高迁移率族蛋白B1对体外人肺动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的 评价高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对体外培养人肺动脉血管平滑肌细胞(hPASMC)增殖、迁移和凋亡的影响.方法 体外培养hPASMC,调整细胞密度(2× 105个/ml)后接种到96孔板(100 μl/孔,2× 105个/ml)、6孔板(1ml/孔,2× 106个/ml)和改良24孔Boyden趋化小室(100μg/孔,5×103个/ml),采用随机数字表法,将其分为5组:对照组(C组)和不同浓度HMGB1组(H1组～H4组),分别在DMEM和含HMGB1 1、10、100、1000 ng/ml的DMEM培养液孵育.孵育24和48 h时,采用MTT法检测细胞增殖率,Boyden小室法检测透膜细胞数,TUNEL法检测hPASMC凋亡情况.结果 与C组比较,H1组～H4组细胞增殖率升高,透膜细胞数增多(P＜ 0.05);与H1组比较,H2组～H4组细胞增殖率升高,H3组和H4组透膜细胞数增多(P＜0.05);与H2组比较,H3组和H4组细胞增殖率升高,透膜细胞数增多(P＜ 0.05);H3组和H4组间各指标比较差异无统计学意义(P＞0.05);与孵育24h时比较,各组孵育48 h时细胞增殖率升高(P＜0.05).各组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 HMGB1可促进hPASMC的增殖和透膜迁移,可能参与肺损伤肺血管重构的发生.     

HSF-1 抑制HMGB1 所致炎症反应的作用及机制

目的：探讨热休克转录因子1（HSF-1）抑制高迁移率族蛋白1（HMGB1）引起炎症反应的作用及机制。 方法：RAW264.7细胞分别转染含HSF-1的质粒（HSF-1过表达组）和空白质粒（阴性对照组）后,以无处理的RAW264.7细胞作为空白对照组,用Western blot法检测各组细胞HSF-1蛋白的表达;将以上3组细胞分别用HMGB1（1 μg/mL）刺激后,用ELISA法测定TNF-α水平、Western blot法检测丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPK）通路和NF-κB通路相关蛋白的表达、非放射性凝胶阻滞（EMSA）检测NF-κB与DNA结合活性。 结果：Western blot结果显示,HSF-1过表达组HSF-1蛋白表达量较阴性对照组与空白对照组明显升高（均P<0.05）,而后两组间HSF-1蛋白表达量无统计学差异（P>0.05）;HMGB1作用4 h,HSF-1过表达组TNF-α水平较阴性对照组与空白对照组明显降低（均P<0.05）,而后两组间无统计学差异（P>0.05）;HMGB1作用不同时间后,各组细胞MAPK通路相关蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38以及NF-κB通路相关蛋白p-IKα-B的表达均无统计学差异（均P>0.05）;EMSA结果显示,HMGB1作用1 h后,HSF-1过表达组NF-κB灰度值明显低于阴性对照组与空白对照组（均P<0.05）,而后两组间无统计学差异（P>0.05）。 结论：HSF-1过表达可以减少HMGB1引起的TNF-α表达,其分子机制与MAPK通路的活化无关,但与NF-κB和DNA的结合能力有关。     

曲张大隐静脉源性血管平滑肌细胞表型与功能的变化

目的:探讨曲张大隐静脉源性血管平滑肌细胞(VSMCs)表型与功能的变化。方法:收集13例曲张大隐静脉(曲张组)与15例正常大隐静脉(正常组)标本,分离和培养两组标本中的VSMCs。检测两组VSMCs的增殖、迁移、黏附、衰老与骨架蛋白表达,以及凋亡相关因子与细胞外基质代谢相关因子的表达。结果:与正常组VSMCs比较,曲张组VSMCs骨架蛋白F-actin表达增加;增殖能力与迁移、黏附、衰老细胞数均明显增加(均P0.05);促凋亡因子Bas与凋亡执行因子caspase-3的mRNA、蛋白表达明显降低,而凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA、蛋白表达明显升高(均P0.05);基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)与基质金属蛋白酶抑制物(TIMP-1、TIMP-1)的mRNA、蛋白表达均明显升高(均P0.05)。结论:曲张大隐静脉源性VSMCs有明显去分化现象,其增殖和合成能力增强,VSMCs表型和功能的异常可能是静脉曲张发病机制之一。     

