白木香内生真菌的分离鉴定及诱导结香作用研究

目的 分离、纯化经通体结香技术诱导的白木香木质部真菌,筛选能够高效促进白木香产生优质沉香的菌株。方法 采用组织块分离法分离、纯化菌株,通过形态学特征结合内转录间隔区（ITS）序列分析鉴定真菌;将真菌菌液接种到白木香树4个月后进行功能验证;依据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版沉香项下薄层色谱、浸出物含量测定、沉香四醇含量测定及特征图谱方法分析菌株诱导效果。结果 从白木香木质部中分离出48株真菌,优势菌株为镰刀菌;经刺盘孢菌属（Colletotrichum sp.）、黑曲霉Aspergillus niger、渐进绿木霉Trichoderma paraviridescens诱导的沉香薄层色谱斑点与对照药材一致;经镰刀菌属（Fusarium sp.）、黑曲霉、渐进绿木霉诱导的沉香浸出物质量分数均大于10%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）;经可可毛二孢菌Lasiodiplodia theobromae、黑曲霉、渐进绿木霉等6株菌诱导的沉香特征图谱与对照药材一致,沉香四醇质量分数均大于0.1%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。结论 从白木香木质部分离出的内生真菌可诱导沉香形成,其中黑曲霉和渐进绿木霉能够较快速诱导白木香结香,结香所得的树脂品质符合《中国药典》2020年版标准。     

镰刀菌诱导结香对白木香叶内生真菌分布和群落构成的影响研究

为了研究沉香形成前后白木香叶组织中内生真菌的分布和群落构成,采用石蜡永久制片法观察白木香叶组织显微结构,细胞化学法确定内生真菌的分布。通过改良的CTAB法对白木香进行总DNA提取,利用真核生物通用引物同时对植物和内生真菌rDNA ITS序列进行PCR扩增,构建内生真菌rDNA ITS文库,RFLP分析和序列测定,用PUAP软件进行系统发育分析,构建最大简约树。结果表明：镰刀菌诱导结香前后,白木香内生真菌菌丝主要分布于海绵组织和韧皮部,结香后韧皮部内生真菌菌丝相对丰度明显增大;茎点霉是未结香白木香叶内生真菌优势种群,刺盘孢菌是已结香白木香叶内生真菌优势种群;刺盘孢菌是未结香和已结香白木香唯一共有内生真菌,且丰度差异较大。不依赖分离培养的分子生物学方法可快速直观地用于植物组织内生真菌的鉴定。白木香叶内生真菌具有一定的遗传多样性,沉香形成前后白木香内生真菌群落构成差异较大。     

铁皮石斛根腐病病原菌鉴定及生物学特性研究

目的:分离和鉴定铁皮石斛根腐病病原菌,测定碳、氮源、温度、pH及光照等条件对根腐病病菌菌丝生长和产孢的影响,以期掌握其生物学特性,为该病害的田间防治提供理论依据。方法:将采回的典型病株进行分离鉴定,同时对其生物学特性进行测定。结果:引起铁皮石斛根腐病的病原菌为镰刀菌属真菌;该菌最适生长温度为30℃;最适pH为7;最适碳源是葡萄糖和蔗糖;菌落生长最适氮源为硝酸钠和硝酸钾,产孢最适氮源为硝酸钠;全黑暗条件能促进菌丝生长和孢子的产生;孢子致死温度为58℃、10 min。结论:引起铁皮石斛根腐病的病原菌为接骨木镰刀菌Fusarium sambucium。     

木香根腐病病原菌鉴定及生物学特性研究

目的:分离和鉴定木香根腐病的病原菌,探讨不同培养基、碳氮源、温度、pH等条件对根腐病病原菌产孢和菌丝生长的影响,以期掌握生物学特性,为该病的田间防治提供理论依据。方法:通过病原菌形态学观察,结合rDNA-ITS测序,在Genbank中经Blast搜索相似性序列,以ITS序列经MEGA 6.0程序构建其分子系统发育树,确定引起木香根腐病的病原菌15b为镰刀菌属真菌Fusarium oxysporum f.sp.ciceris isolate。结果:菌株15b最适菌丝生长的培养基为PDA,生长最适碳、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨,最适温度为25℃,最适pH值为6;产孢最适碳、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨,最适温度为30℃,最适pH值为7;光照对菌丝生长发育没有明显影响,但24 h黑暗条件有利于促进孢子产生;菌丝致死温度为61℃、10 min。结论:Fusarium oxysporum f.sp.ciceris isolate是引起木香根腐病的致病菌。     

