基于转录组测序的脓毒症小鼠脾脏差异表达基因分析

目的:研究脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠脾脏中mRNA表达变化及特征，寻找影响脓毒症病理生理进程的信号通路。方法:将50只小鼠分成LPS组和Sham组，每组25只，比较两组小鼠存活率及血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β水平。提取脾脏中mRNA，利用转录组测序技术测定基因表达量，随后通过两种富集方法分析:寻找差异表达基因(P< 0.05, |log2FoldChange| ≥1)进行GO和KEGG分析以及在GSEA v4.0.1软件中富集P < 0.05，Q < 0.25的基因。RT-qPCR验证10个显著差异表达基因。结果: LPS成功构建脓毒症模型，表现出严重炎症反应和高死亡率。LPS组对比Sham组显著改变的差异表达基因有1 616个，其中下调基因919个，上调基因697个。富集分析涉及多条炎症反应、调控遗传信息、参与信号转导和细胞过程的通路。RT-qPCR验证结果显示10个基因表达趋势与测序结果一致。结论:胞质DNA传感途径可能在脓毒症病理过程中起着重要作用，Zbp1、Ddx58、Cxcl10、Polr1d可能是其发挥功能的重要靶点。     

脂多糖诱导的小胶质细胞长链非编码RNA表达

[目的]分析脂多糖诱导小胶质细胞中炎症相关的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)表达。[方法]将小鼠小胶质细胞(BV2)样本随机分为两组,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 1ug/ml处理24 h后细胞组为LPS组,未做LPS干预细胞为对照组。通过生物信息学分析后,实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR)进一步验证LPS诱导后BV2的lncRNA与炎症的关系。[结果]在高通量测序中选取炎症相关差异表达明显的9个lncRNA,qPCR验证后发现AC005899.1、GPATCH8、VPS41与高通量测序中的表达趋势一致。[结论]多个lncRNA可能参与体外小胶质细胞的炎症反应过程。这些结果为小胶质细胞通过lncRNA参与神经病理性疼痛提供相关信息。     

大鼠肠巨噬细胞肿瘤坏死因子蛋白质和基因表达规律及不同药物影响的研究

我们通过体外分离和培养大鼠肠巨噬细胞 ,研究肠巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子 (TNF) α的规律 ,特别是在脂多糖(LPS)刺激下TNF αmRNA表达及地塞米松 (DEX)、TNF α单克隆抗体对LPS诱导的肠巨噬细胞TNF α分泌及TNF αmRNA表达产生的影响 ,以进一步明确肠道巨噬细胞在肠道屏障功能中的地位以及在机体全身和肠道局部炎症反应中的作用。一、材料和方法1.材料 :雄性SD大鼠 ,体重 2 2 0～2 5 0g ,由大连医科大学实验动物中心提供 ;胶原酶IV (CollagenaseIV )和LPS(Sigma公司 ) ;RNA提取试剂盒、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )…     

高通量测序应用于PCOS患者卵泡液外泌体lncRNA表达谱分析

目的研究多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵泡液外泌体内差异lncRNA的表达,探究差异表达lncRNA的分子功能及代谢途径和信号通路。方法收集2018年1～12月于苏北人民医院生殖中心就诊的56例不孕患者卵泡液并记录相关临床资料。其中PCOS导致的不孕患者为PCOS组(n=28),输卵管不通导致的非PCOS不孕患者为对照组(n=28)。利用超高速离心法分离卵泡液外泌体,透射电子显微镜(TEM)观察其大小和形态,纳米颗粒跟踪分析(NTA)以及Western Blot鉴定分离获得的外泌体,提取外泌体总RNA。随机选取两组各3份卵泡液外泌体RNA进行lncRNA高通量测序,鉴定差异lncRNA并进行GO富集和KEGG通路等生物信息学分析,选取6个差异基因通过RT-qPCR验证测序结果。结果两组患者的年龄、总孕酮、雌激素(E_2)、FSH、获卵数、可移植胚胎数等均无显著差异(P0.05);体重指数(BMI)、LH和窦卵泡数均存在显著差异(P0.05)。外泌体RNA测序结果显示,PCOS患者外泌体共检测到1 866个差异表达lncRNA基因,其中1 253个基因表达上调,613个基因表达下调。GO富集和KEGG通路分析表明,差异lncRNA主要富集于组织细胞成分或生物发生等生物学过程,以及卵母细胞减数分裂和胰岛素抵抗等信号通路。RT-qPCR验证差异lncRNA基因的表达结果与测序一致。结论 PCOS患者外泌体中lncRNA存在差异表达,提示lncRNA在PCOS的发病中发挥一定作用。     