let-7a对血管平滑肌细胞迁移、增殖功能调控作用的体外研究

目的:观察let-7a对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)迁移和增殖能力的影响。方法:分离大鼠胸腹主动脉VSMC,并传代培养。将培养的VSMC通过慢病毒表达载体分别转染let-7a模拟物(实验组)及其阴性对照物(阴性对照组),或不做转染处理(空白对照组)。通过绿色荧光蛋白的表达估计转染效率;用real-time PCR检测各组细胞let-7a的表达水平;用细胞划痕试验和CCK-8法分别检测各组细胞的迁移能力及增殖情况。结果:荧光显微镜观察显示,96 h后细胞的转染效率达85%以上;real-time PCR结果显示,实验组VSMC的let-7a表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(均P<0.01);细胞划痕试验与增殖检测结果显示,实验组的细胞迁移数及增殖率明显低于阴性对照组和空白对照组(均P<0.01)。阴性对照组与空白对照组间上述项目无明显差异(均P>0.05)。结论:let-7a对体外培养的VSMC迁移与增殖有抑制作用。     

细胞因子对大鼠血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体表达的影响

目的 探讨细胞因子对大鼠血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)表达的影响.方法 原代体外培养的1月龄SD大鼠(体重120～130 g)胸主动脉血管平滑肌细胞,于无血清DMEM培养液中培养24 h后,在含10%胎牛血清的DMEM培养液中继续培养.采用随机数字表法,将细胞随机分为5组,对照组(C组)不给予任何处理,继续培养12 h;不同浓度细胞因子组分别加入10%细胞因子(L组)、50%细胞因子(N组)、100%细胞因子(H组)孵育12 h,细胞因子包括IL-1β50 ng/ml+TNF-α 100ng/ml+干扰素γ(IFN-γ)500 ng/ml;L-精氨酸甲酯(L-NAME)组加入100%细胞因子+一氧化氮合酶抑制剂L-NAME 5 mmol/L孵育12 h.每组均重复6次.采用RT-PCR法检测AT1R mRNA的表达;采用Western blot法检测AT1R蛋白的表达.结果 与C组比较,L组、N组和H组血管平滑肌细胞AT1R mRNA和蛋白表达均下调,且呈浓度依赖性(P＜0.05或0.01),L-NAME组差异无统计学意义(P＞0.05);与L-NAME组比较,H组血管平滑肌细胞AT1R mRNA和蛋白表达均下凋(P＜0.01).结论 细胞因子可下凋大鼠血管平滑肌细胞AT1R的表达,其机制与促进一氧化氮的合成有关.

Abstract：

Objective To investigate the effects of cytokines on the expression of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R) in vascular smooth muscle cells (VSMCs) in rats. Methods Primary cultured VSMCs from SD rat thoracic aorta were cultured in serum-free DMEM for 24 h, and then in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum for another 12 h. The cultured VSMCs were randomly divided into 5 groups (n =6 each): control group (group C); 10% cytokine group (group L); 50% cytokine group (group N); 100% cytokine group (group H) and L-arginine methy ester (L-NAME), an inhibitor of nitric oxide synthase) group. In group C, the cellswere cultured continuously for 12 h. In L, N and H groups, 10%, 50% and 100% cytokines (IL-1β 50 ng/ml +TNF-α 100 ng/ml + IFN-γ 500 ng/ml) were added to the culture medium respectively and the cells were then incubated for 12 h. In group L-NAME, 100% cytokines + L-NAME 5 mmol/L were added to the culture medium and the cells were then incubated for 12 h. The expression of AT1R mPNA and protin was determined by RT-PCR and Western blot respectively.Results Cytokines down-regulated AT1R mRNA and protein expression in a concentration-dependent manner (P ＜ 0.05 or 0.01). L-NAME reversed cytokines-induced changes in AT1R mRNA and protein expression ( P ＜ 0.01). Conclusion Cytokines can down-regulate the expression of AT1R in rat VSMCs and the mechanism is related to the NO synthesis.     

