骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究现状

脊髓损伤(SCI)显著降低了患者的生存率和生活质量,对患者及社会造成严重的影响,并且传统的药物及手术减压等治疗疗效甚微。随着干细胞治疗研究的深入及再生医学的发展,干细胞移植成为治疗SCI研究的焦点。骨髓间充质干细胞(BMSCs)因其良好的增殖和多向分化能力、取材方便、易于分离培养和自体移植无免疫源性等生物学特性而成为干细胞移植修复SCI的重点研究对象。近年来,随着动物实验及临床试验研究的深入,学者们对BMSCs治疗SCI有了广泛的认识,这为SCI患者带来了新的希望。BMSCs恢复脊髓功能的作用是确切的,但仍有许多难题亟待解决。     

大鼠肝移植术后受体骨髓间充质干细胞输注肝内示踪与标记方法比较

目的 采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescin diacetate succinimidyl ester, CFSE)与溴化脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)两种细胞标记物观测肝移植术后受体骨髓间充质干细胞(MSCs)肝内分布情况.并对两种方法进行比较.方法 在已构建的DA-Lewis大鼠原位肝移植模型及提取培养Lewis大鼠MSCs的基础上分别用CFSE和Brdu对Lewis来源的MSCs进行标记,术中经门静脉输注,通过荧光显微镜和免疫组织化学法观测术后2mo内各时间点受体肝组织内MSCs的分布情况.结果 CFSE细胞标记率约为(94.1±1.4)%.受体肝组织第1、7、14天内有CFSE标记的MSCs聚集.对照组第5天肝组织内发布的CFSE标记MSCs消失.BrdU细胞标记率约为(90.3±3.5)%.受体肝组织第14天、1个月、2个月可见Brdu阳性的MSCs分布,对照组相应时间点肝组织内未发现Brdu阳性的MSCs.结论 CFSE和Brdu均为MSCs的良好标记物.CFSE标记细胞后荧光迅速减弱,适用于短期示踪.Brdu标记细胞后可维持较长时间,适用于长期示踪.两种标记方法均是MSCs较为简单有效的方法,实验显示受体MSCs大部分分布于移植肝脏.     

骨髓间充质干细胞和心肌梗死

近年来冠心病的发病率和死亡率居高不下,探求新的更为理想的治疗心肌梗死的方法,也一直是研究的热门课题,虽然成果显著,但现有的治疗方法,如药物、溶栓、经皮冠脉内成形和支架植入术(PTCA S)以及外科手术等,都有一定的局限性和并发症.     

大鼠骨髓间充质干细胞移植后肝内定居的实验研究

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居分布情况。方法利用密度梯度离心法分离、纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞。取第三代MSCs经CFSE标记后从门静脉植入同种异体正常组和肝损伤组大鼠体内,于移植后的第14d取出的肝脏,通过冰冻切片行荧光检测,研究MSCs在大鼠肝脏内定居分布情况。结果经门静脉移植的MSCs在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居,且定居的细胞数量上肝损伤组明显多于正常组。结论经门静脉移植的MSCs可以定居于肝脏内,且定于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关。     

大鼠骨髓间充质干细胞植入大鼠脑内后的迁移

目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）植入脑内后的存活和迁移性。方法：分离大鼠MSCs体外培养、纯化。Hoechst33342标记后立体定向植入大鼠海马CA4区,1、2、4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;用荧光显微镜观察Hoechst33342阳性细胞。结果：原代、传代细胞贴壁生长,有较强的增殖能力;植入大鼠海马后沿针道及注射区可见多数存活细胞,散在分布,自植入区及针道向周围逐渐减少。结论：大鼠MSCs植入大鼠脑内后能够存活并具有向周围组织迁移的能力。     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑出血实验研究

目的 观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植后,对大鼠脑出血模型脑组织损伤的修复作用.方法 制备大鼠脑出血模型,随机分为两组,实验组在脑出血部位附近注入MSCs,对照组注入生理盐水.采用Menzies量表进行神经功能缺损评分.应用组织学检查,观察脑损伤部位的病理变化.结果...     