补骨脂素诱导BMSCs成骨分化中的LncRNA表达谱分析

目的观察补骨脂诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中长链非编码RNA(lncRNA)的表达谱及相关靶基因和信号通路。方法取P2代BMSCs分为三组:空白组(含10%FBS的L-DMEM)、成骨诱导组(含10%FBS及成骨诱导剂的L-DMEM)、补骨脂素组(含10%FBS的L-DMEM及10μmol/L补骨脂素),同一环境不同诱导条件干预21 d;利用Agilent lncRNA芯片筛选出成骨诱导分化过程中表达差异2倍以上的lncRNA,并通过荧光定量PCR对芯片结果进行验证。选取筛选结果中表达差异较大的lncRNA进行GO和KEGG分析。结果成骨诱导分化21 d后持续表达超过2倍的lncRNA共有446个差异表达的lncRNAs。在BMSCs成骨分化过程中,共筛选出5个lncRNA显著上调,4个lncRNA显著下调。其中XR009483上调最显著,而XR007366下调最显著,经PCR验证与芯片结果相符。经GO分析富集度较高的为骨及软骨发育、干细胞分化等生物进程,以及胶原合成、骨化和钙化等生物功能。KEGG分析主要富集于15个生物学通路,其中富集评分较高的是TGF-beta、Wnt、NF-kappa B及Calcium等生物学通路。结论补骨脂素诱导BMSCs成骨分化过程中lncRNA表达谱发生显著变化,提示差异表达的lncRNA可能与BMSCs成骨分化密切相关,为研究补骨脂素促BMSCs成骨分化机制奠定了一定基础。     

通过转录组测序和生物信息学方法鉴别小胶质细胞炎症激活过程中的关键通路和基因

目的通过转录组测序和生物信息学分析, 探究小胶质细胞炎症激活的关键通路和基因。方法使用质量浓度为1 μg/ml的脂多糖对小胶质细胞进行刺激, 建立小胶质细胞炎症模型。使用ELISA法和RT-qPCR检测小胶质细胞炎症模型IL-6和TNF-α水平。对建立的小胶质细胞炎症模型进行转录组测序, 采用生物信息学方法筛选出差异表达基因。对差异表达基因进行GO分析和KEGG分析。使用String数据库构建差异表达基因的蛋白互作网络, 并使用Cytoscape软件进行蛋白互作网络的可视化。使用MCODE应用程序提取蛋白互作网络的模块, 使用cytohubba应用程序提取枢纽基因。采用RT-qPCR验证枢纽基因的mRNA表达水平。对枢纽基因进行富集分析, 预测其靶向miRNA, 预测可能与其作用的药物。结果经ELISA和RT-qPCR检验, 小胶质细胞炎症模型建立成功。通过转录组测序和生物信息学分析, 筛选出434个差异表达基因。GO分析显示这些差异表达基因主要集中在细胞对细胞因子刺激的反应、炎症反应、对外界刺激反应的调节等条目。KEGG分析显示这些差异表达基因主要集中在趋化因子信号通路、TNF信号通...     

甲状腺癌非编码RNA与mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控网络分析

目的:通过生物信息学方法分析甲状腺癌预后相关的非编码RNA与mRNA及信号通路。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中下载568例甲状腺癌患者的临床信息及其组织样本的非编码RNA(lncRNA、miRNA)与mRNA数据,筛选出差异表达的非编码RNA与mRNA,对差异表达的mRNA进行功能富集分析与通路分析;构建lncRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络;结合临床信息进行生存分析获取与甲状腺癌预后相关的非编码RNA与mRNA。结果:共筛选出差异表达的lncRNA 497个(上调93个,下调404个),miRNA 72个(上调5个,下调67个),mRNA 1 097个(上调233个,下调864个)。功能富集分析结果显示差异表达的mRNA主要参与单组织过程、单组织细胞过程、刺激反应等生物学过程,受体结合、分子功能调节、钙离子调节等细胞功能以及细胞、细胞膜、细胞外组件等细胞构成过程。通路分析结果显示差异表达的mRNA主要参与神经反应受体-配体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤转录失调等信号通路的调节。构建的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA互作网络中,有2个差异表达lncRNA(MIR181A2HG、OPCML-IT1),1个差异表达miRNA(miRNA-184)和2个差异表达mRNA(E2F1、SALL3)与甲状腺癌的总体生存期明显有关(均P0.05)。结论:所筛选的非编码RNA与mRNA以及相关信号通路在甲状腺癌的预后密切相关,并为甲状腺癌发生、发展机制的研究提供了新的方向。     

