拉伸应变和加载时间对人牙周膜成纤维细胞IL-1β分泌量的影响

研究拉伸应变和加载时间对体外培养人牙周膜成纤维细胞（PDLF）的白细胞介素-1β（IL-1β）分泌量的影响，将原代，传代培养成功的PDLF制备成实验用细胞，分为5组（n=3)，而后分别置于特制的加力装置上拉伸加载，加力至拉伸应变量分别为0%，8%，12%，16%和20%，加力时间为24，48，72h。用双抗ELISA法分析IL-1β的含量。结果表明，8%，12%和16%拉伸应变组IL-1β的分泌量随着加力时间和力值的增加而递增；在各个时间组，IL-1β分泌量在16%应变值外达到最高值；20%拉伸应变组，加力24h和48h,IL-1β分泌量明显高于0%应变组，与12%和16%应变组相比已开始下降，加力72h,IL-1β分泌量大幅度下降，已低于对应的0%应变组，在细胞生理应变承受范围内，静态机械拉伸应变能促进人牙周膜成纤维细胞IL-1β的分泌，但刺激效应随着加力时间的增加而减少。     

尼古丁对人牙周膜成纤维细胞超微结构及分泌细胞因子的影响

 [摘 要] 目的:探讨尼古丁对牙周膜成纤维细胞（PDLFs）形貌、超微结构、增殖、细胞周期和细胞因子生成的影响。方法:用原子力显微镜及透射电镜观察尼古丁作用PDLFs后的细胞形貌及超微结构;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期与凋亡率;ELISA法检测培养上清细胞因子碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子I（IGF-I）、转化生长因子 β1（TGF-β1）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）和血管内皮生长因子（VEGF）水平。结果:尼古丁作用于PDLFs后,细胞固缩,出现大量空泡,水肿,胞核固缩崩解,粗面内质网扩张成池,线粒体嵴扩张;细胞增殖受抑制,呈时间和浓度依赖性;细胞G0/G1期比例增高,G2期和S期比例下降,凋亡率增高,周期阻滞和凋亡率随尼古丁浓度递增而增加;尼古丁作用后,PDLFs分泌bFGF和IGF-I水平下降,ICAM-1、VCAM-1、TGF-β1及VEGF水平均上升。结论: 尼古丁使PDLFs形貌及超微结构出现凋亡改变,并抑制其增殖。尼古丁可能通过调控细胞因子的分泌水平影响PDLFs的修复功能。     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙周膜细胞的作用

背景：碱性成纤维细胞生长因子是具有多功能的细胞生长因子,对来源于中胚层及神经外胚层的细胞有明显的促进增殖作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙周膜细胞的作用。 方法：将第5代人牙周膜细胞,以1×108 L-1的浓度分别接种到96孔板,随机分成4组,分别加入含0,1,10,100 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养。在第1,3,5,7天测定细胞的增殖情况,在第1,7天检测碱性磷酸酶活性。 结果与结论：4组之间人牙周膜细胞增殖情况的差异有显著性意义(F=6.586,P=0.024),随着碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增大,吸光度值均增大,其中100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组的吸光度值均大于其他组(P < 0.05);碱性成纤维细胞生长因子各组的碱性磷酸酶活性均低于对照组(P=0.000),浓度越大,活性越低(P < 0.05)。结果显示碱性成纤维细胞生长因子在1-100 μg/L范围内质量浓度越高,促进人牙周膜细胞增殖和抑制碱性磷酸酶活性的作用越强。     