自体骨髓间充质干细胞介入移植治疗脑梗死临床研究

目的:观察应用自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)介入移植治疗脑梗死的临床疗效和安全性。方法:选择脑梗死患者120例,随机分为干细胞移植组和对照组各60例。对照组给予常规药物治疗,治疗组在常规药物治疗基础上给予重组人粒细胞集落刺激因子150μg皮下注射,待血常规白细胞升高达30×109/L左右后可抽取自体骨髓200 ml。自体骨髓经干细胞分离试剂盒处理获取间充质干细胞。采用自体骨髓间充质干细胞进行干细胞介入移植术,将间充质干细胞超选入脑病变供血动脉。于治疗前、治疗后1个月、6个月进行神经功能FIM评分,应用国际通用的功能独立性评定量表评定其运动和认知能力。结果:120例患者全部进入结果分析,移植组治疗后1个月、6个月功能独立性评定量表评分显著高于对照组,两组比较差异有统计学意义(P<0.01),两组均无不良反应发生。结论:BMSCs移植可以一定程度地改善脑梗死患者症状,提高脑梗死患者的运动和认知功能,自体骨髓干细胞移植是安全有效的。     

增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞移植对帕金森病大鼠模型的治疗作用

目的 探讨骨髓问充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对帕金森病(Parkinson's disease,PD)大鼠的疗效及其在脑内存活、迁徙、分化规律.方法 将造模成功的PD大鼠随机分为两组,将增强型绿色荧光蛋白(en-hanced green fluorescent protein,EGFP)标记的MSCs及PBS分别移植入两组PD模型纹状体.术后每周进行旋转试验,第1周和第9周行脑神经元特异性核蛋白(Neun)、胶质细胞源性蛋白(GFAP)及酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化鉴定,第9周行Western blot检测两组模型纹状体内TH的表达.结果 移植前MSC组及PBS组旋转次数分别为(8.2±0.6)、(8.3±0.6)圈/min,差异无统计学意义(P>0.05);术后第3周分别为(7.5±0.5)、(8.1±0.6)圈/min,差异有统计学意义(P<0.05),并持续至术后第9周.移植后第1周MSCs主要分布于针道附近.第9周则迁徙至两侧大脑半球,以移植侧半球为主.最远迁徙至胼胝体的末端.小脑及脑于未见移植细胞.全脑未见畸胎瘤的形成.术后第1周免疫组化染色仅见GFAP和Neun表达.第9周GFAP、Neun仍有表达,以GFAP居多,同时在纹状体内还可见少量TH表达,提示MSCs在脑内主要分化为胶质细胞.部分为神经元.少数分化为多巴胺能神经元(dopaminergic neuron.DN).PBS组免疫组化染色未见上述蛋白的表达.Western blot检测仅MSCs组大鼠纹状体有TH的表达.结论 MSCs移植入纹状体后可分化为DN,从而改善PD症状,其移植治疗PD大鼠模型可能是安全有效的.     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离和培养扩增的方法。研究MSCs的生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定MSCs生长曲线；并应用流式细胞术测定细胞周期和表面标记物。结果MSCs体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力，接种10h后贴壁率为96％以上；细胞周期显示有91．4％处于G0／Gl期；培养的MSCs阳性表达CD29、CD44，阴性表达CD34、CD45。结论在实验条件下，体外培养8代以前的MSCs生长稳定，增殖较快，细胞周期表现出较早期细胞特点，可作为组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠溃疡性结肠炎的修复