中波紫外线诱导的提前衰老成纤维细胞中环状RNA的表达及分析

目的:对于中波紫外线诱导的提前衰老的人类真皮成纤维细胞(UVB stress induced premature senescence,UVB-SIPS),笔者使用基因芯片筛选了其中环状RNA的表达谱。方法:构建UVB-SIPS模型;采用β-gal染色、细胞周期、CCK8(cell counting kit)检测衰老成纤维细胞;基因芯片技术筛选差异表达的环状RNA;聚合酶链式反应验证相关环状RNA;利用Clusterprofiler r package,对上下调基因分别进行KEGG和GO的富集分析。结果:与对照组比较(差异表达倍数≥1.5,P0.05),共有472个差异表达的环状RNA,其中228个环状RNA上调,244个环状RNA下调。在472个差异表达的环状RNA中随机选择了8个环状RNA进行聚合酶链式反应。其中有5个环状RNA(hsa_circ RNA_100797,hsa_circ RNA_100686,hsa_circ RNA_400036,hsa_circ RNA_101755,hsa_circ RNA_003794)与基因芯片的结果一致。GO分析显示,UVB-SIPS组细胞中差异表达的环状RNA亲本基因与细胞对紫外线辐射的反应、DNA修复复合物、有丝分裂、微管蛋白结合等注释条目有关;KEGG分析显示,UVB-SIPS组细胞与未处理组细胞相比,差异表达的环状RNA的亲本基因可能参与与衰老相关的细胞周期、p53信号通路、PPAR信号通路等的调节。结论:本研究初步揭示了提前衰老的人类真皮成纤维细胞中环状RNA的表达,可为未来研究光老化发生机制奠定基础。     

肠型胃癌组织异常表达miRNAs的鉴定

目的 筛选肠型胃癌组织异常表达的miRNAs.方法 采用miRCURYTM基因芯片(v.14.0)分析6例肠型胃癌组织和邻近非肿瘤组织之间差异表达的miRNA,设定平均上升或下降倍数大于2倍和P值小于0.01为显著性差异标准;选取部分基因芯片分析中呈异常表达的miRNAs,采用实时荧光定量PCR( RT-qPCR)方法在29例肠型胃癌组织和邻近非肿瘤组织中进一步检测,并对两者结果进行相关性分析.结果 基因芯片结果显示,40个miRNAs呈显著表达上调,其中24个基因已证实在胃癌癌组织中表达升高;36个miRNAs呈显著表达下调,其中19个已报道在胃癌组织中异常表达降低.用RT-qPCR检测6个在基因芯片分析中表达上调的miRNAs和5个在基因芯片分析中表达下调的miRNAs,结果与基因芯片分析结果相一致,两种方法分析的结果呈高度正相关(P＜0.o1).结论 该研究鉴定了肠型胃癌组织中一系列新的异常表达的miRNAs,为进一步研究提供了基础.     

增殖期婴儿血管瘤mRNA表达谱分析及信号网络构建

目的:分析增殖期婴儿血管瘤(IH)mRNA表达谱,并构建增殖期婴儿血管瘤调控的信号通路网络。方法:收集2017年3月—2017年9月西安交通大学第二附属医院小儿外科手术治疗的9例IH患儿手术切除标本,依据分期不同分为增生期组(n=5)和消退期组(n=4),病例均经病理确诊,比较两组mRNA表达谱差异,分析两组差异基因的GO(Gene Ontology)以及两组主要差异基因信号通路变化。结果:通过GO富集分析得出差异基因在基因的分子功能(MF),参与的生物过程(BP)和所处于的细胞组成(CC)三大类信息中的分布,成功构建GO富集功能图;通过KEGG数据库进行Pathway注释,筛选出差异基因、靶基因富集的显著性信号通路,根据信号通路间的关联关系成功构建Pathway之间的信号转导网络。结论:基因芯片方法检测增殖期和消退期mRNA表达谱可成功筛选差异基因,GO富集分析、KEGG数据库注释等生物信息学方法可通过差异基因筛选出显著性信号调控通路,并构建信号转导网络。     