QLT0267抑制整合素连接激酶对人皮肤成纤维细胞生物学特征的影响

目的 观察不同浓度的QLT0267抑制整合素连接激酶(ILK)的活性对成纤维细胞(Fb)生物学特征的影响.方法 收集整形手术后剩余的皮肤标本,采用机械法加酶消化法分离培养Fb,随机分为空白对照组、5 nM组、10 nM组、20 nM组、30 nM组、DMSO组,其中空白对照组常规培养不做任何处理,5 nM组、10 nM组、20 nM组、30 nM组按培养基中QLT0267浓度分别为5、10、20、30 nmol/L加入QLT0267溶液[二甲基亚酮(DMSO)为溶剂],DMSO组加入与30 nM组中QLT0267溶液同体积的DMSO,分组处理12、24、48、72 h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态.CellTiter试剂盒检测分组处理24、48、72 h后各组Fb的增殖情况,并与空白对照组比较计算增殖抑制率;在48 h时间点,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况以及Western Blot法观察Fb表达磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、总蛋白激酶B(tAKT)蛋白的变化.对数据进行LDS-t检验和重复测量设计方差分析检验.结果 经浓度大于10 nmol/L的ILK特异性抑制剂作用下,Fb膨胀,细胞核固缩或破碎,并出现细胞凋亡,随QLT0267浓度的增高和刺激时间的延长,细胞形态的改变更加明显.CellTiter试剂盒检测结果显示10 nmol/L以上的QLT0267能明显抑制Fb的增殖,且随着QLT0267浓度的增高和刺激时间的延长,增殖抑制率也升高(F处理组=94.242,P＜0.05;F时间=240.490,P＜0.05;F处理与时间=11.551,P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示与对照组比较,10 nmol/L以上的ILK特异性抑制剂能诱导Fb凋亡,差异有统计学意义(P＜0.05).Western Blot结果显示在各组tAKT的表达组间差异无统计学意义(P＞0.05)的前提下,不同浓度QLT0267组pAKT的表达比空白对照组低,并随着QLT0267浓度的上升而pAKT蛋白生成下降(P＜0.05).结论 10 nmol/L浓度以上ILK特异性抑制剂QLT0267能刺激Fb发生形态改变,抑制细胞增殖和促进细胞凋亡.推测ILK可能通过影响Fb中pAKT的生成参与创面愈合过程的调控.     

力学刺激对角膜成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的研究在体及离体条件下不同力学环境对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bF-GF)表达的影响,探索力学因素在准分子激光原位角膜磨镶术(laser assisted in situ keratomileusis,LASIK)术后角膜损伤修复中的作用。方法建立不同切削量的LASIK手术动物模型,使在体角膜处于不同力学环境中,并于LASIK术后1周和1月处死实验动物提取组织蛋白。此外,采用Flexcell 4 000细胞力学加载系统对原代提取的兔角膜成纤维细胞施加频率为0.1 Hz、拉伸幅度分别为5%、10%和15%的周期性机械拉伸,并于拉伸后6 h和24 h后取细胞培养液上清。采用ELISA方法检测bFGF含量。结果 LASIK术后1周,角膜基质床残余30%组与对照组相比,bFGF含量显著增高(P<0.05);术后1月回落至正常水平,各组之间无显著性差异。不同时间点同一手术方式之间比较发现,仅30%组1周和1月有显著差异(P<0.05)。体外周期性拉伸实验表明拉伸6 h后1,5%拉伸组bFGF含量较对照组显著增高(P<0.05)2,4 h后显著性降低(P<0.05)。结论力学因素参与了早期角膜组织及角膜成纤维细胞bFGF表达的调节,bFGF在LASIK术后角膜组织修复中发挥了一定作用。     

低氧对人胚肺成纤维细胞转化生长因子β1表达的影响

应用核酸原位杂交及增强化学发光免疫斑点法,观察常氧（Ｎ）、低氧（Ｈ）、常氧和低氧猪肺动脉内皮细胞条 件培养液（ＮＥＣＣＭ和 ＨＥＣＣＭ）对人胚肺成纤维细胞转化生长因子β_１（ＴＧＦβ_１） ｍＲＮＡ和蛋白表达的影响。结果表 明：Ｈ组ＴＧＦβ_１ｍＲＮＡ表达为Ｎ组的１．３６倍（Ｐ＜０．０１）,同时在其培养上清液中,ＴＧＦβ_１蛋白含量也明显升高为Ｎ 组的１．８倍。ＨＥＣＣＭ组ＴＧＦβ_１ｍＲＮＡ和蛋白表达较ＮＥＣＣＭ组均下降,ｍＲＮＡ为ＮＥＣＣＭ组的９０％,Ｐ＜０．０１。蛋 白含量为后者的６２．２％。提示：（１）低氧促进入胚肺成纤维细胞合成和分泌ＴＧＦβ_１。（２）在低氧条件下,肺动脉内皮 细胞可能合成某种因子,抑制成纤维细胞ＴＧＦβ_１基因转录和蛋白表达。     

碱性成纤维细胞因子对人肾成纤维细胞的影响

目的:研究碱性成纤维细胞因子(bFGF)对人肾成纤维细胞(KFB)增殖、分泌I型胶原、表达整合素β₁的影响。方法:体外培养KFB, 分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、ELISA法、流式细胞仪检测KFB增殖、I型胶原分泌及整合素β₁表达水平。结果:25-50μg/L的bFGF可明显促进KFB细胞增殖(P<0.05vs对照)及分泌I型胶原(P<0.05vs对照), 同时显著增加KFB整和素β₁的表达(P<0.05vs对照).结论:bFGF可通过对整合素β₁表达的上调来促进KFB增殖及分泌I型胶原, 这可能是bFGF致肾间质纤维化的作用机制。     