不同剂量利多卡因对脓毒症大鼠小肠HMGB1表达的影响

目的 评价不同剂量利多卡因对脓毒症大鼠小肠高迁移率组蛋白B1( HMGB1)表达的影响.方法 成年雄性Wistar大鼠50只,体重200～250 g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为5组(n=10):假手术组(S组)不行盲肠结扎穿孔术;脓毒症组(Sep组)采用盲肠结扎穿孔术法制备脓毒症模型;不同剂量利多卡因组(L1～3组)于术后即刻、1、2h时分别腹腔注射利多卡因5、10、20 mg/kg,S组和Sep组分别给予等容量生理盐水.于术后24、48 h时各组随机取5只大鼠处死取小肠组织,光镜下观察小肠组织病理学形态,采用PCR技术检测HMGB1 mRNA的表达,ELISA法测定二胺氧化酶(DAO)活性.结果 与S组比较,Sep组和L1～3组各时点大鼠HMGB1 mRNA表达上调,DAO活性降低(P＜0.05);与Sep组比较,L1～3组大鼠HMGB1 mRNA表达下调,DAO活性升高(P＜0.05);各时点L1-3组大鼠HMGB1 mRNA表达依次下调,DAO活性依次升高(P＜0.05).L1-3组小肠组织病理学损伤较Sep组减轻.结论 利多卡因可呈剂量依赖性减轻脓毒症大鼠小肠损伤,其机制可能与抑制HMGB1表达上调有关.     

反义mTOR逆转录病毒载体对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：观察反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)逆转录病毒载体对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响。方法：采用脂质体介导转染包装细胞后构建mTOR的反义重组逆转录病毒载体(pLXIN-AmTOR)感染VSMC，检测mTOR及其下游底物包括真核细胞启动子4E结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶(p70S6k)的表达变化，以及VSMC细胞增殖周期和增殖活性的改变。 结果：反义逆转录病毒载体转染PT67细胞后感染VSMC，能显著抑制mTOR的mRNA和蛋白产物表达，mTOR通路下游p70S6k表达相应减少，而4E-BP1的表达却显著增强;感染后的VSMC的分裂、增殖过程受阻，更多细胞停滞在G1期。 结论：成功构建反义mTOR逆转录病毒载体;感染VSMC后能明显抑制VSMC的分裂、分化和增殖。     

HMGB1与RAGE水平在急性主动脉夹层肺损伤患者中的变化及临床意义

目的：探讨急性主动脉夹层（AAD）患者血清高迁移率族蛋白B1（HMGB1）与晚期糖基化终产物受体（RAGE）水平与继发急性肺损伤的关系。 方法：选取2016年3月—2018年5月经全主动脉CTA以及超声心动图等影像学检查明确诊断的AAD患者56例为研究对象。按静态吸氧状态下氧合指数（PaO2/FiO2）大小将患者分为肺损伤组（21例）与非肺损伤组（35例）。随机选取健康体检人员30例为对照组。AAD患者入院后每4 小时抽血次,对照组受试者仅抽取1次清晨空腹肘静脉血。采用ELISA法检测血清HMGB1、RAGE水平,同时检测PaO2、计算PaO2/FiO2。 结果：与健康对照组比较,两组AAD患者入院后24 h的HMGB1、RAGE水平均明显高于健康对照组,且两者在肺损伤组均明显高于非肺损伤组（均P<0.05）。两组AAD患者入院后HMGB1、RAGE水平不断上升,而PaO2/FiO2逐渐降低,并均入院后48~60 h达到峰值,肺损伤组的3项指标的变化幅度均明显大于非肺损伤组（均P<0.05）;随着发病时间的推移,HMGB1、RAGE水平达到峰值后下降,PaO2/FiO2逐渐回升。AAD患者中,HMGB1与RAGE水平与PaO2/FiO2均呈明显负相关（r=-0.940、 -0.794）。 结论：HMGB1/RAGE信号通路可能在AAD肺损伤中发挥着重要的作用,随着HMGB1、RAGE水平的升高,肺损伤程度逐渐加重,监测HMGB1、RAGE水平可以对AAD并发肺损伤的风险进行评估;对HMGB1/RAGE信号通路深入研究可能会为AAD肺损伤的干预提供靶点。     