目的：观察移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）对溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠病变的修复.方法：分离培养、荧光标记SD大鼠BMSCs.A,B,C组大鼠制作UC模型,D组为非模型组.4组大鼠均经尾静脉注射1 mL液体：A组为生理盐水;B,D组为BMSCs;C组为加表皮生长因子（EGF）的BMSCs.移植后3,7,14 d各处死5只大鼠,荧光显微镜下观察荧光标记BMSCs在结肠的分布,光镜观察结肠病变以及TNF-α和IL-10的表达.结果：移植第3日各组均可见BMSCs分布于结肠黏膜,病灶处多于正常结肠黏膜.移植第14日,B,C组结肠BMSCs高于D组（P〈0.05）;与A组比较,B,C组结肠黏膜高表达IL-10,低表达TNF-α,其黏膜损伤修复程度也明显优于A组.B,C组间差异不明显（P〉0.05）.结论：移植BMSCs可促进UC大鼠结肠损伤的修复.单次给予EGF不能促进BMSCs向病灶的迁移和损伤的修复.     

间充质干细胞的免疫调节功能

间充质干细胞(MSC)在支持造血细胞的成熟、分化和生存方面具有重要作用.最近研究发现,MSC具有免疫调节作用,能抑制树突状细胞(DC)成熟,并通过细胞-细胞接触的机制,抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤细胞(NK细胞)的功能,在自身免疫性疾病及肿瘤细胞免疫逃逸中至关重要.现正尝试将MSC用于抗急性移植物抗宿主病(aGVHD)及自身免疫性疾病的治疗.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的 观察体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs，观察其生长规律及光镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快，细胞接种后1～2d为滞留期，3d后达对数生长期，第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CI）44，不表达CD45；光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形，核居中，有1～2个核仁。结论 培养的细胞为骨髓MSCs；在体外培养条件下细胞生长性状稳定，可作为组织工程的种子细胞。     

DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

目的:研究随着时间延长,DAPI标记间充质干细胞(MSCs)的标记率变化。方法:分离培养纯化成年大鼠骨髓MSCs,DAPI标记,不同时点荧光显微镜观察,计算MSCs中DAPI阳性率。将标记的MSCs移植到缺血下肢模型动物骨骼肌中,不同时点取材,冰冻切片,观察移植细胞。结果:标记当天,荧光镜下MSCs胞核呈明亮蓝色荧光,标记率接近100%,随着培养时间延长,标记率逐渐下降。移植1周和2周组织切片中,可见密集移植MSCs,3周以后,可检出的DAPI阳性细胞明显减少。结论:DAPI短期标记细胞效率很高,但标记率随着时间延长而迅速下降。     

脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较

目的建立分离培养人脐带间充质干细胞（UCMSCs）和脐带血间充质干细胞（UCBMSCs）的方法,并比较其效果。方法无菌条件下采集健康足月新生儿脐带及脐血各30份,分别通过原代贴壁培养法、酶消化法培养UCMSCs,及淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步分离法获得脐血中单个核细胞培养UCBMSCs。应用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基,比较UCMSCs和UCBMSCs分离培养的效果与生长形态。流式细胞术检测其表面标志及诱导分化鉴定其分化能力。结果UCMSCs原代贴壁培养法8d左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出且成簇生长,酶消化法培养UCMSCs5d左右均匀生长;UCBMSCs分离培养用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法得到的细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多。两种来源MSCs培养方法相比较,UCMSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高。流式细胞仪检测两种来源的MSCs具有MSCs表面标志特征。定向诱导分化结果表明MSCs具有被诱导为成骨细胞、脂肪细胞的分化能力。结论人脐带来源间充质干细胞原代培养周期短,培养效率更高;脐血间充质干细胞的分离方法中羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法效率更高。     