周期性张应力下人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

背景：前期研究发现,周期性张应力在一定时间内可以诱导人牙周膜成纤维细胞增殖。 目的：观察周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子的影响;明确JNK、p38MAPK、PI3K信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子过程中的作用。 方法：采用多通道细胞牵张应力加载系统对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别给予周期性张应力刺激1,6,12,24 h,并以未加力组为对照组。对加力12 h的细胞分别添加JNK、p38MAPK、PI3K信号通路特异性抑制剂预处理,并与未加抑制剂的细胞作对比。应用ELISA法检测培养细胞分泌到上清液中的结缔组织生长因子蛋白;应用荧光定量PCR技术检测细胞结缔组织生长因子mRNA的表达。 结果与结论：加载周期性张应力组与对照组相比较,1 h人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子开始增强、6 h表达明显增强,12 h达最高峰值、24 h表达开始下降。加入JNK信号通路特异性抑制剂后,人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子出现下降;而加入p38MAPK信号通路和PI3K信号通路的特异性抑制剂后结缔组织生长因子表达未发生明显改变。提示在一定时间范围内,周期性张应力引起结缔组织生长因子mRNA与蛋白水平的表达与时间呈依赖性升高;其后随着时间的延长,结缔组织生长因子的表达则开始下降。周期性张应力通过JNK通路的介导调控人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

激光免疫测定拉伸应变和加载时间对人牙周膜成纤维细胞形态和骨架的影响

通过体外人工培养人牙周膜成纤维细胞，对其施加不同时间不同值的机械拉仲应力应变，用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光技术观察其结构变化情况，寻求应力应变和时间与细胞形态、骨架的关系。结果发现在应变值为0、0．8％、12％、16％各组，细胞和细胞核投影面积与加力时间和应变值呈正比；细胞骨架随着应变值的增加和加力时闻的延长而逐渐增粗、密度增加，排列更有规律；在应变值20％组，细胞和细胞核投影面积随着加力时间的增加而逐渐减少，细胞骨架结构变得模糊和紊乱，说明在机械拉仲应力应变作用下，人牙周膜成纤维细胞的形态和骨架发生了规律的改变。     

lncRNA TUG1靶向TGF-β/Samds信号通路促人牙周膜成纤维细胞纤维化的作用机制研究

目的:探讨lncRNA TUG1对人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)增殖、迁移、胶原合成的影响及作用机制.方法:对临床采集的健康牙周组织进行HPDLFs分离培养,观察形态学并鉴定细胞纯度.以lncRNA TUG1慢病毒(Lv-lncRNA TUG1)转染HPDLFs后检测lncRNA TUG1的表达水平,以CCK-8、...     

人真皮原代成纤维细胞的培养、鉴定及蛋白酶活性受体的表达

目的探索和建立人真皮原代成纤维细胞培养并鉴定纯度,检测蛋白酶活性受体在该细胞的表达状态。方法用胰酶消化法分离人包皮成纤维细胞并培养人真皮原代成纤维细胞,用免疫细胞化学法鉴定纯度;用RT-PCR、流式细胞分析和免疫细胞化学染色法检测蛋白酶活性受体的表达。结果胰酶消化法成功培养出人真皮原代成纤维细胞,纯度达99%;人真皮成纤维细胞高表达PAR1、PAR3 mRNA及蛋白,微弱表达PAR2 mRNA及蛋白,不表达PAR4 mRNA及蛋白。结论用胰酶消化法成功培养高纯度原代人真皮成纤维细胞;蛋白酶活性受体1、3在人真皮成纤维细胞上高表达,提示可能存在于炎症及损伤修复功能作用,为进一步研究打下基础。     

不同基底静态加载方式对兔肌成纤维细胞(前体)表达α-SMA的影响

目的通过对不同分化阶段的兔肌成纤维细胞及前体施加不同的基底应变刺激,研究此过程中细胞表达α-SMA的时间剂量关系。方法选取异体蛋白植入法获得5 d和7 d的肌成纤维细胞(前体),培养于弹性膜上;利用基底静态拉伸对其分别施以应变从0%～3%和3%～6%的分段载荷及0%～6%的阶跃式载荷。结果 3 d阶段的肌成纤维细胞(前体)没有表达α-SMA;5～7 d阶段可以监测到α-SMA的表达;在10～15 d阶段则表达显著增强(P<0.01)。两种加载方式下,α-SMA的表达量均显著增加;分段加载作用下SMA的表达量更高。结论肌成纤维细胞(前体)α-SMA受基底静态拉伸后表达增加,且对不同的加载方式能做出不同的响应,提示在肌成纤维细胞的分化和愈伤反应过程中,力学因素扮演着十分重要的角色。     