真菌诱导白木香产生沉香的野外实验与分析

 目的 采用野外小规模实验和室内分析相结合的方法验证3株真菌YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导白木香产生沉香的可行性。方法 采用真菌诱导法诱导白木香产生沉香,利用气相-质谱联用技术（GC-MS）对诱导结香材料挥发油成分中的化合物进行检测,通过比对诱导材料高频菌与原接入菌的形态及核糖体基因内部转录间隔区序列（internal transcribed spacer,ITS）一致性来验证接入菌的有效性。结果 3株真菌定植于白木香6个月,YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导产生材料的重量分别为（1.786±0.473）,（2.964±0.492）和（3.615±0.591） g,高于空白对照（1.325±0.407） g和阴性对照（1.462±0.417） g。GC-MS检测到3株活性真菌诱导材料含有代表沉香品质的主要化学成分倍半萜类化合物和色原酮类似物。菌种验证结果表明,3株活性真菌在诱导材料中为优势菌,分别占分离菌种的90.0%,97.5%和91.25%。结论 利用3株活性真菌诱导白木香产生沉香可以应用于实际生产,是可持续、高效生产沉香的良好方法。     

稻黑孢霉A8及其诱导的人工沉香次生代谢产物分析

目的:分析稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)A8及其诱导的人工沉香次生代谢产物。方法:三氯甲烷萃取白木香内生真菌及其诱导的人工沉香,气相-质谱联用法(GC-MS)分析代谢产物,自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)结合保留指数(RI)法鉴定挥发性成分。结果:N.oryzae A8发酵液共检出58个色谱峰,鉴定其中30种化合物,检出相对含量最高的化合物是β-苯乙醇;N.oryzae A8人工诱导白木香生产的3批沉香药材共鉴定出38种化合物,主要为倍半萜类、芳香族类、2-(2-苯乙基)色酮类等沉香特征性成分。结论:N.oryzae A8发酵液可高效诱导白木香结香,其次生代谢产物可能参与沉香形成过程。     

诱导白木香产生沉香真菌的固体培养条件优化

 目的 对诱导白木香产生沉香的3株活性真菌的固体培养条件进行优化,为该类真菌的推广应用提供参考。方法 采用真菌固体培养方法,对影响真菌生长的营养和培养条件等因子进行优化,实验结果采用单因素方差分析法。结果 得到了培养3株活性真菌的最佳固体培养基配方,获得了真菌固体生长的最适温度、pH值、装料量、基质含水量和光照条件。结论 在实验得到的最佳条件下,能够较快的培养出高质量的固体菌种;为3株活性真菌诱导白木香产生沉香的生产推广提供了菌种培养的优化条件。     

一株拟青霉菌(Paecilomyces sp.)的次生代谢产物研究

目的:通过对一株拟青霉菌(Paecilomyces sp.)的研究获得活性次生代谢产物。方法:利用固体大米培养基对该株拟青霉菌(Paecilomyces sp.)进行发酵培养,利用硅胶、凝胶柱层析法以及高效液相色谱等技术对该株真菌的次生代谢产物进行研究。通过质谱和核磁共振等现代波谱分析方法对其结构进行了鉴定。结果:共分离得到4个次生代谢产物,分别为:Cerebroside C(1)、Cerebroside D(2)、2-Hydroxybenzyl alcohol(3)、2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol(4)。结论:以上4个化合物均为首次从该株真菌中分离得到。     

水母雪莲内生真菌Alterraria sp.的次级代谢产物鉴定

目的:研究藏族药水母雪莲内生真菌Alterraria sp.的次级代谢产物。方法:从植物水母雪莲中分离得到内生菌Alterraria sp.,在考察培养条件后,对该菌种进行了扩大培养。运用反复硅胶柱色谱,LH-20凝胶柱色谱、开放ODS柱色谱、高效液相色谱等方法,并结合液质联用分析技术,对菌液的总萃取物进行分离纯化;并根据化合物的理化常数测定及光谱学(1D和2D NMR,MS等)数据分析鉴定所得化合物结构。结果:对水母雪莲中分离得到的内生真菌交链孢菌属Alterraria sp.进行次级代谢产物的研究,共得到9个化合物,分别鉴定为spirotryprostatin A(1),对羟基苯甲醛(2),4-羟基苯基-2’-羟基丙酯(3),二氢对甲氧基肉桂酸(4),4-甲氧基苯甲酸(5),对羟基苯乙酸甲酯(6),4-羟基苯乙醇(7),对羟基苯甲酸(8),3-苯基丙酸(9)。细胞毒测试结果表明,从TPXa中分离得到的化合物1对肺癌细胞株A549具有较强的增殖抑制活性,其IC50为2.0 mg·L-1。结论:以上化合物均为首次从交链孢菌属真菌中分离得到。     

促进拟南芥生长的西红花内生真菌的筛选和研究

目的:以西红花内生真菌为研究对象,通过内生真菌与拟南芥共培养体系,分析其对拟南芥生长的影响,筛选具有促生作用的目标菌株,为揭示内生真菌影响植物生长及机制提供实验基础和科学依据。方法:分离西红花内生菌并与拟南芥共培养,统计拟南芥鲜重、干重、侧根数和主根长、根部显微结构等指标,筛选促生菌株;对其rDNA-ITS基因序列进行系统发育分析鉴定。结果:从西红花中分离32株内生菌,筛选得到5株促进拟南芥生长的内生菌;分别鉴定为Penicillium sp.、Hansfordia sp.、Chaetomium murorum、Aspergillus sp.、Phialocephala sp.。结论:西红花内生真菌通过改变拟南芥根部结构,促进侧根萌发,从而有效地促进生长,增加其生物量。