HSF-1在HMGB1诱导的炎症反应中的作用

目的:探讨热休克转录因子1(HSF-1)在高迁移率族蛋白1(HMGB1)所诱导的炎症反应中的作用。方法:不同浓度HMGB1作用于RAW264.7细胞不同时间后,用ELISA法检测细胞上清液TNF-α水平;分别用免疫荧光法与Western blot法检测HMGB1作用后,RAW264.7细胞NF-κB核转移情况与HSF-1表达。观察干扰HSF-1表达后,HMGB1诱导RAW264.7细胞TNF-α表达的变化。结果:HMGB1作用后,RAW264.7细胞分别在4、12 h出现两次TNF-α分泌高峰,且TNF-α的释放量随HMGB1浓度的增加而增加。HMGB1作用后,RAW264.7细胞的NF-κB核转移明显增强,HSF-1表达明显增加(均P0.05)。干扰HSF-1表达后,HMGB1诱导RAW264.7细胞产生的TNF-α量较未干扰的RAW264.7细胞明显增加(P0.05)。结论:HMGB1能诱导RAW264.7细胞的炎症反应与HSF-1的表达,但HSF-1可能对HMGB1诱导的炎症反应有负反馈性抑制作用。     

高迁移率族蛋白1在内毒素性急性肺损伤大鼠肺血管重构中的作用

目的 评价高迁移率族蛋白1 (HMGB1)在内毒素性急性肺损伤大鼠肺血管重构中的作用.方法 健康清洁级雄性Wistar大鼠30只,体重220 ～ 250 g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为3组(n=10)∶对照组(C组)、内毒素性急性肺损伤模型组(M组)和HMGB1抗体组(H组).C组尾静脉输注生理盐水5 ml/1.5 h;M组输注生理盐水3 ml/1.0h,再输注LPS 2 ml(1 mg/kg)/0.5 h;H组于注射LPS后12、24和36 h时尾静脉注射HMGB1抗体2 mg/kg.于注射LPS后72 h时处死取肺,光镜下观察肺组织病理学结果,采用图像分析软件测量并计算肺小动脉中膜/血管面积百分比,免疫组化法检测肺血管增殖细胞核抗原(PCNA)表达,Western bolt法检测HMGB1表达.结果 与C组比较,M组和H组肺小动脉中膜/血管面积百分比、PCNA和HMGB1表达水平升高(P＜0.05),肺组织急性炎症细胞增多,血管壁明显增厚;与M组比较,H组肺小动脉中膜/血管面积百分比、PCNA和HMGB1表达水平降低(P＜0.05),肺组织急性炎症和血管壁增厚明显减轻.结论 HMGB1可能是诱发内毒素性急性肺损伤大鼠肺血管重构的重要因素.     

雷帕霉素纳米粒对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:观察雷帕霉素( RAPA)聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米微粒(RAPA-PLGA-NPs)对血管平滑肌细胞( VSMCs)增殖的抑制作用.方法:原代培养大鼠VSMCs,并采用α-肌动蛋白免疫组化染色进行鉴定;透射电镜观察VSMCs对RAPA-PLGA-NPs的摄取;分别用MTT法和Western blot法检测RAPA-PLGA-NPs对VSMCs增殖的抑制作用以及RAPA靶蛋白(mTOR)下游蛋白表达的影响,并同时以游离RAPA作为对照.结果:成功培养VSMCs并鉴定;透射电镜显示RAPA-PLGA-NPs可被VSMCs大量摄取于细胞质中;MTT结果显示,RAPA-PLGA-NPs(1,10,100 ng/mL)能浓度依赖性地抑制VSMCs增殖(均P＜0.05),且1 ng/mL的RAPA-PLGA-NPs与10 ng/mL游离RAPA的抑制作用相似(p＞0.05);Western blot结果显示,2个浓度(1,10 ng/mL)的RAPA-PLGA-NPs均能降低VSMCs中S6K1和4E-BP1磷酸化水平,且作用均较游离RAPA( 10 ng/mL)明显.结论:RAPA-PLGA-NPs穿透力强,能迅速被细胞摄取,生物学效应明显强于其游离药物.     