D-半乳糖诱导间充质干细胞衰老的研究

目的 利用D-半乳糖诱导建立间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外衰老模型,并探讨其潜在机制。方法 以正常培养的MSCs做对照组,以分别用1、10、100g/L D-半乳糖诱导的MSCs作为处理组,培养48h后,采用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测细胞内AKT与mTOR蛋白磷酸化水平以及衰老相关蛋白p16^Ink4a的变化。同时使用β-半乳糖苷酶试剂盒检测MSCs中β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）表达量的变化。最后用AKT抑制剂预处理D-半乳糖诱导组以明确AKT/mTOR信号通路在MSCs衰老中的作用。结果 与对照组相比,10g/L D-半乳糖作用48h后MSCs中β-半乳糖苷酶表达和衰老相关蛋白p16^Ink4a含量明显增加,同时p-AKT与p-mTOR含量也较对照组增加,加入AKT抑制剂后,衰老组β-半乳糖苷酶表达和衰老相关蛋白p16^Ink4a含量皆有所下降。结论 D-半乳糖能成功诱导构建MSCs体外衰老模型,AKT/mTOR信号通路参与了这一过程。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及表型和功能特点

目的 建立体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，探讨其表型和功能特点。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，测定生长曲线，通过形态学观察，细胞化学及免疫细胞化学法分析大鼠骨髓MSCs的表型和功能特点。结果 MSCs属骨髓中单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L-DMEM中，1、3、5代细胞生长曲线基本相同，增殖快，每传代一次细胞约增加2．2倍。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)。加入地塞米松(Dex 10^-8mol／L)、β-甘油磷酸钠(β-GP 10mmol／L)、抗坏血酸(AA50μg／ml)可诱导MSCs分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增高，形成矿化结节。结论 所分离、培养的细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点，建立了体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法。     

骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞是一群均一的细胞，具有自身的增殖特征及组织化学特征．它在适宜的微环境中能分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和星状神经细胞等，它易于分离、扩增，易于外源基因导入表达，有望成为细胞治疗和基因治疗的新型靶细胞，具有广阔的应用前景。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离培养方法，并对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法：分离5～8周龄的大鼠股骨骨髓进行体外培养，取5代以后的MSCs观察形态特征，绘制生长曲线，进行细胞化学染色，并用流式细胞仪检测其表面标志和进行细胞周期分析。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形或多边形，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为30h，细胞化学染色显示碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POX)、苏丹黑B(SB)阴性，而*醋酸萘酚醋酶(α-NAE)与糖原(PAS)阳性，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90表达阳性，而CD34、CD38、CD45表达阴性；细胞周期分析显示，G0／G1期：79．48％，G2／M期：6．10％，S期：14．42％。结论：本方法分离纯化出的是MSCs，其在体外具有生长稳定，增殖较快的特点，是组织工程研究中良好的细胞来源，也是转基因研究优良的载体细胞。     

两种培养方法在猪自体骨髓间充质干细胞培养的比较研究

目的 比较应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法.方法 取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状.结果 直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高.体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强.     

间充质干细胞的免疫学特点及其应用

目的：探讨间充质干细胞的免疫学特点及其在医学上的应用。方法：肝脏移植术后免疫排斥反应较严重,患者一般须严格服用免疫抑制剂。本实验以肝脏移植为例,研究M SC的免疫学特点。首先分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞及普通造血干细胞,并建立两组大鼠肝脏移植后急性排斥反应的模型,分为实验组和对照组,实验组给予间充质干细胞培养的肝脏组织移植,对照组接受普通干细胞培养的肝脏组织移植。两组模型均给以半剂量的免疫抑制剂,观察实验组的M SC能否减轻其免疫反应,并与未加入M SC的对照组作对比。结果：实验组仍无明显免疫排斥反应,术后1周饮食及精神状况良好,生存质量与正常健康大鼠无明显差异。表明增强机体的免疫耐受,减弱免疫排斥反应。对照组除总胆红素含量外,其他各项指标均有不同程度偏高。实验组存活率高达91．7％,而对照组仅33．3％。结论：间充质干细胞具有低免疫原性,并可诱导机体免疫耐受能力,临床上可在器官移植等疾病上推广应用。