三氧化二砷对皮肤成纤维细胞、中性粒细胞MMPs活性，TIMP-1及TGF-β1表达的影响

目的:砒石是化腐生肌的常用中药,其主要成分是三氧化二砷(As2O3)。本研究通过观察As2O3对基质金属蛋白酶(MMPs)活性、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)及转化生长因子β1(TGF-β1)表达影响,探讨化腐中药能否调节胶原代谢,从而治疗慢性皮肤溃疡。方法:明胶酶谱法检测大鼠中性粒细胞(PMNs)来源的MMP-9活性、人成纤维细胞(hFb)分泌的MMP-1、MMP-2的活性,免疫细胞化学法检测hFb TIMP-1、TGF-β1的表达。结果:As2O3浓度在50mg/L时可以提高大鼠PMNs来源的MMP-9的活性(P<0.01);在0.8mg/L可以提高hFb分泌的MMP-1、MMP-2的活性(分别P<0.01);同时As2O3作用于hFb6h、12h、18h后,TIMP-1、TGF-β1表达持续降低(P<0.01)。结论:As2O3在一定范围内可提高PMNs来源的MMP-9的活性;也可提高hFb分泌的MMP-1、MMP-2的活性,同时抑制hFbTIMP-1、TGF-β1的表达。提示砷类制剂可通过提高多种MMPs的活性,降低TIMP-1的表达从而发挥化腐作用。     

人精子表面整合素亚基α5、β1参与受精过程的研究

目的：研究人精子表面整合素亚基α5、β1在受精过程中的作用。方法：以人精子穿透去透明带金黄地鼠卵异种体外受精试验（SPA）作为检测人精子受精力的手段；分别用抗整合素亚基α5、β1抗体衣整合素特异的配体RGD肽作用于精子后，观察其受精力的改变。结果：用抗整合素亚基α5、β1抗体及RGD肽作用于精子后，受精率、受精指数及粘附指数均下降。结论：人精子表面整合素亚基α5、β1参与受精过程。     

血小板衍化生长因子β对体外人牙周膜细胞增殖分化的影响

背景：牙周支持组织破坏及附着丧失是导致失牙的最主要原因,细胞因子能促进牙周组织再生形成新附着。 目的：观察血小板衍化生长因子β在人牙周膜成纤维细胞增殖过程中的作用。 方法：体外利用组织块法培养人牙周膜成纤维细胞,对传代后细胞进行组织来源鉴定,通过波丝蛋白、角蛋白免疫组化染色进行定性分析,并加入生物因子血小板衍化生长因子β对人牙周膜成纤维细胞进行增殖诱导,采用MTT法测定吸光度值。 结果与结论：加入质量浓度为10 μg/L的血小板衍化生长因子β后,细胞增殖加速,在加入生长因子血小板衍化生长因子β后,实验组的吸光度显著高于对照组,说明血小板衍化生长因子β对人牙周膜成纤维细胞的增殖具有明显的促进作用。     

TGF-β1 shRNA真核表达质粒抑制人肺成纤维细胞TGF-β1的表达

目的:观察构建成功的三个针对人转化生长因子β1(TGF-β1)的小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒抑制人肺成纤维细胞TGF-β1的表达.方法:将真核表达载体psiSTRIKE-RNAi1、psiSTRIKE-RNAi2、psiSTRIKE-RNAi3和对应的阴性对照载体经酶切鉴定和测序分析后,以Lipofectamine2000介导转染人肺成纤维细胞,48小时后应用实时荧光定量PCR检测人肺成纤维细胞TGF-β1 mRNA的表达并用ELISA检测细胞上清液中TGF-β1蛋白质的浓度.结果:重组质粒经酶切和DNA测序证实插入片段的碱基序列与预期设计一致.转染组细胞TGF-β1表达受到明显抑制,以psiSTRIKE-RNAi2的抑制效应最为显著(P＜0.01).结论:三个针对TGF-β1shRNA的重组质粒均能抑制TGF-β1在人肺成纤维细胞中的表达.     