长链非编码RNA在青少年特发性脊柱侧凸中的表达研究

背景：长链非编码RNA（lncRNAs）是真核细胞中一类长度超过200核苷酸的非编码RNA分子,与人类众多疾病的发生有密切的关系。然而,lncRNAs在青少年特发性脊柱侧凸（AIS）的表达情况尚不清楚。目的：利用基因芯片筛选AIS患者外周血中差异表达的lncRNAs和mRNAs,分析lncRNAs在AIS发病中的可能作用。方法：选取2013年北京协和医院就诊的20例AIS患者和20例正常对照。利用Agilent human lncRNA＋mRNAArray V3.0微阵列芯片检测4例AIS患者和4例年龄匹配的正常对照的lncRNAs和mRNAs表达,对差异表达的mRNAs进行GO、Pathway分析,构建lncRNAs和mRNAs的共表达网络,预测lncRNAs的可能调控靶点。结果：AIS患者中差异表达的lncRNAs有139条,差异表达的mRNAs有546条。GO分析发现,差异表达的mRNAs产物主要参与蛋白结合、金属离子结合、核苷酸结合、调节转录、RNA剪切等。差异表达的mRNAs主要参与细胞黏附分子、Wnt通路、Toll样受体通路、MAPK通路等。靶基因预测,7条lncRNAs可能通过调节mRNAs的表达参与了AIS的发病。结论：本研究发现了AIS患者外周血中差异表达的lncRNAs和mRNAs。lncRNAs可能通过调控mRNA的表达参与AIS的发病或发展。     

Different long non-coding RNA expression profiles in diabetes and diabetic nephropathy mice kidney

Objective To find the differentially expressed long non-coding RNA (lncRNA) between db/db mice that with nephropathy (DN) or not (DM). Methods In this study, 3 DM db/db mice and 2 DN db/db mice proven by renal biopsy were randomly selected, and 3 healthy db/m mice as normal control group. Then, differentially expressed lncRNAs, mRNAs and their fragments per kilobase million (FPKM) in kidney samples were detected by high-throughput next generation sequencing technology. Sequencing data were analyzed to filter out the differentially expressed lncRNA, and their function was preliminarily investigated by bioinformatics analysis and functional enrichment analysis to predict their target genes. Total RNAs of kidneys from these 8 mice were extracted to run real time PCR (RT-qPCR) for verifying the outcomes of the high-throughput sequencing. Results The urinary microalbumin/creatinine ratio (UACR), serum creatinine, and glomerular basement membrane thickness of DN db/db mice were higher than those of DM db/db mice (all P＜0.05), while there was not significant difference in glucose between DM and DN mice. Totally 160 lncRNAs were up-regulated and 99 lncRNAs were down-regulated in kidneys of DN mice compared with those of DM mice, in which the differentially expressed lncRNAs with FPKM value≥2 and differential expression≥1 fold between groups were screened and verified by RT-qPCR. Finally three lncRNAs whose variation trend were consistent with the outcomes of the high-throughput sequencing were obtained. Conclusion There was a significantly different expression pattern of lncRNA between the kidneys of DN and DM mice, which may be involved in the progress of DN．     

醛固酮瘤中长链非编码RNA的差异表达及功能分析

目的研究在醛间酮瘤中有差异表达的长链非编码RNA (Long non-coding RNA,lncRNA)并初步分析后者在醛同酮瘤发生发展中的作用。方法通过基因芯片筛选醛固酮瘤中瘤体相对于瘤旁有差异表达的lncRN A,通过分析得出目标lncRN A,并使用RT-qPCR对目标lncRNA的表达情况进行验证,初步分析该目标lncRNA可能具有的功能。结果经过基因芯片筛选及分析后,得出两条目标lnCRNA——NR_040090、T065445。经过RT-qPCIR验证可知二者在瘤体中表达均为上调,与基因芯片结果一致。经过lncRNA与mRNA共表达分析以及联合分析可知,NR_040090可能与醛固酮合成相关;T065445则既可参与醛固酮合成,也可能介导肾上腺细胞增生从而形成肿瘤。结论 lncRNA——NR_040090、T065445在醛固酮瘤瘤体中表达上调,前者可能与醛固酮瘤中醛固酮过量合成相关,后者可能与醛固酮合成异常及肿瘤形成相关。     

The association between lncRNA LINC01296 and the clinical characteristics in neuroblastoma

BackgroundNeuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in childhood. In this work, the clinical value of long noncoding RNA LINC01296 was evaluated in patients with neuroblastoma.MethodsLncRNA microarray was conducted to identify differentially expressed lncRNAs in 5 early stage and 5 advanced stage tumor tissues of neuroblastoma. RT-qPCR was carried out to validate the result of microarray. Clinical information was reviewed to analyze the relationship between lncRNA and clinical characteristics. The public database R2 was used to analyze prognosis.Results765 differentially expressed lncRNAs were identified. LINC01296 was the most overexpressed lncRNA in advanced stage patients. RT-qPCR was conducted in 28 tumor tissues, confirming the tendency with microarray. Higher expression of LINC01296 was associated with age > 18 months (p = 0.004) and advanced stage (p = 0.021). Furthermore, LINC01296 was correlated with tumor size (r = 0.4060, p = 0.0321), LDH level (r = 0.6904, p = 0.0002), and NSE level (r = 0.5772, p = 0.0013). The neuroblastoma dataset shows patients with overexpression of LINC01296 obtained a shorter overall survival than low expression (n = 88, log-rank: P < 0.0001).ConclusionLINC01296 is associated with clinical characteristics of neuroblastoma and may function as a prognostic predictor.Level of evidenceII.     

基于生物信息学的胰腺导管腺癌预后风险长链非编码RNA筛选

目的:应用生物信息学方法筛选胰腺导管腺癌的预后风险长链非编码RNA(lncRNA)。方法:从癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库下载胰腺导管腺癌患者的RNA-seq Level 2数据及其临床信息。根据NCBI Gene数据库及GENCODE v7数据库的基因注释信息,将下载的mRNA和lncRNA测序数据进行重新注释。然后应用R软件的edgeR包和limma包筛选差异表达的mRNA和lncRNA,并对它们进行相关性分析,进而获得lncRNA-mRNA有统计学意义的共表达关系对,并将其中的mRNA定义为lncRNA的靶基因。通过R软件clusterProfiler包对lncRNA的靶基因进行功能富集分析,以推测lncRNA的生物学功能。最后,绘制差异表达lncRNA的Kaplan-Meier曲线,筛选出与胰腺导管腺癌预后风险相关的lncRNA。结果:经过基因重新注释,共得到19 791个mRNA和1 623个lncRNA的测序数据,随后共筛选得到260个差异表达的mRNA和15个差异表达的lncRNA。经过相关性分析,共得到包括5个lncRNA和24个mRNA在内的24个有统计学意义的共表达关系对。其中lncRNA LINC00857有6个靶基因,分别为C1orf116、ESRP1、GPRC5A、LIPH、MAL2和PLS1。根据lncRNA靶基因的功能富集分析,推测LINC00857主要富集于磷脂酶活性、细胞骨架结构组成和脂肪酶活性。生存分析发现,CASC8和LINC00857与胰腺导管腺癌的预后风险明显有关(P=0.0052、P=0.027)。结论:CASC8和LINC00857可能是胰腺导管腺癌的预后风险lncRNA,有望在今后的研究中成为胰腺导管腺癌新的预后监测指标。     

奥沙利铂介导的长链非编码RNA XLOC-0000008调控微小RNA-142-3p/高迁移率族蛋白B1信号通路促进结直肠癌细胞自噬和耐药性的机制

目的探讨结直肠癌(CRC)中长链非编码RNA(lncRNA)XLOC-0000008调控微小RNA(microRNA,miR)-142-3p/高迁移率族蛋白B1(HMGB1)信号通路参与奥沙利铂促进细胞自噬的过程及其可能分子机制。方法采用奥沙利铂处理CRC细胞株HT29及HCT116(购自美国典型菌种保藏中心)进行芯片实验,奥沙利铂处理组为实验组,无奥沙利铂组为对照组,生信分析差异表达的lncRNAs及miRNAs;采用膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙锭双染流式细胞术检测CRC细胞凋亡;采用方法检测CRC细胞株中HMGB1蛋白及自噬相关蛋白的表达。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测细胞系中HMGB1 mRNA的表达水平;采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的生存率,两组计量资料的比较采用t检验或方差分析。结果奥沙利铂实验组HT29及HCT116细胞中XLOC-0000008的表达水平升高,且miR-142-3p的表达水平下降;随着奥沙利铂浓度增加细胞自噬活性增强,实验组自噬调控因子HMGB1在胞浆和胞外上清中表达均高于对照组(P<0.01);实验组HMGB1 mRNA表达高于对照组(P<0.01);与单独敲降HMGB1或单独奥沙利铂处理相比,奥沙利铂处理稳定敲降HMGB1的CRC细胞中p62蛋白水平低于对照组,且对奥沙利铂的敏感性显著增加(P<0.01),差异有统计学意义。结论CRC对于化疗药奥沙利铂抵抗可能由HMGB1诱导细胞自噬而引起,这一过程可能通过调控XLOC-0000008/miR-142-3p/HMGB1轴而实现。