miR-204对TFAM的靶向调控作用及其对乳腺癌细胞生长与增殖的影响

目的:探讨乳腺癌细胞中miR-204对线粒体转录因子A(TFAM)的靶向调控作用及其与细胞生长、增殖的关系。方法:将人乳腺癌MDA-MB-231细胞分别转染mi R-204模拟物或miR-204抑制物,用real-time PCR和Western blot分别检测mi R-204与TFAM蛋白的表达;构建荧光酶报告基因质粒(mut-TFAM/wt-TFAM),将其与mi R-204模拟物或miR-204抑制物共转染MDA-MB-231细胞后检测荧光酶活性变化;构建pc DNA3.1/TFAM质粒,将其单独或与mi R-204模拟物共转染MDA-MB-231细胞后检测TFAM蛋白表达,并用MTT法和Brd U法检测细胞生长与增殖情况。结果:MDA-MB-231细胞转染mi R-204模拟物后mi R-204的表达明显升高,而TFAM蛋白表达明显降低,转染miR-204抑制物后则呈反向变化(均P0.05)。wt-TFAM与mi R-204模拟物共转染时荧光酶活性明显下降,与mi R-204抑制物共转染时荧光酶活性明显升高(均P0.05)。转染pc DNA3.1/TFAM后,MDA-MB-231细胞的TFAM m RNA及蛋白表达量明显上调,细胞生长与增殖能力明显升高(均P0.05);mi R-204模拟物后,MDA-MB-231细胞在TFAM表达降低的同时,细胞生长与增殖能力明显降低,而与pc DNA3.1/TFAM共转染后其上述作用均被部分抵消(均P0.05)。结论:mi R-204能靶向抑制乳腺癌细胞TFAM的表达,从而抑制乳腺癌细胞的生长与增殖。     

血管平滑肌细胞在糖尿病血管病变中的作用

糖尿病血管病变是常见的糖尿病并发症之一,可危及全身各个器官,是糖尿病患者死亡的重要原因。目前常规治疗手段对严重的糖尿病血管病变的效果有限。血管平滑肌细胞(VSMC)在糖尿病血管病变的进程中发挥重要作用,因此,通过调控VSMC来逆转糖尿病血管病变有广泛的应用前景。笔者就VSMC的生物学特征及其在糖尿病中的表型转换特点与VSMC调控应用于糖尿病的治疗策略进行综述。     

人大隐静脉平滑肌细胞体外培养及其生长特性分析

目的：探讨人血管平滑肌细胞（VSMC）体外培养方法及其生长的特性。 方法：采用组织块贴壁结合酶消化法培养人大隐静脉VSMC并传代,以形态学观察、免疫荧光染色法、考马斯亮蓝染色法鉴定细胞;以台盼蓝染色法、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、绘制生长曲线、划痕法测定细胞成活率、增殖及迁移能力。 结果：原代培养5~7 d细胞从组织块爬出,传代细胞呈“峰-谷”样生长;胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;考马斯亮蓝染色可见VSMC细胞骨架呈致密束状;传代细胞成活率为97%;生长曲线呈类“S”形;细胞生长3~6 d内光密度值变化明显;无血清培养的VSMC在24 h内划痕宽度变化显著。 结论：体外培养的VSMC纯度高,结构、功能良好,为收缩表型,细胞生长第3~6天增殖活力较强,24 h内迁移能力最强。     

大隐静脉源性血管平滑肌细胞表型转化的研究进展

血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化是血管重塑的细胞学基础。收缩表型和合成表型VSMCs反映不同的功能,且两者之间可相互转化。笔者就大隐静脉源性VSMCs表型转化的概念及特点、表型标记物、细胞增殖和迁移,以及基质金属蛋白酶及其抑制物、细胞凋亡、表观遗传学与其表型转化的关系等研究进展进行归纳叙述,旨在为寻找防治静脉曲张相关的药物作用靶点提供理论基础。     

缺血对兔血管平滑肌的损伤作用

研究兔断肢血管平滑肌组织中钙、镁离子含量及线粒体形态的变化与术后血循环危象的关系。方法:用原子吸收光谱分光光度计测定血管平滑肌组织中钙、镁离子的含量。用图像分析仪定量分析线粒体的结构变化。结果:缺血时间超过8小时,血管平滑肌组织中钙离子含量明显升高(P<0.01);线粒体明显受损。结论:血管平滑肌组织中钙离子增高在血循危象的发生中起着重要作用。