-1α在HCC中的表达呈正相关（χ^2=18.81）。结论Glutl和HIF-1α的异常高表达在原发性肝细胞癌的发生发展中起重要作用,可能促进肝细胞癌的增殖和侵袭转移。Glutl和HIF-1α的表达强度对肝癌的诊断具有临床应用价值。     

癌基因iASPP在乳腺浸润性小叶癌中的表达及其意义

目的探讨p5 3凋亡刺激蛋白基因(ASPP)的抑制蛋白iASPP在乳腺浸润性小叶癌中的表达及其临床意义。方法采用RT-PCR技术扩增乳腺浸润性小叶癌组织中iASPP mRNA;同时应用Quality One软件分析iASPP扩增产物的相对含量,分析iASPP-mRNA与临床病理因素之间的关系。结果 3 9例浸润性小叶癌组织中有3 4例表达iASPP(8 7.2%),5例不表达(1 2.8%);癌旁组织中均不表达iASPP。iASPP-mRNA在乳腺浸润性小叶癌中的表达明显增高,与癌旁组织相比差异具有显著性(P0.0 1)。不同的年龄组iASPP-mRNA的表达差异也有显著性;TNMⅢ、Ⅳ期乳腺癌组织中iASPP-mRNA的表达显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P0.0 1);有淋巴结转移的癌组织中iASPP-mRNA的表达也高于无淋巴结转移者;iASPP-mRNA的表达与雌、孕激素受体的表达无关。结论 iASPP-mRNA在乳腺浸润性小叶癌中高表达。检测iASPP可以为乳腺癌的诊断、个体化治疗及预后提供参考。     

水通道蛋白1在乳腺癌组织中的表达及其意义

目的 探讨水通道蛋白1(AQP1)在乳腺癌组织中的表达和意义.方法 取乳腺癌组织40例及癌旁组织10例,应用RT-PCR法检测AQP1 mRNA在乳腺癌和癌旁组织中的表达及分布.结果 乳腺癌中AQP1 mRNA表达量(0.8957±0.0428),明显高于癌旁组织AQP1 mRNA表达量(0.3401±0.0549),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 AQP1在乳腺癌组织中表达增高,提示AQP1可能与乳腺癌生长、转移有关.     

配对相关同源框-1蛋白在胆囊癌组织中的表达及意义

目的:探讨配对相关同源框-1蛋白(Prrx-1)在胆囊癌组织中的表达及意义。方法:用免疫组化方法测定Prrx-1在45例胆囊癌及35例胆囊良性病变组织中的表达情况,并分析Prrx-1和胆囊癌临床病理特征之间的关系。结果:Prrx-1在胆囊癌组织中表达率为55.6%(25/45),而在胆囊良性病变组织中的表达率5.7%(2/35),两者差异有统计学意义(χ2=21.87,P0.05)。统计分析显示,Prrx-1表达与胆囊癌的组织分化程度、临床分期有关(P0.05),而与胆囊癌患者的年龄、性别及胆囊癌的组织学类型无关(均P0.05)。结论:Prrx-1在胆囊癌组织中表达增高,其表达可能在胆囊癌的发生、发展中起重要作用。     

上皮钙黏蛋白和基质金属蛋白酶-7在乳腺癌基底细胞样型和Her-2高表达型中的表达及其意义

目的 探讨基底细胞样型和Her-2高表达型乳腺癌中上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinases 7,MMP-7)的表达特点及其意义.方法 采用免疫组化二步法检测E-cadherin和MMP-7在20例基底细胞样型和21例Her-2高表达型乳腺癌中的表达情况,同时对临床病理资料进行回顾性分析.结果基底细胞样型在浸润性导管癌中的构成比为3.4%(20/501),平均发病年龄49岁,肿物平均直径小于Her-2高表达型(P<0.05);基底细胞样型5年生存率低于Her-2高表达型(40.0% vs.71.4%,P<0.05),但两组三年生存率差异无统计学意义(P>0.05).基底细胞样型E-cadherin表达明显下调甚至缺失(P<0.01);MMP-7表达强于Her-2高表达型(P<0.05).结论 乳腺癌中基底细胞样型生存率明显低于Her-2高表达型,E-cadherin下调表达和MMP-7上调表达可能是基底细胞样型高侵袭转移力的发生机制之一.     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在乳腺癌组织中的表达及其意义

目的：探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3）在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌临床病理参数的关系。
方法：采用RT-PCR方法检测52例乳腺癌组织及其癌旁组织中glypican-3基因的表达,计算其阳性率;并用Western blot方法检测该基因在乳腺癌组织及其癌旁组织中的蛋白表达。
结果：glypican-3 mRNA在乳腺癌组织中表达率明显低于癌旁组织（P＜0.05）;在有淋巴结转移者中的表达率明显低于无淋巴结转移者（P＜0.05）;癌组织分化程度越低,glypican-3 mRNA的表达率越低（P＜0.05）;但其与患者的年龄、肿瘤的大小无关（P＞0.05）。glypican-3蛋白在乳腺癌组织中表达亦明显低于癌旁正常组织（P＜0.05）,在有淋巴结转移者中的表达量明显低于无淋巴结转移者（P＜0.05）,癌组织分化程度越低,glypican-3蛋白的表达量越低（P＜0.05）。
结论：glypican-3在乳腺癌组织中的低表达可能与乳腺癌的发生发展及侵袭转移有关。