TNF-α对体外培养奶牛乳腺成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达的影响

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)主要来源于活化的巨噬细胞、肥大细胞和T细胞等,参与炎症反应和免疫调节过程,并能够刺激成纤维细胞的增殖过程[1].TNF-α通过与细胞的肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)结合发挥作用,TNFR一般分为TNFR1 (CD120a)和TNFR2 (CD120b)两型.TNFR1分布于多种正常细胞或肿瘤细胞表面,TNFR1被认为是TNF-α的主要受体[2-3].TNF-α能促进人3～4代成纤维细胞增殖,对人皮肤成纤维细胞的增殖也有明显促进作用,并促进其Ⅰ、Ⅲ胶原和糖胺多糖合成[4].     

香烟提取物和脂多糖对人胚肺成纤维细胞TGF-β1 mRNA及蛋白表达的影响

目的 :探讨香烟提取物 (CSE)和脂多糖 (LPS)对体外培养的人胚肺成纤维细胞 (HELF)转化生长因子- β1(TGF - β1)mRNA及其蛋白表达的影响。方法 :应用不同浓度的CSE(1∶5 0、1∶2 5和 1∶10 )、LPS(0 1mg/L、1mg/L和 10mg/L)及CSE(1∶2 5 )与LPS(1mg/L)联合作用于HELF ,37℃作用 2 4h后 ,提取细胞总RNA ,应用逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)及免疫细胞化学技术检测TGF - β1mRNA和蛋白表达的变化。结果 :CSE低浓度 (1∶5 0和 1∶2 5 )时可增加HELFTGF - β1mRNA及蛋白的表达 (P <0 0 5 ) ,高浓度 (1∶10 )时未引起TGF - β1mRNA及蛋白表达增强 (P >0 0 5 )。不同浓度的LPS均引起HELFTGF - β1mRNA及蛋白表达增强 (P <0 0 5 )。CSE与LPS联合作用也可增加HELFTGF - β1mRNA及蛋白的表达 (P <0 0 5 )。结论 :一定浓度的CSE和LPS可上调肺成纤维细胞TGF - β1mRNA及蛋白表达。     

三氧化二砷对皮肤成纤维细胞、中性粒细胞MMPs活性,TIMP-1及TGF-β1表达的影响

目的：砒石是化腐生肌的常用中药，其主要成分是三氧化二砷（As₂O₃）。本研究通过观察As₂O₃对基质金属蛋白酶（MMPs）活性、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）及转化生长因子β₁（TGF-β₁）表达影响，探讨化腐中药能否调节胶原代谢，从而治疗慢性皮肤溃疡。方法:明胶酶谱法检测大鼠中性粒细胞（PMNs）来源的MMP-9活性、人成纤维细胞（hFb）分泌的MMP-1、MMP-2的活性，免疫细胞化学法检测hFb TIMP-1、TGF-β₁的表达。结果:As₂O₃浓度在50 mg/L时可以提高大鼠PMNs来源的MMP-9的活性（P<0.01）；在0.8 mg/L可以提高hFb分泌的MMP-1、MMP-2的活性（分别P<0.01）；同时As₂O₃作用于hFb 6 h、12 h、18 h后，TIMP-1、TGF-β₁表达持续降低（P<0.01）。结论:As₂O₃在一定范围内可提高PMNs来源的MMP-9的活性；也可提高hFb分泌的MMP-1、MMP-2的活性，同时抑制hFbTIMP-1、TGF-β₁的表达。提示砷类制剂可通过提高多种MMPs的活性，降低TIMP-1的表达从而发挥化腐作用。     

人成纤维细胞生长因子-21单克隆抗体的制备及抗原表位的确定

目的 制备小鼠抗人成纤维细胞生长因子(hFGF)-21单克隆抗体(mAb),通过细菌展示确定该mAb的抗原表位.方法 用hFGF-21作为检测和免疫抗原,间接ELISA筛选分泌抗人hFGF-21 mAb的杂交瘤细胞株;用FITC标记该mAb,并克隆hFGF-21的不同片段到展示载体Apex上,通过流式细胞仪筛选其抗原表位.结果 成功筛选出1株抗hFGF-21抗体的细胞株,其分泌抗体重链的亚型为IgG 2b,轻链为Kappa链;该杂交瘤细胞株腹水的效价为1:4.096×106;传30代及液氮中保存3个月,该细胞株能稳定分泌抗hFGF-21 mAb,且效价稳定;Western blot法检测证明该抗体与人FGF-21有很好的特异性;该mAb与小鼠FGF-21有交叉反应;通过流式细胞仪对抗原表位的筛选,该mAb可与hFGF-21下游的第107～121个氨基酸反应.结论 成功的制备出特异性、高稳定性的小鼠抗hFGF-21 mAb,确定了该mAb的抗原表位在第107～121位氨基酸.